宏基因組二代測(cè)序技術(shù)對(duì)腹部創(chuàng)傷合并腹腔感染的診斷價(jià)值

鄧云烜,丁威威,劉寶晨,楊 超,解廷斌

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)普通外科研究所,南京 210000

腹腔感染(intra-abdominal infection,IAI)是腹部創(chuàng)傷治療中的關(guān)鍵問(wèn)題,其挑戰(zhàn)性來(lái)源于病原體的多樣性、耐藥性增加以及患者的復(fù)雜生理反應(yīng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),IAI是腹部創(chuàng)傷患者晚期死亡的主要原因[2],因此早期診斷與干預(yù)有助于改善患者預(yù)后。

IAI患者通常會(huì)接受預(yù)防性或治療性的抗生素使用,腹腔及血液樣本中的病原體數(shù)量往往偏低,因此直接涂片鏡檢不適用;其次,由于許多病原體的抗原存在變異,缺乏特異性的檢測(cè)抗體對(duì)其進(jìn)行識(shí)別,血清學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用有限[3];而分子生物學(xué)診斷方法雖然可從基因水平上對(duì)病原體進(jìn)行鑒定,但由于腹腔感染的病原體種類繁多且構(gòu)成不確定,預(yù)設(shè)感染病原體進(jìn)行驗(yàn)證性診斷無(wú)法確保診斷的全面性,因此適用性不強(qiáng)[4]?，F(xiàn)階段,臨床應(yīng)用最為廣泛的仍然是微生物培養(yǎng)方法,也是感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn),培養(yǎng)得到的菌株可以進(jìn)行生化反應(yīng)、藥敏試驗(yàn)等進(jìn)一步分析,為臨床提供有價(jià)值的信息,但培養(yǎng)方法的周期長(zhǎng),且受限于樣本質(zhì)量(微生物數(shù)量及類別),陽(yáng)性率往往偏低。因此,亟需一種不依賴于微生物表型的檢驗(yàn)技術(shù)以提高病原體診斷效率。

近年來(lái),宏基因組二代測(cè)序(meta-genomic next-generation sequencing,mNGS)作為新興的微生物鑒定和傳染病診斷技術(shù),以其快速、高效、無(wú)偏檢測(cè)微生物的優(yōu)勢(shì),已廣泛應(yīng)用于臨床感染性疾病的診療[5]。在符合推薦適應(yīng)證的情況下,mNGS對(duì)不同感染性疾病的診斷價(jià)值存在差異[6],但其在腹部創(chuàng)傷合并IAI的診療中仍具有較大潛在價(jià)值。因此,本研究旨在描述mNGS對(duì)腹部創(chuàng)傷合并IAI診療的影響并評(píng)估其臨床診斷價(jià)值。

資料與方法

1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究回顧分析2020年8月—2022年4月收住南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院普通外科ICU的腹部創(chuàng)傷疑似合并IAI的患者110例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲的腹部創(chuàng)傷患者,簡(jiǎn)明損傷定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(abbreviated injury scale,AIS)評(píng)分≥3分;(2)根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查診斷為疑似/存在IAI,且病情較危重,符合《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》(下文簡(jiǎn)稱共識(shí))[7]中所推薦的臨床適應(yīng)證;(3)樣本:通過(guò)局部穿刺、手術(shù)或腹腔引流管留取腹腔引流液(peritoneal drainage,PD)樣本,同時(shí)留取外周靜脈血樣本;(4)檢測(cè)方法:同時(shí)進(jìn)行血液及PD微生物培養(yǎng)與mNGS。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)病例資料缺失;(2)合并嚴(yán)重顱腦損傷(頭部AIS評(píng)分≥3分)。疑似IAI診斷標(biāo)準(zhǔn):病史、查體、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查及穿刺等[8]。確診依賴于陽(yáng)性病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果。收集患者的人口學(xué)資料及臨床基線參數(shù),包括損傷情況、感染診斷、血液炎癥指標(biāo)、mNGS和微生物培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果以及治療調(diào)整情況。患者均已簽署知情同意書,本研究已通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020NZKY-011-01)。

