脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉理化性質的影響

李欣倩，劉錦華，王若伊，封 琴，馮慕心，陸春苗，趙渠加，楊 英

（稻谷及副產物深加工國家工程研究中心，中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙 410004）

大米粉是一種重要的谷物食品原料，其理化性質對米糊、米餅等米制品的品質具有重要的影響[1-2]。在大米粉中，淀粉含量高達80%，是大米粉具有糊化性能的基礎，但蛋白質作為第二大組分（含量6%～7%），對大米粉的糊化特性具有顯著影響[3-6]。大米蛋白質由水溶性清蛋白、鹽溶性球蛋白、醇溶蛋白和堿溶性谷蛋白組成，目前已有研究發(fā)現這些溶解性不同的內源蛋白質對大米粉的成糊特性具有不同的影響：脫除清蛋白能顯著降低非糯性大米粉的糊化溫度和糊化粘度[7]，但對糯米粉的成糊特性沒有顯著性影響[8]；脫除球蛋白能提高糯米粉的成糊溫度，但會降低成糊粘度、崩解值和回生值[9]；脫除醇溶蛋白能降低非糯性大米粉的成糊粘度和崩解值[10]；脫除谷蛋白能降低不同品種大米粉的成糊溫度、粘度、崩解值和回生值[11]。但是，關于不同溶解性內源蛋白質對大米粉成糊后水分結合狀態(tài)、流變學特性、凍融穩(wěn)定性等其他理化性質影響的研究還不夠充分，尤其少見涉及早秈米粉的報道。

早秈米粉是生產米粉（米線）等消費量龐大的米制品的優(yōu)質原料[12-13]，研究溶解性不同內源蛋白質對早秈米粉理化性質的影響對提高相關米制品品質具有重要的意義，也有利于充分高值化利用產量大、耐儲藏但碎米率高[14]的早秈米。能夠依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的Osborne 法[15]是一種成熟、簡單且安全的脫除大米粉不同溶解性內源蛋白質的方法，在工業(yè)化生產中具有良好的應用前景。因此，本文采用Osborne 法依次脫除早秈米粉的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，對比研究不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉溶解度、膨脹度、成糊特性及其糊化后與水結合情況、流變學特性和凍融穩(wěn)定性的影響規(guī)律，以期為利用不同溶解性內源蛋白質調控早秈米粉理化性質以提高相關米制品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

早秈米粉（RF）由產自安徽南陵縣新塘米廠的珍珠三號早秈米經干磨過100 目篩制成；氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

HH-2 數顯恒溫水浴鍋 上海力辰科技有限公司；101-1 電熱干燥鼓風箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；F-3L 玻璃反應釜 鞏義市科華儀器設備有限公司；L530 離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；KDN-08C 數顯控溫消化爐 上海力辰儀器科技有限公司；K9840 自動凱氏定氮儀 濟南市海能儀器股份有限公司；SpectraMax i3X 酶標儀 美谷分子儀器有限公司；RVA-4 快速粘度分析儀 瑞典波通公司；DHR-2 流變儀 美國TA 公司；NM120型低場核磁共振 上海紐邁電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫除不同種類蛋白質大米粉樣品的制備 參考張敏等[16]、孫媛等[17]描述的Osborne 方法，首先依次用蒸餾水、5% NaCl、70%乙醇和0.2% NaOH按料液比1∶10 g/mL 在40 ℃下浸泡早秈米粉脫除其中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，脫除后離心并用蒸餾水洗脫2 次，然后在40 ℃下干燥樣品，最后將樣品磨粉過100 目篩，獲得依次標記為RF-Alb、RF-AGlo、RF-AGPro 和RF-AGPGlu 的早秈米粉樣品。采用二奎啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒[18]測定樣品脫除液中的蛋白質含量，以同種脫除液中的蛋白質含量不再變化的時間作為該脫除處理的結束時間。BCA 測試操作如下：取牛血清蛋白標準品，用PBS 溶液稀釋至濃度為1.0 mg/mL，按梯度稀釋配制成標準測定液，加入200 μL BCA 工作液，37 ℃放置30 min，于562 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，其中橫坐標為蛋白質標準濃度，縱坐標為吸光度；取20 μL 待測液，加入200 μL BCA 工作液，充分混勻后，37 ℃靜置30 min后562 nm 處測定吸光度，根據標準曲線計算脫除液中蛋白質的含量。

