不同扭結(jié)方向秦艽中環(huán)烯醚萜苷類含量比較

何志鵬，王仕寶，陳垣，胡本祥，蔡子平，李霞

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 漢中 723000；4.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 秦巴山區(qū)藥（食）用植物研究所，陜西 漢中 723000；5.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，甘肅 蘭州 730070）

中藥材秦艽其基原植物為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）。作為常用大宗藥材，具有祛風(fēng)濕，清濕熱，止痹痛，退虛熱等功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等多種作用［2-4］。《中國(guó)藥典》1963年版收錄秦艽為龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophyllaPall.）的干燥根，從1977年版開始收錄的中藥材秦艽均為龍膽科植物秦艽（G.macrophyllaPall.）、麻花秦艽（G. stramineaMaxim.）、粗莖秦艽（G. crassicaulisDuthie ex Burk.）或小秦艽（G. dahuricaFisch.）的干燥根［5-6］。

南北朝劉宋·雷斅《雷公炮炙論》曰：“凡使，秦并艽，須于腳文處認(rèn)取。左文列為秦，即治疾；艽即發(fā)腳氣［7］。”《日華子本草》《本草圖經(jīng)》《本草品匯精要》分別記載秦艽用根有羅紋者為佳［8-10］?！侗静菥V目》曰：“秦艽出秦中，以羅紋絞糾者佳，故名秦艽［11］。”明清本草《本草原始》《本草匯》《本草匯箋》《握靈本草》均對(duì)秦艽的品質(zhì)做出評(píng)價(jià)，秦艽根形土黃色，以左文者為良［12-15］，這些評(píng)價(jià)均受到了《雷公炮炙論》的影響。唯有李時(shí)珍認(rèn)為將秦艽分為“秦”與“艽”是一種謬用。至今部分學(xué)者認(rèn)為秦艽以左旋者為佳，甚至稱其為左秦艽。

根據(jù)觀察，四種基原秦艽植物在生長(zhǎng)過程中，有些主根扭曲不直，或部分藥材各個(gè)分枝根相互纏繞扭結(jié)形成圓錐形，或多數(shù)分枝互相扭曲連合在一起形成網(wǎng)狀或麻花狀，由于秦艽藥材主根縱向溝紋或分枝扭結(jié)的方向表現(xiàn)為左旋（逆時(shí)針扭結(jié)）和右旋（順時(shí)針扭結(jié)）兩類特征，為了描述方便，文中統(tǒng)一稱為左旋秦艽和右旋秦艽。本研究以不同基原和產(chǎn)地的秦艽藥材為研究材料，以左旋秦艽和右旋秦艽中三種環(huán)烯醚萜苷成分含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行考察，從而為秦艽藥材的資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器

e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；KQ-800KDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BASIC-T超純水系統(tǒng)（賽多利斯科學(xué)儀器（北京））；QUINTIX224-1CN電子天平［d = 0.0001 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）］；DHG-9240B鼓風(fēng)干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）；FW-100超微粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥與材料

馬錢苷酸（批號(hào)：111865-202005）、獐牙菜苦苷（批號(hào)：110785-201404）、龍膽苦苷（批號(hào)：110770-201918）均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），醋酸（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。供試樣品經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院陳垣教授鑒定為龍膽科植物秦艽（G.macrophyllaPall.）、麻花秦艽（G. stramineaMaxim.）、粗莖秦艽（G. crassicaulisDuthie ex Burk.）和小秦艽（G. dahuricaFisch.）的干燥根。從樣品中選取大小相近的根作為供試材料，經(jīng)45℃烘箱干燥，粉碎，過三號(hào)篩（直徑0.36 mm），備用。不同產(chǎn)地的基原藥材信息見表1，性狀見圖1。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取馬錢苷酸對(duì)照品、獐牙菜苦苷對(duì)照品和龍膽苦苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容，使其濃度分別為0.2940 mg·mL-1、0.2458 mg·mL-1和0.2842 mg·mL-1，保存于4℃遮光的冰箱中備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取經(jīng)干燥后的秦艽供試樣品0.5 g，置于150 mL的具塞錐形瓶中，按照不同液料比加入適量甲醇，稱定重量，用封口膜封口，按照不同超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行超聲處理，冷卻后去掉封口膜，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過濾，取續(xù)濾液，將續(xù)濾液用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液，在4℃遮光的冰箱中備用。