2 樣本檢測(cè)

收集的標(biāo)本在采集后4h內(nèi)送至臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物培養(yǎng)。將同時(shí)留取的另一份標(biāo)本置于干冰保存進(jìn)行mNGS檢測(cè)。使用QIAamp DNA微量試劑盒(凱杰,希爾登,德國(guó))從樣本中提取DNA,然后以QIAseq超低輸入文庫(kù)試劑盒(Illumina,加利福尼亞州,美國(guó))構(gòu)建DNA文庫(kù);使用Qubit(賽默飛世爾,馬薩諸塞州,美國(guó))和安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技,馬薩諸塞州,美國(guó))評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量,高質(zhì)量文庫(kù)在NextSeq 500平臺(tái)(Illumina,加利福尼亞州,美國(guó))上進(jìn)行循環(huán)測(cè)序,每個(gè)循環(huán)均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。之后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,去除較短或低質(zhì)量的序列,并與人類參考基因數(shù)據(jù)庫(kù)(hg38)對(duì)比后,進(jìn)一步過(guò)濾人源DNA,最終剩余的序列與美國(guó)國(guó)家生物信息中心微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes)進(jìn)行比對(duì)。

3 感染性病原體的定義

感染性病原體為文獻(xiàn)報(bào)道的具有致病性的微生物,并且致病特點(diǎn)與臨床癥狀相符,并排除污染。由于病毒和支原體不是常見(jiàn)的IAI病原體,本研究不包括mNGS檢測(cè)到的病毒和支原體。如果測(cè)定細(xì)菌或真菌滿足以下mNGS閾值之一,則判定為陽(yáng)性:(1)細(xì)菌或真菌的相對(duì)豐度>30%;(2)組織病理學(xué)檢查和(或)微生物培養(yǎng)陽(yáng)性;(3)血液及PD均檢測(cè)到符合致病特點(diǎn)的病原體;(4)單種細(xì)菌>50個(gè)特異序列,單種真菌>1個(gè)特異序列。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 患者納入及臨床資料

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn),共有43例嚴(yán)重腹部創(chuàng)傷存在/疑似合并IAI患者納入研究,其中4例因臨床資料不完整被排除,2例因存在嚴(yán)重顱腦損傷被排除,最終納入37例。根據(jù)微生物培養(yǎng)以及mNGS檢測(cè)結(jié)果,最終確診IAI患者32例,非IAI患者5例(圖1)。患者的人口學(xué)及臨床資料比較見(jiàn)表 1。IAI組中,患者的損傷嚴(yán)重程度較高,ISS為19(14,27)分,取檢時(shí)間為13(7,24)d,感染原因的前三位依次為腸瘺(n=11)、腹腔殘余感染(n=10)及胰腺周圍組織感染(n=7)。IAI組與非IAI組相比,取檢時(shí)間更長(zhǎng),APACHE II評(píng)分更高,ICU住院時(shí)間更長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

SICU:外科重癥監(jiān)護(hù)室;AIS:簡(jiǎn)明損傷定級(jí)標(biāo)準(zhǔn);PD:腹腔引流液;IAI:腹腔感染

表1 納入患者的人口學(xué)及臨床資料比較[M(P25,P75),n]

2 不同檢測(cè)方法的診斷效能比較

筆者對(duì)四種檢測(cè)方法的診斷性能進(jìn)行評(píng)估,包括PD微生物培養(yǎng)、PD mNGS、血液微生物培養(yǎng)及血液mNGS。對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間,mNGS較微生物培養(yǎng)顯著縮短(22.0hvs.61.5h,P<0.05),見(jiàn)圖2。在診斷IAI方面,PD mNGS顯示出較高的靈敏度及陰性預(yù)測(cè)值(均為1.000),微生物培養(yǎng)僅為0.343及0.192,但PD mNGS特異度(0.600)及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(0.941)低于PD微生物培養(yǎng),特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2),兩種方法診斷IAI的受試者工作曲線(receiver operating curve,ROC)的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.800及0.672(P<0.05),見(jiàn)圖3。血液微生物培養(yǎng)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及特異度均為1.000,陰性預(yù)測(cè)值為0.147,靈敏度為0.094。血液mNGS的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.964,診斷特異度為0.800,與血液微生物培養(yǎng)無(wú)明顯差異(P>0.05);陰性預(yù)測(cè)值為0.444,靈敏度為0.843,均高于血液微生物培養(yǎng)方法,其中靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩種方法診斷IAI的ROC的AUC分別為0.822及0.547(P<0.05)。