1.2.2 早秈米粉樣品中總蛋白質含量的測定 按照GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法[19]測定早秈米粉樣品的總蛋白含量。

1.2.3 早秈米粉溶解度與膨脹度的測定 取1.2.1 中的樣品，配制成2%的米粉漿，分別在40、75 和90 ℃恒溫水浴中加熱攪拌30 min，冷卻后4000 r/min離心15 min，將上清液倒入鋁盒中于105 ℃干燥至恒重，稱重得到水溶大米粉重量，沉淀為膨脹大米粉。計算公式如下：

1.2.4 早秈米粉成糊特性的測定 采用快速粘度分析儀Standard 1 程序測定早秈米粉樣品的成糊特性，測定參數為960 r/min 運行10 s 后，保持160 r/min，50 ℃恒溫1 min，再以12 ℃/min 升溫至95 ℃，持續(xù)時間為2.5 min，然后以12 ℃/min 降溫至50 ℃，持續(xù)時間為2 min，得到糊化曲線、糊化溫度、峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值。

1.2.5 早秈米粉糊水分結合狀態(tài)的測定 采用低場核磁共振儀測試經1.2.4 形成的早秈米粉糊的水分結合狀態(tài)，具體測試條件為SW=200 kHz、TW=2500 ms、NS=8、NECH=4000，數據經單組分反演擬合得到樣品的橫向弛豫時間T2[20]。

1.2.6 秈米粉糊流變學特性的測定 采用流變儀測試經1.2.4 形成的早秈米粉糊的黏彈性，選用40 mm平板，設置0.1 cm 間隙。參考Yang 等[21]描述的方法，具體測試條件如下：先在25 ℃、1 Hz 下對樣品進行0.1%～100%應變掃描確定線性應變區(qū)間，后在該區(qū)間內進行0.1～1 Hz 的頻率掃描，獲得樣品的儲能模量（G′）、損耗模量（G′′）和損耗角正切值tanδ。

1.2.7 秈米粉糊凍融穩(wěn)定性的測定 參考唐雙[22]描述的方法，取經1.2.1 處理獲得的早秈米粉樣品加蒸餾水配制成5%（w/w，以干基計）的粉漿樣品，沸水浴糊化30 min 形成早秈米粉糊樣品。記50 mL 離心管的重量為m1，轉移20 g 樣品至離心管中并稱重，記m2，-18 ℃冷凍22 h 后放置在30 ℃水浴下解凍2 h，作為一個凍融循環(huán)。經過1、3、5 次循環(huán)后，4000 r/min 離心20 min，去掉上清液，稱取離心管和沉淀重，記為m3，按以下公式計算：

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS22 進行顯著性分析（P<0.05），Origin 2018 作圖，所有試驗均有2～3 次平行，測試結果用“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 早秈米粉樣品的總蛋白質含量

早秈米粉及其依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白樣品的總蛋白質含量分別為8.66%、7.78%、7.47%、7.14%和0.71%。由此可算出，依次脫除的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量分別為0.88%、0.31%、0.33%和6.43%，分別占脫除總蛋白質含量的11.07%、3.90%、4.15%和80.88%。脫除4 種蛋白質后，殘留的0.71%蛋白質很可能是淀粉顆粒相關蛋白[23]。

2.2 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉溶解度和膨脹度的影響

大米粉在糊化過程中，淀粉顆粒會吸水膨脹直至崩解。已有研究表明，淀粉顆粒的結晶結構在55 ℃下開始減少并在75 ℃下被完全破壞[24]，而早秈米淀粉的糊化溫度范圍是60～75 ℃[25]。因此，本文根據溫度對淀粉顆粒結構的影響程度，選擇在40、75 和90 ℃下研究脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉溶解度和膨脹度的影響。

不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉在40、75和90 ℃下的溶解度和膨脹度的影響分別如圖1 和圖2 所示。所有早秈米粉樣品的溶解度和膨脹度均隨溫度的升高而提高，到達90 ℃時提高幅度都最大。具體而言，從40 ℃到90 ℃，原早秈米粉樣品RF及其依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的樣品RF-Alb、RF-AGlo、RF-AGPro 和RF-AGPGlu的溶解度分別增大了3.1%、2.75%、3.51%、3.87%和18.6%，對應的膨脹度分別提高了4.72%、4.64%、4.69%、6.32%和14.22%。顯然，不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉的溶解度和膨脹度具有顯著性影響（P<0.05）。

