朱砂根成熟果實(shí)不同部位生理特性與種子胎生的關(guān)系

趙財(cái)寶，王斌，潘曲波，王錦，艾星梅*，孫媛媛

（1.西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程中心，云南 昆明 650224；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205）

朱砂根（Ardisia crenata）隸屬于報(bào)春花科（Primulaceae）紫金牛屬（Ardisia）常綠灌木，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)溫暖潮濕的山地林下。成熟果實(shí)為紅色球形漿果，少數(shù)為黃果或白果［1］，具有很高的觀賞價(jià)值，果實(shí)密度大且掛果期長(zhǎng)，能在母株上附著一年或更長(zhǎng)時(shí)間，存在花果同期的現(xiàn)象，且耐陰性較強(qiáng)，可作為室內(nèi)觀賞和城市景觀的理想樹(shù)種。目前，對(duì)朱砂根的研究主要集中在資源調(diào)查［2］、逆境脅迫生理［3-4］、形態(tài)發(fā)育及分子鑒定［5-7］、居群遺傳多樣性分析［8］以及化學(xué)成分和藥理作用［9］等方面。研究發(fā)現(xiàn)，朱砂根植株的根、莖、葉中含有香豆素類、皂苷類等多種生物活性化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗癌、抗炎特性［10-11］，對(duì)病毒的轉(zhuǎn)移具有重要的抑制作用［12］。

近年來(lái)，由于朱砂根具有較高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值而被大量開(kāi)發(fā)，導(dǎo)致野生資源棲息地碎片化，自然分布范圍逐漸縮小，面臨著滅絕的高風(fēng)險(xiǎn)［13］，因此，應(yīng)不斷提高其繁育系數(shù)，朱砂根通常采用種子、扦插和種胚離體繁殖［14］，盡管種子較多，但通過(guò)種子直播成苗較慢，優(yōu)質(zhì)扦插苗的成活率較低［15］。由于掛果期長(zhǎng)，種子常表現(xiàn)出胎生現(xiàn)象，這可能與它們生活的溫暖潮濕的林下弱光環(huán)境有關(guān)［16］，胎萌后脫離母體可快速成苗，是繁殖方式的一種重要補(bǔ)充。前期研究發(fā)現(xiàn)，朱砂根成熟種子有些胎生，有些非胎生，除了受環(huán)境因子影響以外，還可能與自身的遺傳特性有關(guān)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，以朱砂根胎生和非胎生成熟果實(shí)為材料，分別剝離外果皮、中果皮、內(nèi)果皮、胚乳及胎生種子胚根，測(cè)定不同部位的碳水化合物及酶活性變化，探討其生理特征差異性與胎生的關(guān)系，為進(jìn)一步研究朱砂根種子的胎生機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的材料均為5～6年野生朱砂根植株，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，根據(jù) Chen 和Pipoly 在《Flora of China》中的描述［17］，對(duì)朱砂根植株進(jìn)行了鑒定分析。移植于西南林業(yè)大學(xué)苗圃基地（25°03′ N，102°46′ E，亞熱帶高原季風(fēng)氣候，年平均溫度12.5℃，年平均降水量約900 mm）。2020年11月中旬，從10株生長(zhǎng)良好且性狀穩(wěn)定的植株上分別采集新鮮成熟的胎生與非胎生果實(shí)各200粒，果實(shí)飽滿均勻無(wú)病蟲(chóng)害，立即帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方法

用自來(lái)水將果實(shí)清洗干凈后迅速擦干水分，分別剝離胎生與非胎生朱砂根果實(shí)的外果皮、中果皮、內(nèi)果皮、胚乳及胎生種子胚根，將樣品用液氮速凍后放入-80℃的冰箱中冷凍保存，分別測(cè)定不同部位的生理指標(biāo)差異性?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定；可溶性糖、淀粉含量采用蒽酮比色法測(cè)定；過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物氧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，α-淀粉酶和β-淀粉酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定，以上方法均采用但方［18］的方法，重復(fù)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，同時(shí)利用SPSS Statistics 23.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）及Duncan多重比較，并進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算樣本平均值之間差異的顯著性（P＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)可溶性蛋白含量差異

