冷等離子體聯(lián)合L-谷氨酸與鹽脅迫對(duì)紅小豆萌發(fā)富集γ-氨基丁酸的效果及工藝條件

許慶鵬，姜秀杰，張家瑜，魏春紅，周航慶，張東杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

紅小豆是一種高蛋白、低脂肪、多營(yíng)養(yǎng)的小雜糧，在國(guó)際上有“紅珍珠”的美稱。γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在動(dòng)植物中微量存在但具有不可替代的作用。作為植物中一種逆環(huán)境生長(zhǎng)因子，GABA 在植物萌發(fā)生長(zhǎng)階段大量富集。GABA 在動(dòng)物體內(nèi)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，除此之外，還有安神、保肝護(hù)腎、降糖降壓等多種生理功效。GABA 在2009 年被中國(guó)列為新資源食品，并規(guī)定其攝入量不得超過500 mg/d[1]。因此，利用植物富集法開發(fā)GABA 相關(guān)功能性食品更容易得到消費(fèi)者青睞。

豆類的發(fā)芽是一種植物凝集素積累，改善營(yíng)養(yǎng)均衡的最廉價(jià)處理方式。發(fā)芽可以使豆子中大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪分解為小分子，還使其中具有生物功能的活性成分如GABA、多酚等急劇升高。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)以豆類為原料，提供其發(fā)芽所需的一般或特殊環(huán)境條件，使其抗逆環(huán)境基因表達(dá)，影響初級(jí)代謝、次級(jí)代謝物合成，培養(yǎng)成營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的豆芽[2]。周一峰等[3]研究正常發(fā)芽條件下花豆發(fā)芽過程中GABA 的變化，發(fā)現(xiàn)30 ℃浸泡14 h，35 ℃發(fā)芽22 h，GABA 的含量最高為0.40 mg/g。左娜等[4]研究發(fā)現(xiàn)通過谷氨酸鈉、抗壞血酸等誘導(dǎo)黃豆和綠豆發(fā)芽，GABA 富集量分別達(dá)到0.3025 mg/g 和0.2783 mg/g。Jiang 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，真空聯(lián)合谷氨酸鈉脅迫發(fā)芽使紅小豆中的GABA 含量顯著提高，并對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）基因表達(dá)與GABA 的積累呈正相關(guān)。呂秋潔等[6]研究比較了L-谷氨酸（L-Glutamic acid，L-Glu）和谷氨酸鈉（Monosodium glutamate，MSG）誘導(dǎo)紫糙米發(fā)芽，發(fā)現(xiàn)LGlu 較MSG 更利于GABA 的積累。曾晴等[7]研究不同鹽種類對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA 的影響，發(fā)現(xiàn)氯化鈉和氯化鈣脅迫發(fā)芽GABA 含量明顯高于氯化鉀、氯化鎂、氯化鐵等其他鹽類。因此，通過低氧、超聲[8]、凍融[9]、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)等技術(shù)方法生產(chǎn)高GABA 豆芽或者其他食品是可行的且潛力巨大，尤其是在低溫大氣壓等離子體[10]、酸性電生功能水[11]等新興技術(shù)誘導(dǎo)糧食種子發(fā)芽生產(chǎn)高GABA 食品方面缺乏探索性研究。