mNGS:宏基因組二代測(cè)序;****P<0.001

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因組二代測(cè)序;IAI:腹腔感染;ROC:受試者工作曲線

表2 不同檢測(cè)方法對(duì)IAI診斷效能的比較(95%CI)

3 IAI患者的病原學(xué)結(jié)果分析

對(duì)32例確診IAI患者的微生物培養(yǎng)及mNGS檢出病原體進(jìn)行分析,血液及PD mNGS病原體的檢出率分別為75.0%(24/32)及90.6%(29/32),均顯著高于微生物培養(yǎng)。且檢出病原體類別多于微生物培養(yǎng),去除對(duì)IAI意義不明的病毒以及支原體后,共檢出革蘭氏陰性菌36種,革蘭氏陽(yáng)性菌11種,真菌10種,檢出率前三的革蘭氏陰性菌依次為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌及大腸埃希菌,檢出率最高的革蘭氏陽(yáng)性菌為腸球菌屬,真菌為念珠菌屬。在兩種樣本中,mNGS對(duì)各病原體的檢出率均高于或等于培養(yǎng)方法,血液樣本中,肺炎克雷伯菌差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PD樣本中,肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因組二代測(cè)序

根據(jù)陽(yáng)性病原體的診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,確定可能的致病微生物構(gòu)成,mNGS對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的檢出率為46.9%(15/32),對(duì)真菌的檢出率為43.8%(14/32),對(duì)多病原體的混合感染檢出率為84.4%(27/32),均顯著高于微生物培養(yǎng)方法(28.1%,P<0.05)。見(jiàn)圖5。

mNGS:宏基因組二代測(cè)序;*P<0.05,***P=0.001

4 mNGS代表性病例

在病例3中,患者PD呈現(xiàn)明顯膿性,mNGS結(jié)果中星座鏈球菌未達(dá)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),棲牙普雷沃菌為口腔定植菌,無(wú)引起IAI相關(guān)報(bào)道。因此,PD微生物培養(yǎng)更符合患者病史及臨床表現(xiàn),mNGS出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果可能與取檢不規(guī)范或不一致有關(guān)。在病例32中,患者存在發(fā)熱及腹腔積液,PD及血液mNGS均檢出大量厭氧菌,并非IAI常見(jiàn)致病菌,同時(shí),正常人血液中含有少量厭氧菌核酸,因此判斷患者并非IAI。在病例37中,PD mNGS顯示存在多種病原體,其中只有銅綠假單胞菌相對(duì)豐度>30.0%,血液mNGS檢出的鳥(niǎo)腸球菌特異序列數(shù)偏低,同時(shí)由于患者胰周感染嚴(yán)重,因此認(rèn)為銅綠假單胞菌及屎腸球菌為責(zé)任微生物。

在病例15中,患者腹部術(shù)后反復(fù)高熱,且存在高位脊柱損傷,自主呼吸無(wú)力,疑似感染源為腹腔及呼吸系統(tǒng),進(jìn)行血液及PD mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),血液中存在鮑曼不動(dòng)桿菌,PD中存在序列數(shù)較少的腸道細(xì)菌,后續(xù)肺泡灌洗液微生物培養(yǎng)也提示存在大量鮑曼不動(dòng)桿菌,因此排除IAI,針對(duì)肺部感染強(qiáng)化治療。在病例18中,患者為腹部受擊后不明原因引起的腹膜后膿腫,術(shù)中PD及外周血mNGS提示存在大量魚腥味錐形桿菌,查閱資料知該菌為口腔致病菌,產(chǎn)硫化氫,與術(shù)中膿腔大量惡臭膿液相符,進(jìn)一步檢查患者口腔發(fā)現(xiàn)存在較多齲齒且入院前一周有過(guò)高熱,因此推斷患者為免疫低下致血行感染而繼發(fā)后腹膜血腫感染。見(jiàn)表3。