2.2 高效液相色譜檢測(cè)設(shè)計(jì)

色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%醋酸（9 ∶ 91），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣量為10 μL。

精密量取馬錢苷酸對(duì)照品、獐牙菜苦苷對(duì)照品和龍膽苦苷對(duì)照品混合儲(chǔ)備液，用甲醇進(jìn)行定容，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品梯度溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法（High performance liguid chromatography，HPLC）進(jìn)行檢測(cè)。以濃度作為橫坐標(biāo)，以混合對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的積分峰面積為坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出秦艽供試品溶液中環(huán)烯醚萜苷類化合物的濃度，并計(jì)算其得率。

2.3 HPLC方法驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取待測(cè)秦艽混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10.0 μL，用HPLC測(cè)定6次，測(cè)定3種對(duì)照品的峰面積。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取秦艽供試品溶液，進(jìn)樣量10.0 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、48 h進(jìn)樣并測(cè)定其峰面積，同時(shí)記錄保留時(shí)間。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取待測(cè)秦艽樣品6份，按照“2.1.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量10.0 μL，測(cè)定樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和龍膽苦苷的峰面積。

2.3.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下待測(cè)供試品溶液1 mL，加甲醇定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為試樣；另精密量取供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，再加入備用混合對(duì)照品溶液1 mL，用甲醇定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為加標(biāo)試樣。

2.3.5 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

量取混合對(duì)照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL，測(cè)定其峰面積。分別以各色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得保留時(shí)間、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)和線性范圍，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2，色譜圖見圖2。

表2 秦艽對(duì)照品線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear regression equation and correlation coefficient of control samples from G. macrophylla

圖2 HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram

3 結(jié)果與分析

3.1 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

按照“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”方法進(jìn)行試驗(yàn)，其馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和龍膽苦苷的精密度RSD在0.15% ～ 0.28%，穩(wěn)定性RSD值在2.50% ～ 2.95%，重復(fù)性RSD在0 ～ 0.80%之間。表明其精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。另外，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 環(huán)烯醚萜苷類化合物加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results standard recovery of iridoid glycosides

3.2 不同產(chǎn)地左旋秦艽含量比較

結(jié)合圖3和表4，在同一基原秦艽（G. macrophyllaPall.）不同產(chǎn)地左旋秦艽樣品中，QJ3L的馬錢苷酸含量最高，為1.78%，QJ4L的最低，為0.15%；QJ4L的獐芽菜苦苷含量最高，為1.14%，QJ7L的最低，為0.63%；QJ3L的龍膽苦苷含量最高，為16.70%，QJ6L的最低，為4.04%；QJ3L的三種環(huán)烯醚萜苷含量總和最高，為19.57%，QJ6L最低，為5.07%。在同一基原麻花秦艽（G. stramineaMaxim.）不同產(chǎn)地左旋秦艽樣品中，QJ10L的馬錢苷酸含量最高，為0.87%，QJ9L的最低，為0.33%；QJ11L的獐芽菜苦苷含量最高，為1.50%，QJ12L的最低，為0.26%；QJ10L的龍膽苦苷含量最高，為14.10%，QJ9L的最低，為0.89%；QJ10L的三種環(huán)烯醚萜苷含量總和最高，為16.08%，QJ9L的最低，為1.48%。

表4 左、右旋秦艽中環(huán)烯醚萜苷類成分含量Tab.4 Contents of iridoid glycosides in sinistral and dextral G. macrophylla

圖3 不同產(chǎn)地左旋秦艽中環(huán)烯醚萜苷類化合物含量比較Fig.3 Comparison of the content of iridoid glycosides in sinistral G. macrophylla from different habitats