圖1 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉溶解度的影響Fig.1 Effects of removing different soluble endogenous proteins on the solubility of rice flour

與RF 相比，RF-Alb 的溶解度在75 和90 ℃下顯著減?。≒<0.05），而膨脹度在40 和75 ℃下顯著降低（P<0.05），但在90 ℃下無顯著變化（P>0.05）。該結果表明，脫除清蛋白會抑制早秈米粉溶解，并在中低溫下抑制其膨脹。與RF 相比，RF-AGlo 的溶解度在不同溫度下均顯著增大（P<0.05），而膨脹度在40 和75 ℃下顯著降低（P<0.05），但在90 ℃下無顯著變化（P>0.05）；與RF-Alb 相比，RF-AGlo 的溶解度在不同溫度下均顯著增大（P<0.05），但膨脹度無顯著變化（P>0.05）。該結果表明，脫除球蛋白會促進早秈米粉溶解，但對其膨脹影響有限。與RF 相比，RFAGPro 的溶解度在75 ℃下顯著減?。≒<0.05），但在90 ℃下顯著增大（P<0.05），而膨脹度在40 和75 ℃下顯著降低（P<0.05）；與RF-AGlo 相比，RF-AGPro的溶解度在不同溫度下均顯著減小（P<0.05），而膨脹度在40 ℃下顯著降低（P<0.05），但在90 ℃下顯著提高（P<0.05）。該結果表明，脫除醇溶蛋白會抑制早秈米粉溶解，但在高溫下促進其膨脹。與RF 相比，RF-AGPGlu 的溶解度在40 ℃下顯著減?。≒<0.05），但在90 ℃下大幅增加，而膨脹度在40 和75 ℃下均顯著降低（P<0.05），但在90 ℃下大幅提高；與RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的溶解度在75 ℃下顯著增加（P<0.05）并在90 ℃下大幅提高，而膨脹度在75 ℃下顯著降低（P<0.05），但在90 ℃下大幅提高。該結果表明，脫除谷蛋白會在中溫下促進早秈米粉溶解，并在高溫下大幅促進其溶解和膨脹。因此，脫除球蛋白和谷蛋白可促進早秈米粉溶解，而脫除醇溶蛋白和谷蛋白可在高溫下促進早秈米粉膨脹。

2.3 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉成糊特性的影響

經RVA 測定，依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白對早秈米粉的成糊曲線具有不同的影響（如圖3 所示），對具體成糊特性參數的影響見表1。與RF 相比，RF-Alb 的糊化溫度沒有顯著性差異，峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值分別降低16%、21%、50%和43%，說明脫除清蛋白會降低早秈米粉成糊的峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值。RF-AGlo 與RF 相比，糊化溫度提高1.4%，峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值分別降低25%、26%、54%和40%；與RF-Alb 相比，糊化溫度提高1.9%，峰值粘度降低11%，終值粘度、崩解值和回生值均無顯著性差異（P>0.05）。該結果表明，脫除球蛋白會提高早秈米粉的糊化溫度并降低其峰值粘度。RF-AGPro 與RF 相比，糊化溫度無顯著性差異（P>0.05），峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值分別降低18%、30%、44%和56%；與RF-AGlo 相比，糊化溫度降低2.3%，峰值粘度提高10%，終值粘度、崩解值和回生值均無顯著性差異（P>0.05）。該結果表明，脫除醇溶蛋白會降低早秈米粉的糊化溫度并提高其峰值粘度。RF-AGPGlu 與RF 相比，糊化溫度、峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值分別降低1.9%、36%、39%、17%和33%；與RF-AGPro 相比，糊化溫度沒有顯著性差異（P>0.05），峰值粘度和終值粘度分別降低22%和12%，崩解值和回生值分別提高49%和53%。該結果表明，脫除谷蛋白會降低早秈米粉的糊化溫度、峰值粘度和終值粘度并提高其崩解值和回生值。