朱砂根胎生與非胎生成熟果實(shí)不同部位的蛋白質(zhì)含量變化如圖1所示，從不同部位來(lái)看，無(wú)論是胎生還是非胎生，同一果實(shí)中內(nèi)果皮的蛋白質(zhì)含量均顯著高于其他部位（P ＜0.05），表現(xiàn)為內(nèi)果皮＞胚乳＞外果皮＞中果皮，胎生后胚根中的蛋白質(zhì)含量也較高，僅次于胚乳；從胎生和非胎生果實(shí)來(lái)看，朱砂根非胎生果實(shí)外果皮、中果皮和內(nèi)果皮的蛋白質(zhì)含量均顯著高于胎生果實(shí)（P＜ 0.05），而胚乳中的蛋白質(zhì)含量均無(wú)顯著差異性（P ＞0.05），說(shuō)明朱砂根的胎生可能與果皮，尤其是中果皮的蛋白質(zhì)含量下降有關(guān)，而受胚乳的影響較小。

2.2 朱砂根果實(shí)可溶性糖和淀粉含量差異

朱砂根胎生與非胎生果實(shí)不同部位的可溶性糖和淀粉含量變化如圖2所示，可以看出，種子胎生后的胚根可溶性糖含量最高（圖2a），為8.79 mg·g-1，顯著高于其他部位（P ＜0.05）；胎生和非胎生果實(shí)由外向內(nèi)不同部位的可溶性糖含量均呈先升后降的趨勢(shì)，表現(xiàn)為中果皮＞內(nèi)果皮＞外果皮＞胚乳；胎生后胚乳中的可溶性糖含量有一定的積累，但與非胎生果實(shí)相比，差異不顯著（P ＞0.05），除此之外，胎生果實(shí)各部位的可溶性糖含量均低于非胎生果實(shí)，說(shuō)明種子胎生可能與果皮中的可溶性糖含量下降有關(guān)。對(duì)兩種果實(shí)不同部位的淀粉含量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2b所示，朱砂根非胎生果實(shí)內(nèi)果皮的淀粉含量最高，為6.18%，其次為胚乳，均極顯著高于外果皮和中果皮（P＜ 0.01），胎萌發(fā)生后，胚根中的淀粉含量最高，均顯著高于其他部位（P＜ 0.05），而外果皮和中果皮的淀粉含量變化不顯著（P ＞0.05），內(nèi)果皮和胚乳中的淀粉含量則迅速下降，說(shuō)明胚根中淀粉的積累可能主要來(lái)源于內(nèi)果皮和胚乳。

圖2 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)可溶性糖和淀粉含量變化Fig.2 Changes of soluble sugar and starch contents in viviparous and non-viviparous fruit of A. crenata

2.3 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)抗氧化酶活性差異

從圖3可以看出，朱砂根胎生與非胎生果實(shí)不同部位的抗氧化酶活性存在顯著差異性（P＜0.05），非胎生果實(shí)從外向內(nèi)不同部位的SOD酶活性先降低后升高，其中以胚乳中的SOD活性最高，而胎生果實(shí)外果皮的SOD酶活性最高，為918.08 U·g-1，依次向內(nèi)逐漸降低，以胚根中的SOD活性最低，僅為9.61 U·g-1（圖3a），胎生與非胎生各部位間的SOD活性均差異顯著（P ＜0.05）；對(duì)于POD酶活性（圖3b），從不同部位來(lái)看，果實(shí)從外向內(nèi)的POD酶活性均呈先升后降的趨勢(shì)，其中以胎生果實(shí)中果皮的POD酶活性最高，其次為內(nèi)果皮，胚根中的POD酶活性最低；從胎生與非胎生果實(shí)來(lái)看，除兩者的外果皮間無(wú)顯著差異性以外（P ＞0.05），胎生果實(shí)的POD活性較非胎生果實(shí)高且差異顯著（P ＜0.05），說(shuō)明胎萌發(fā)生后，胚根突破種皮，果實(shí)各部位均啟動(dòng)了抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)抵御外界不良環(huán)境。

圖3 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)SOD和POD酶活性變化Fig.3 Changes of SOD and POD activities in viviparous and non-viviparous fruit of A. crenata