表3 部分代表性病例病原學(xué)信息

討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂和免疫機(jī)能下降,隨著病原體暴露風(fēng)險(xiǎn)的增加,感染發(fā)生率較高[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì),腹部創(chuàng)傷患者晚期死亡的主要原因?yàn)镮AI[1]。因此,對(duì)感染早期識(shí)別與針對(duì)性治療,對(duì)改善患者的預(yù)后至關(guān)重要,同時(shí)凸顯了病原體鑒定技術(shù)在感染診療中的關(guān)鍵作用。

在目前臨床常用的微生物檢測(cè)方法中,血清學(xué)檢驗(yàn)存在交叉反應(yīng)和抗原變異的問(wèn)題,熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)需要預(yù)設(shè)病原體類別進(jìn)行篩選,涂片鏡檢則缺乏特異性。因此,微生物培養(yǎng)仍然是IAI臨床診療中應(yīng)用最廣泛的微生物分離鑒定技術(shù),但存在陽(yáng)性率低、時(shí)效性差等問(wèn)題[10],限制了抗生素的合理使用。

本研究顯示,與微生物培養(yǎng)相比,mNGS的結(jié)果反饋時(shí)間短,診斷時(shí)效性更強(qiáng)。同時(shí),mNGS受預(yù)先抗生素使用的影響較小,對(duì)IAI的識(shí)別能力顯著優(yōu)于微生物培養(yǎng)。此外,mNGS識(shí)別病原體的種類及數(shù)目顯著多于微生物培養(yǎng),與本研究結(jié)果一致,其無(wú)偏檢測(cè)病原體的特性使其對(duì)混合感染的識(shí)別能力較強(qiáng)[5],其中真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌等類別病原體的檢出對(duì)指導(dǎo)抗生素使用具有重要價(jià)值。

既往研究顯示,臨床血液微生物培養(yǎng)陽(yáng)性百分比呈下降趨勢(shì),陽(yáng)性率最低至9.9%[11],本研究中血液微生物培養(yǎng)陽(yáng)性率僅為9.4%(3/32),這可能是由于大部分患者已預(yù)先使用廣譜抗生素,降低了血液中病原體的數(shù)量。Miao等[12]發(fā)現(xiàn)抗生素使用對(duì)mNGS結(jié)果影響較小,表明致病微生物的核酸可在患者血液中留存更長(zhǎng)的時(shí)間。在本研究中,血液mNGS顯示出更高的陽(yáng)性率(28/32,87.5%)和較好的診斷性能,在預(yù)先抗生素使用的情況下,即便是常規(guī)容易微生物培養(yǎng)的病原體,mNGS仍然具有更強(qiáng)的檢測(cè)能力。因此,對(duì)于抗生素使用時(shí)間較長(zhǎng)的感染患者,mNGS是一種較為理想的選擇。