從表4得出，同一基原小秦艽（G. dahuricaFisch.）不同產(chǎn)地左旋秦艽樣品中，QJ2L的馬錢苷酸含量最高，為0.30%，QJ1L的最低，為0.26%；QJ1L的獐芽菜苦苷含量最高，為2.92%，QJ2L的最低，為2.27%；QJ1L的龍膽苦苷含量最高，為13.29%，QJ2L的最低，為10.76%；QJ1L的三種環(huán)烯醚萜苷含量總和最高，為16.48%，QJ2L的最低，為13.33%。同一基原粗莖秦艽（G. crassicaulisDuthie ex Burk.）左旋秦艽樣品中，馬錢苷酸含量為1.29%，獐芽菜苦苷含量為1.88%，龍膽苦苷含量為12.47%，三種環(huán)烯醚萜苷含量總和為15.64%。

最后對(duì)同一基原秦艽（G. macrophyllaPall.）的測(cè)定結(jié)果分析，以馬錢苷酸、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷三者總含量進(jìn)行比較，總含量QJ3L（19.58%）＞QJ7L（9.35%）＞QJ5L（8.96%）＞QJ4L（7.58%）＞QJ6L（5.06%），可見四川若爾蓋產(chǎn)地總含量最高，新疆瑪納斯縣最低；同理，對(duì)同一基原麻花秦艽（G. stramineaMaxim.）的測(cè)定結(jié)果分析及比較，總含量QJ10L（16.08%）＞QJ11L（6.76%）＞QJ12L（4.75%）＞QJ9L（1.48%），可見甘肅瑪曲產(chǎn)地總含量最高，青海同仁縣最低，其它產(chǎn)地介于中間；對(duì)同一基原小秦艽（G.dahuricaFisch.）結(jié)果分析及比較，總含量QJ1L（16.47%）＞QJ2L（13.33%），得出內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗總含量最高，陜西鳳縣含量最低。

3.3 不同產(chǎn)地右旋秦艽含量比較

結(jié)合圖4和表4，同一基原秦艽（G. macrophyllaPall.）不同產(chǎn)地右旋秦艽樣品中，QJ5R的馬錢苷酸含量最高，為2.79%，QJ4R的最低，為0.09%；QJ4R的獐芽菜苦苷含量最高，為1.44%，QJ6R的最低，為0.42%；QJ3R的龍膽苦苷含量最高，為16.66%，QJ6R的最低，為5.04%；QJ3R的三種環(huán)烯醚萜苷含量總和最高，為19.51%，QJ6R的最低，為6.91%。同一基原麻花秦艽（G. stramineaMaxim.）不同產(chǎn)地右旋秦艽樣品中，QJ10R的馬錢苷酸含量最高，為1.90%，QJ11R的最低，為0.15%；QJ10R的獐芽菜苦含量最高，為1.27%，QJ9R的最低，為0.20%；QJ10R的龍膽苦苷含量最高，為14.85%，QJ9R的最低，為1.39%；QJ10R的三種環(huán)烯醚萜苷含量總和最高，為18.03%，QJ9R的最低，為1.93%。

從表4得出，同一基原小秦艽（G. dahuricaFisch.）不同產(chǎn)地右旋秦艽樣品中，QJ1R的馬錢苷酸含量最高，為0.33%，QJ2R的最低，為0.23%；QJ1R的獐芽菜苦苷含量最高，為2.97%，QJ2R的最低，為2.60%；QJ1R的龍膽苦苷含量最高，為16.49%，QJ2R的最低，為14.94%；QJ1R的三種環(huán)烯醚萜苷含量總和最高，為16.48%，QJ2R的最低，為14.93%。同一基原粗莖秦艽（G. crassicaulisDuthie ex Burk.）右旋秦艽樣品中，馬錢苷酸含量為1.20%，獐芽菜苦苷含量為1.73%，龍膽苦苷含量為11.58%，三種環(huán)烯醚萜苷含量總和為14.51%。