2.4 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)淀粉酶活性差異

朱砂根胎生與非胎生成熟果實(shí)不同部位的淀粉酶活性變化如表1所示，可以看出，無(wú)論是胎生還是非胎生果實(shí)，不同部位的淀粉酶活性均存在較大的差異性，其中以內(nèi)果皮的α-淀粉酶和β-淀粉酶活性最高，均顯著高于同一果實(shí)其它部位（P＜ 0.05），表現(xiàn)為內(nèi)果皮＞外果皮＞中果皮＞胚乳；相比較兩種淀粉酶活性，果實(shí)不同部位中的β-淀粉酶遠(yuǎn)高于α-淀粉酶，且非胎生果實(shí)均高于胎生果實(shí)；從α+β淀粉酶活性來(lái)看，胎萌發(fā)生后，胚根中的淀粉酶活性較高，而胚乳中的淀粉酶活性雖略有增加，但差異不顯著（P＞ 0.05），而其它部位的α+β淀粉酶活性均顯著下降（P＜ 0.05），說(shuō)明淀粉酶在朱砂根種子胎萌過(guò)程中主要對(duì)果皮中的淀粉發(fā)生了水解作用。

表1 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)淀粉酶活性變化Tab.1 Changes of amylase activity in viviparous and non-viviparous of A. crenata（單位：μg·g-1·min-1）

2.5 朱砂根胎生與非胎生果實(shí)生理特性相關(guān)性分析

朱砂根胎生和非胎生果實(shí)碳水化合物含量及酶活性相關(guān)性分析如表2所示，可以看出，無(wú)論是胎生還是非胎生，果實(shí)中的蛋白質(zhì)含量與α-淀粉酶和β-淀粉酶之間均呈顯著或極顯著正相關(guān)（P ＜0.05），對(duì)于非胎生果實(shí)而言，淀粉含量與蛋白質(zhì)、SOD、淀粉酶活性之間呈顯著或極顯著正相關(guān)（P ＜0.05），可溶性糖含量與SOD呈極顯著負(fù)相關(guān)（P ＜0.01）；對(duì)于胎生果實(shí)而言，淀粉與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)（P ＜0.01），而與POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P ＜0.01）。

表2 胎生與非胎生果實(shí)碳水化合物及酶活性相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of carbohydrates content and enzymes activities in viviparous and non-viviparous fruits

3 結(jié)論與討論

種子胎萌是自然界的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，與動(dòng)物胎生現(xiàn)象相仿，種子離體前直接在植株上發(fā)芽，脫落后可快速成苗，受自身遺傳因素或外界高溫、高濕、降雨等特殊的環(huán)境條件的誘導(dǎo)，以使植物適應(yīng)更多的生長(zhǎng)環(huán)境，從而提高其競(jìng)爭(zhēng)力［19］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越關(guān)注植物胎萌機(jī)理的研究，其中在遺傳上以胎萌為主要繁殖方式的紅樹(shù)科植物最為常見(jiàn)［20］。對(duì)于一些特殊植物來(lái)說(shuō)，種子胎萌具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，仙人掌科植物［21-22］、珠芽蓼［23］等兼具胎生繁殖特性，通過(guò)適應(yīng)海拔、溫度、光照的變化來(lái)改變有性和無(wú)性繁殖器官形成的比例［24］，甚至植株的高度和胎萌的數(shù)量。研究表明，胎萌種子的發(fā)芽活力、抗逆性等均高于非胎萌種子［25-26］，是后代為了避免和適應(yīng)不良生存環(huán)境的一種表現(xiàn)［27-28］，且優(yōu)良性狀能遺傳給后代群體［29］。

生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶的某些頑拗性種子同時(shí)具有胎萌現(xiàn)象［22］，從某種意義上來(lái)說(shuō)也是植物對(duì)周圍環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果［30］，頑拗性種子生理代謝活躍，且種皮薄，可增強(qiáng)與環(huán)境的氣體交換［31］，但不會(huì)阻止胚胎軸的伸長(zhǎng)和發(fā)芽，一旦發(fā)生會(huì)導(dǎo)致最終的水分損失［32］。本研究中，成熟后的朱砂根種子與許多熱帶物種如枹櫟［33］、紫荊木屬植物［34］的頑拗性種子一樣，對(duì)脫水敏感，成熟采收時(shí)含水量較高，不能耐受成熟脫水，也沒(méi)有明顯的休眠特性，而種子胎萌反映了植株對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)策略，是植物繁殖途徑的一種重要補(bǔ)充。