雖然PD和血液mNGS均顯示出較高的診斷靈敏度,但mNGS的結(jié)果解讀仍然存在困難[7]。在IAI中,多病原體及罕見(jiàn)病原體的檢出十分普遍,如何判斷它們對(duì)感染的貢獻(xiàn)是目前該技術(shù)臨床應(yīng)用的一大難點(diǎn)[5,7]。2021年一項(xiàng)多中心回顧性隊(duì)列研究顯示,82例血液mNGS陽(yáng)性率雖達(dá)到61%,但僅在7.3%的病例中產(chǎn)生了積極影響。說(shuō)明當(dāng)檢出結(jié)果不足以對(duì)現(xiàn)有治療產(chǎn)生影響,以及無(wú)法完全明確檢出結(jié)果是否疾病驅(qū)動(dòng)因素時(shí),該技術(shù)的臨床價(jià)值有限[6]。2021年初發(fā)布的中國(guó)專家共識(shí)也指出了這一問(wèn)題,并對(duì)相關(guān)概念、適應(yīng)證及檢測(cè)流程進(jìn)行了規(guī)范,但因?qū)嶒?yàn)室及疾病差異,并未對(duì)陽(yáng)性閾值做出明確推薦[7],因此仍需要更多元的研究進(jìn)一步積累相關(guān)數(shù)據(jù)。共識(shí)也指出,對(duì)于核酸提取破壁困難的如真菌(如曲霉菌、毛霉菌、隱球菌等),即使特異序列數(shù)較少也應(yīng)當(dāng)考慮為致病菌,并進(jìn)行三方驗(yàn)證[7]。本研究中對(duì)于多病原體同時(shí)存在的情況,依據(jù)文獻(xiàn)中較多使用的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)相對(duì)豐度低(<30%)、特異序列數(shù)少(<50個(gè))、臨床致病性不明確及潛在污染病原體(如表皮葡萄球菌、部分單胞菌屬等)予以去除[13],同時(shí)針對(duì)本中心患者病程特點(diǎn),將真菌陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了放寬(>1個(gè)特異序列數(shù))。目前有部分研究通過(guò)微生物引起的特異性免疫反應(yīng)與細(xì)胞因子變化,或是代謝物分析、生物信息學(xué)分析和微生物組分析來(lái)探究致病微生物所引起的特異性改變,以區(qū)分致病與定植、污染微生物,提高診斷準(zhǔn)確性,但尚需要相關(guān)的臨床研究來(lái)表明其實(shí)際區(qū)分能力[14-15]。

由于病情及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的差異,目前對(duì)mNGS臨床獲益的研究結(jié)果不一[6,16]。在本研究中,將病原體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估篩選后,對(duì)現(xiàn)有抗生素抗菌譜覆蓋不足的病例進(jìn)行了調(diào)整;但對(duì)于檢出窄譜病原體的病例,考慮到治療風(fēng)險(xiǎn),在患者感染源及感染癥狀未充分控制前,并未進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。而對(duì)于醫(yī)院常見(jiàn)病原體的檢出,在綜合患者病史、臨床表現(xiàn)及抗感染治療反應(yīng)等信息后,筆者對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行了推斷,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不同抗菌活性抗生素的調(diào)整。雖然目前部分mNGS報(bào)告中增加了對(duì)耐藥基因信息的描述,但基因定位和表型存在等問(wèn)題尚未完全解決,因此僅能作為參考,具體推斷仍需結(jié)合臨床。

本研究也存在一些不足。首先,微生物培養(yǎng)和mNGS都缺乏客觀的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定檢測(cè)到的致病微生物是來(lái)自感染、定殖還是污染,而是依賴于臨床醫(yī)師的主觀判斷,這在結(jié)果解釋性上存在不足。其次,研究沒(méi)有在基因水平上用額外的分子方法進(jìn)行驗(yàn)證。第三,研究為單中心回顧性研究,數(shù)據(jù)有限且積累不受研究者控制而存在偏倚。

本研究顯示,對(duì)于腹部創(chuàng)傷合并IAI的患者,mNGS的總體診斷性能優(yōu)于微生物培養(yǎng)方法,且在診斷混合感染及罕見(jiàn)病原體感染方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),隨著技術(shù)的成熟與成本的降低,有望改變現(xiàn)有IAI的診療范式,促進(jìn)個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。未來(lái)需進(jìn)一步的前瞻性研究表明mNGS的臨床價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)聲明：鄧云烜:研究構(gòu)思及設(shè)計(jì)、文獻(xiàn)調(diào)研;數(shù)據(jù)收集、整理、分析及文章撰寫;丁威威、劉寶晨:研究構(gòu)思及設(shè)計(jì);楊超:文章修改和審查;解廷斌:結(jié)果解釋