對(duì)同一基原秦艽（G. macrophyllaPall.）的測(cè)定結(jié)果分析，以馬錢苷酸、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷三者總含量進(jìn)行比較，總含量QJ3R（19.52%）＞QJ5R（14.26%）＞QJ7R（9.43%）＞QJ4R（8.66%）＞QJ6R（6.90%），可見四川若爾蓋產(chǎn)地秦艽樣品的總含量最高，新疆瑪納斯縣的最低；同理，對(duì)同一基原麻花秦艽（G. stramineaMaxim.）的測(cè)定結(jié)果分析及比較，總含量QJ10R（18.02%）＞QJ11R（5.57%）＞QJ12R（4.96%）＞QJ9R（1.93%），可見甘肅瑪曲產(chǎn)地麻花秦艽樣品的總含量最高，青海同仁縣的最低，其它產(chǎn)地介于中間；對(duì)同一基原小秦艽（G. dahuricaFisch.）結(jié)果分析及比較，總含量QJ1R（16.48%）＞QJ2R（14.93%），得出內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗產(chǎn)地小秦艽樣品的總含量最高，陜西鳳縣的含量最低。

通過以上對(duì)不同產(chǎn)地左、右旋秦艽含量大小順序比較，得出不論何種基原，其測(cè)定結(jié)果含量排序基本趨于一致。即四川若爾蓋秦艽樣品的含量最高，新疆瑪納斯縣的最低；甘肅瑪曲麻花艽樣品的含量最高，青海同仁縣的最低；內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗小秦艽樣品的總含量最高，陜西鳳縣的總含量最低。也就是說，產(chǎn)地對(duì)秦艽藥材的含量影響最大。

3.4 左、右旋秦艽含量比較

結(jié)合圖5和表4，對(duì)左、右旋秦艽樣品的含量進(jìn)行對(duì)比。以馬錢苷酸含量作為考察指標(biāo)，樣品QJ2、QJ3、QJ4、QJ8、QJ11均為左旋秦艽高于右旋秦艽；樣品QJ1、QJ5、QJ6、QJ7、QJ9、QJ10、QJ12均為右旋秦艽高于左旋秦艽。以獐芽菜苦苷含量作為考察指標(biāo)，樣品QJ3、QJ6、QJ7、QJ8、QJ9、QJ11均為左旋秦艽高于右旋秦艽；樣品QJ1、QJ2、QJ4、QJ5、QJ10、QJ12均為右旋秦艽高于左旋秦艽。以龍膽苦苷含量作為考察指標(biāo)，樣品QJ1、QJ3、QJ7、QJ8、QJ11均為左旋秦艽高于右旋秦艽；樣品QJ2、QJ4、QJ5、QJ6、QJ9、QJ10、QJ12均為右旋秦艽高于左旋秦艽。以三種環(huán)烯醚萜苷含量總和作為考察指標(biāo)，樣品QJ3、QJ8、QJ11均為左旋秦艽高于右旋秦艽；但是QJ1、QJ2、QJ4、QJ5、QJ6、QJ7、QJ9、QJ10、QJ12均為右旋秦艽高于左旋秦艽。

3.5 24批秦艽樣品結(jié)果比較

從左旋秦艽和右旋秦艽的含量比較中得出：以馬錢苷酸含量進(jìn)行比較，其中5批樣品（QJ2L、QJ3L、QJ4L、QJ8L和QJ11L）的含量左旋高于右旋；7批樣品（QJ1R、QJ5R、QJ6R、QJ7R、QJ9R、QJ10R和QJ12R）的含量右旋高于左旋。以獐牙菜苦苷含量大小比較，其中6批樣品（QJ3L、QJ6L、QJ7L、QJ8L、QJ9L和QJ11L）的含量左旋高于右旋；6批樣品（QJ1R、QJ2R、QJ4R、QJ5R、QJ10R和QJ12R）的含量右旋高于左旋；以龍膽苦苷含量進(jìn)行比較，其中5批樣品（QJ1L、QJ3L、QJ7L、QJ8L和QJ11L）的含量左旋高于右旋；7批樣品（QJ2R、QJ4R、QJ5R、QJ6R、QJ9R、QJ10R和QJ12R）的含量右旋高于左旋。同理，以三者總含量進(jìn)行比較，只有3批樣品（QJ3L、QJ8L和QJ11L）左旋高于右旋，占比25%；其余9批樣品（QJ1R、QJ2R、QJ4R、QJ5R、QJ6R、QJ7R、QJ9R、QJ10R和QJ12R）右旋均高于左旋。