種皮具有保護(hù)種胚和萌發(fā)時(shí)吸水和透氣的作用，其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)隨植物種類而異［35］，在長(zhǎng)期的環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中，果種皮的相關(guān)生物學(xué)特性也會(huì)影響種子萌發(fā)及其生理特征［36］。研究表明，種子內(nèi)的碳水化合物可為胎生器官的萌發(fā)提供所需能量，其代謝水平的變化與種子萌發(fā)密切相關(guān)，米勒魔芋珠芽萌發(fā)以后蛋白質(zhì)含量逐漸下降［37］；水稻籽粒中可溶性糖和淀粉含量越高越易發(fā)生胎萌［38］；黃瓜種子胎萌后的可溶性糖含量逐漸降低，說(shuō)明種子胎萌需要消耗大量的可溶性糖［39-40］，而胎生后的桐花樹(shù)種子淀粉含量不斷積累，可能是由于可溶性糖轉(zhuǎn)變成了貯存物質(zhì)淀粉的結(jié)果［41］，這與本研究的結(jié)果類似，朱砂根成熟胎生果實(shí)不同部位的蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉含量均顯著低于非胎生果實(shí)，而胚根中的含量均較高，說(shuō)明胎萌發(fā)生后果實(shí)不同部位的碳水化合物可能向胚部進(jìn)行了轉(zhuǎn)移。此外，抗氧化酶、α-淀粉酶等的活性變化也是影響種子萌發(fā)的重要因素。通常情況下，植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除之間處于動(dòng)態(tài)平衡，各種酶活性均維持在一定水平。研究表明，易胎萌春大豆種子中的過(guò)氧化物酶活性比不易胎萌的種子高［42］，而高枝假木賊種子胎萌也與過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等活性在萌發(fā)不同階段的協(xié)同作用有關(guān)，為種子在逆境中胎萌并正常生長(zhǎng)提供保護(hù)［43］。本研究中，非胎生果實(shí)淀粉含量與SOD酶活性呈極顯著正相關(guān)，但與POD酶活性差異不顯著，而胎生果實(shí)中的SOD和POD酶活性大多高于非胎生果實(shí)，且淀粉含量與SOD呈負(fù)相關(guān)，而與POD呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明種子胎萌發(fā)生后，各部位的淀粉含量均逐漸降低，啟動(dòng)了相應(yīng)的抗氧化酶防御系統(tǒng)。此外，種子中淀粉的分解需要一系列酶的催化與調(diào)控，較高的α、β-淀粉酶活性，有助于水稻種子內(nèi)淀粉的分解［38］，易于在穗上發(fā)芽的水稻種子在成熟后期α-淀粉酶活性明顯高于不易在穗上發(fā)芽的種子［44］，表明α-淀粉酶可能對(duì)后期胚的發(fā)育具有一定的調(diào)節(jié)作用［45］。本研究中，無(wú)論是胎生還是非胎生果實(shí)，內(nèi)果皮中的α-淀粉酶和β-淀粉酶活性均顯著高于同一果實(shí)其它部位，且非胎生果實(shí)高于胎生果實(shí)，說(shuō)明胎萌發(fā)生后，淀粉酶活性迅速降低為胚胎提供能量。

朱砂根花芽分化的順序?yàn)閺南峦?、自外向?nèi)［6］，成熟果實(shí)均會(huì)發(fā)生不同程度的胎萌，但主要集中在植株中下部，這可能與掛果期較長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)先分配和積累有關(guān)。與非胎生果實(shí)相比，胎生果實(shí)不同部位的碳水化合物可能協(xié)同參與胚發(fā)育的代謝過(guò)程，其含量被降解用作胚的組織分化發(fā)育所需的能量，并在胚內(nèi)積累，尤其是內(nèi)果皮中的碳水化合物、淀粉酶與POD酶活性均較高，可能對(duì)朱砂根的胎萌起重要的調(diào)控作用，需進(jìn)一步從植物激素調(diào)控水平以及胎萌相關(guān)基因表達(dá)等方面深入研究，全面探討胎生發(fā)育的遺傳機(jī)制。