表1 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉成糊特征參數的影響Table 1 Effects of removing endogenous proteins with different solubility on the pasting characteristic parameters of rice flour

圖3 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉成糊曲線的影響Fig.3 Effects of removing different soluble endogenous proteins on the pasting curve of rice flour

由于早秈米粉成糊的糊化溫度、峰值粘度、終值粘度、崩解值和回生值分別代表其糊化所需溫度、與水結合能力、糊化后形成凝膠的能力、顆粒結構破裂程度和回生速度[26]，根據上述分析結果，脫除球蛋白可提高早秈米粉的糊化溫度，而脫除醇溶蛋白和谷蛋白則相反；脫除清蛋白、球蛋白和谷蛋白可抑制早秈米粉與水結合，而脫除醇溶蛋白則相反；脫除清蛋白和谷蛋白可抑制早秈米粉糊化后形成凝膠；脫除清蛋白可抑制早秈米粉顆粒結構破裂和回生，而脫除谷蛋白則相反。

2.4 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉糊水分結合狀態(tài)的影響

低場核磁共振參數橫向弛豫時間T2以1 和40 ms 為界可將水分狀態(tài)區(qū)分為強結合水、弱結合水和自由水[20]。早秈米粉糊化后的弱結合水含量和峰值時間可以反映其與水結合的情況。含量越高，結合水越多；峰值時間越短，與水結合的強度越大[27]。依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白對早秈米粉糊化后弱結合水含量和峰值時間的影響如圖4 所示。與RF 相比，RF-Alb 的弱結合水含量和峰值時間無顯著性差異（P>0.05），說明脫除清蛋白不影響早秈米粉糊化后與水結合的情況。與RF 和RF-Alb相比，RF-AGlo 的弱結合水含量均無顯著性差異（P>0.05），但弱結合水峰值時間分別縮短16%和19%，說明脫除球蛋白會提高早秈米粉糊化后與水結合的強度。與RF 和RF-AGlo 相比，RF-AGPro 的弱結合水含量分別降低7%和無顯著性差異（P>0.05），弱結合水峰值時間分別縮短10%和延長7%，說明脫除醇溶蛋白會降低早秈米粉糊化后與水結合的強度。與RF 和RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的弱結合水含量分別降低21%和14%，弱結合水峰值時間分別縮短45%和38%，說明脫除谷蛋白會顯著降低早秈米粉糊化后的弱結合水含量并提高其與水結合的強度。因此，脫除谷蛋白可降低早秈米粉糊化后的弱結合水含量，而脫除球蛋白和谷蛋白均可提高其糊化后與水結合的強度，但脫除醇溶蛋白則相反。

圖4 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉糊化后弱結合水含量和峰值時間的影響Fig.4 Effects of removing different soluble endogenous proteins on the content and peak time of weakly bound water of gelatinized rice flour

2.5 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉糊流變學特性的影響

流變學參數損耗角正切值tanδ和儲存模量G′與損耗模量G′′之差（G′-G′′）可用于表征早秈米粉糊的流變學特性[28]。tanδ小于1 時體系呈現似固狀態(tài)，反之則呈現似液狀態(tài)[29]。G′-G′′數值越大說明彈性越大，反之則黏性越大[20]。依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白對早秈米粉糊化后流變學特性的影響如圖5 所示，所有樣品的tanδ都小于1，G′-G′都大于0，說明早秈米粉糊化后呈現似固狀態(tài)并表現出彈性。與RF 相比，RF-Alb 的tanδ和G′-G′′均無顯著性差異（P>0.05），說明脫除清蛋白不影響早秈米粉糊化后的流變學特性。與RF 和RF-Alb 相比，RF-AGlo 的tanδ均無顯著性差異（P>0.05），但G′-G′′都降低9%，說明脫除球蛋白不影響早秈米粉糊化后的狀態(tài)，但會降低其彈性。與RF 和RF-AGlo 相比，RF-AGPro 的tanδ分別降低26%和20%，G′-G′′分別提高26%和38%，說明脫除醇溶蛋白會增強早秈米粉糊化后的似固狀態(tài)并提高其彈性。與RF 和RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的tanδ分別降低28%和無顯著性差異（P>0.05），G′-G′′分別降低23%和39%，說明脫除谷蛋白不影響早秈米粉糊化后的狀態(tài)，但會降低其彈性。因此，脫除醇溶蛋白可增強早秈米粉糊化后的似固狀態(tài)，而脫除球蛋白和谷蛋白可降低其彈性，但脫除醇溶蛋白則相反。