此外，結(jié)合表5，通過所有的左、右旋秦艽樣品進(jìn)行分析，以馬錢苷酸、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的含量累計(jì)值對(duì)比，其中左旋樣品含量分別為8.08%、102.50%、14.47%；右旋樣品含量分別為11.77%、108.80%、14.61%；同理，左、右旋秦艽樣品總含量累計(jì)值分別為125.06%和135.18%。通過上述樣品含量對(duì)比分析，得出本次試驗(yàn)所有樣品中，有75%的右旋秦艽其總含量高于左旋秦艽，而且左旋秦艽相比右旋秦艽總含量累計(jì)值少10.12個(gè)百分點(diǎn)。

4 小結(jié)

《本草原始》《本草匯》《本草匯箋》《握靈本草》等記載的“秦艽以左文者良”，這可能是古人對(duì)秦艽臨床療效的總結(jié)［12-15］。本文旨在探究不同左、右旋秦艽品質(zhì)是否存在差異，或者左旋秦艽品質(zhì)是否高于右旋秦艽。由于藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)通常指藥材產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，直接影響到藥材產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和臨床療效。一般而言，品質(zhì)評(píng)價(jià)采用三種指標(biāo)進(jìn)行分析。其一，物理指標(biāo)，主要是指藥材的性狀特征；其二，化學(xué)有效成分指標(biāo)，主要是指有效成分的種類和含量高低；其三，安全性指標(biāo)，主要是指藥材的農(nóng)殘、有毒金屬元素及限量等。本文僅對(duì)秦艽藥材環(huán)烯醚萜苷的各成分含量以及總含量進(jìn)行測(cè)定和分析，即僅對(duì)化學(xué)有效成分指標(biāo)進(jìn)行分析，因此，品質(zhì)評(píng)價(jià)較為片面。此外，樣品數(shù)量只有24批次，樣品數(shù)量較少，缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，本文基于不同產(chǎn)地、不同基原的左、右旋秦艽比較，得出該研究中多數(shù)右旋秦艽總含量高于左旋秦艽。狹義來講，目前可暫且認(rèn)為右旋秦艽品質(zhì)優(yōu)于左旋。這一結(jié)論以后還需結(jié)合大量樣本進(jìn)行含量測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)開展藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面驗(yàn)證。

秦艽在生長(zhǎng)過程中，各個(gè)側(cè)根相互纏繞扭結(jié)形成圓錐形。按照側(cè)根的扭結(jié)方向，可以分為左旋（逆時(shí)針纏繞）秦艽和右旋（順時(shí)針纏繞）秦艽兩類藥材。以上不同形態(tài)與藥材品質(zhì)是否具有一定的必然聯(lián)系？基于這個(gè)問題，將所收集的產(chǎn)自內(nèi)蒙古、新疆、青海、陜西、四川、云南和甘肅七個(gè)不同產(chǎn)區(qū)、四個(gè)基原合計(jì)24批次樣品（左、右旋各12批），通過HPLC對(duì)不同產(chǎn)地、不同基原的左旋秦艽和右旋秦艽的馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷以及三者總含量的檢測(cè)比較，最終給予品質(zhì)評(píng)價(jià)。另外，道地藥材的品質(zhì)往往受到不同自然環(huán)境和人為文化的影響，如地理環(huán)境、水質(zhì)土壤、氣候地形、藥材區(qū)劃、時(shí)令節(jié)氣等諸多因素［16-21］。中藥材治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，是基于自身內(nèi)部組織固有的化學(xué)成分群及其主要成分含量［22］。因此，評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的等級(jí)或優(yōu)劣，目前仍然以其所含有效成分群的組成和含量的高低為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，秦艽作為常用藥材也不例外。