圖5 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉糊化后流變學特性的影響Fig.5 Effects of removing different soluble endogenous proteins on rheological properties of gelatinized rice flour

2.6 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉糊凍融穩(wěn)定性的影響

早秈米粉及其依次脫除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白樣品糊化后的凍融穩(wěn)定性如圖6 所示。經過1、3、5 次凍融后，同一樣品的析水率變化很小，但不同樣品間的析水率具有顯著性差異（P<0.05）。以首次凍融后的數據進行對比分析：與RF 相比，RFAlb 的析水率無顯著性差異（P>0.05），說明脫除清蛋白不影響早秈米粉糊化后的凍融穩(wěn)定性；與RF 和RF-Alb 相比，RF-AGlo 的析水率分別提高72%和121%，說明脫除球蛋白會降低早秈米粉糊化后的凍融穩(wěn)定性；與RF 和RF-AGlo 相比，RF-AGPro 的析水率分別提高107%和無顯著性差異（P>0.05），說明脫除醇溶蛋白不影響早秈米粉糊化后的凍融穩(wěn)定性；與RF 和RF-AGPro 相比，RF-AGPGlu 的析水率分別提高223%和56%，說明脫除谷蛋白會降低早秈米粉糊化后的凍融穩(wěn)定性。因此，脫除球蛋白和谷蛋白可降低早秈米粉糊化后的凍融穩(wěn)定性。

圖6 脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉糊化后凍融穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of removing different soluble endogenous proteins on freeze-thaw stability of gelatinized rice flour

3 討論與結論

根據上述研究結果，脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉理化性質的影響表現為：脫除清蛋白會抑制早秈米粉顆粒結構破裂并與水結合形成凝膠，也會抑制其糊化后回生；脫除球蛋白會促進早秈米粉溶解，提高其糊化溫度，抑制其與水結合，提高其糊化后與水結合強度，降低其糊化后的彈性和凍融穩(wěn)定性；脫除醇溶蛋白會在高溫下促進早秈米粉膨脹，降低其糊化溫度，促進其與水結合，降低其糊化后與水結合強度，提高其糊化后的彈性；脫除谷蛋白會促進早秈米粉溶解和在高溫下膨脹，降低其糊化溫度，促進其顆粒結構破裂但抑制其與水結合形成凝膠，促進其糊化后回生，降低其糊化后的弱結合水含量，提高其糊化后與水結合強度，降低其糊化后的彈性和凍融穩(wěn)定性。

脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉理化性質的不同影響不能簡單依據這些內源蛋白質的溶解特性解釋。已有研究表明，大米淀粉的糊化特性受其直鏈淀粉結晶狀態(tài)的影響[30]，而大米粉內源蛋白質會影響淀粉分子之間及直鏈淀粉與脂質的相互作用[31-32]，但不同溶解性大米粉內源蛋白質對淀粉分子結構及其與其他組分相互作用的影響尚未清楚。大米粉內源蛋白質可以形成可抑制大米粉顆粒吸水膨脹、使大米粉糊抗剪切的網絡結構[33-36]，該作用很可能主要由含量最高的谷蛋白發(fā)揮，但本研究結果顯示球蛋白和醇溶蛋白對早秈米粉糊的黏彈性具有不同的顯著性影響。此外，已有研究發(fā)現，難溶于水的醇溶蛋白和谷蛋白經高溫變性后，多肽鏈會舒展開，能提高其水溶性[37]。因此，不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉理化性質的不同影響還需從其與早秈米粉其他內源組分在水熱處理過程中的相互作用變化層面進行深入的研究。本研究工作為今后深入研究提供了線索。

本文得到的研究結論是，脫除不同溶解性內源蛋白質對早秈米粉的溶解度、膨脹度、成糊特性及其糊化后的水分結合狀態(tài)、流變學特性和凍融穩(wěn)定性具有差異化顯著性影響。該研究工作為利用不同溶解性內源蛋白質調控早秈米粉理化性質進而提高早秈米粉制品品質提供了依據。