冷等離子體（Cold Plasma，CP）被認(rèn)為是物質(zhì)的第四種狀態(tài)，僅次于固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)。物理上，它是部分或完全電離的氣體混合物，含有活性物質(zhì)，如激發(fā)態(tài)粒子、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）和OH 自由基[12]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)等離子體和種子發(fā)芽之間的相互作用包括種皮改性、反應(yīng)物種、種子滅菌、熱量和紫外線輻射與分子現(xiàn)象（包括轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控）相關(guān)的表達(dá)，可以促進(jìn)生物活性物質(zhì)積累，提高芽的生物活性[13-14]。因此使用CP 提高豆芽中生物活性成分是芽菜行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)有前途的技術(shù)。與熱加工技術(shù)相比，冷等離子體技術(shù)具有節(jié)能環(huán)保、加工效率高、成本低、適用于大型系統(tǒng)等特點(diǎn)[15]。Chen 等[16]研究了冷等離子體處理對(duì)發(fā)芽糙米中GABA 含量變化的影響，糙米經(jīng)冷等離子體處理（3000 kV，10 min）后發(fā)芽，其GABA 的含量達(dá)到最高為28 mg/100 g。CP 技術(shù)產(chǎn)品種類有很多，其中在大氣壓力下產(chǎn)生的非熱等離子體，稱之冷大氣壓力等離子體（Cold atmospheric pressure plasma，CAPP）[17]?？紤]到未來工廠化生產(chǎn)的簡(jiǎn)便性及可行性，CAPP 的優(yōu)點(diǎn)在于不使用低壓設(shè)備和通入惰性氣體的方法下也可產(chǎn)生等離子體氣體，因此CAPP 更適用于高GABA 芽菜工廠化生產(chǎn)的實(shí)際情況。

目前，CP 已被證明在提高谷物GABA 積累方面具有潛在的作用，但對(duì)發(fā)芽豆類的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究CAPP 處理對(duì)紅小豆發(fā)芽期GABA 的影響，為冷等離子體技術(shù)在提高谷物活性物質(zhì)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。利用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)CAPP處理的紅小豆發(fā)芽培養(yǎng)液進(jìn)行優(yōu)化，以期為高GABA芽菜生產(chǎn)提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅小豆 品種珍珠紅，大小均勻，直徑約0.5 cm，大慶農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)置；γ-氨基丁酸（≥99.9%）Sigma公司；次氯酸鈉、苯酚、乙醇、硼酸 分析純，上海陸都化學(xué)試劑廠。

HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科興儀器廠；CPX3800H-C 超聲波清洗機(jī) EMERSON 公司；TU-1810PC 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LPWS 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海陸譜科技有限公司；CPS-1 型大氣壓冷等離子體殺菌機(jī) 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)協(xié)同蘇州屹潤(rùn)食品科技有限公司及南京屹潤(rùn)等離子科技有限公司聯(lián)合開發(fā)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅小豆處理及萌發(fā)工藝流程 紅小豆種子→等離子體處理→培養(yǎng)液浸泡→培養(yǎng)箱發(fā)芽→測(cè)定芽豆GABA

1.2.2 冷等離子體處理 將隨機(jī)選取的紅小豆種子（每組約200 個(gè)）置于樣品盒中平鋪成一層，將樣品盒塑封。打開箱門，將樣品盒放在移動(dòng)平臺(tái)上緩慢上升至極板距離為40 mm 處，設(shè)置冷等離子處理?xiàng)l件為：電壓90 kV，頻率120 Hz，反應(yīng)時(shí)間20 min（放電時(shí)間60 s/次，放電次數(shù)20 次）。關(guān)閉箱門，開始反應(yīng)。

1.2.3 培養(yǎng)液浸泡 將冷等離子體處理的紅小豆清水洗5 遍并除去懸浮癟粒，然后用0.1%的次氯酸鈉浸泡20 min，用蒸餾水沖洗3 遍，分別用CaCl2溶液、NaCl 溶液、L-Glu 溶液和蒸餾水浸泡15 h。

1.2.4 培養(yǎng)箱發(fā)芽 將浸泡后的紅小豆放入發(fā)芽盒，蓋上4 層紗布，放入溫度35 ℃濕度85%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均每2 h 向培養(yǎng)箱中紅小豆噴淋1 次相應(yīng)溶液。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 冷等離子體處理時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為：0 min（放電時(shí)間60 s/次，放電次數(shù)0 次）、10 min（放電時(shí)間60 s/次，放電次數(shù)10 次）、20 min（放電時(shí)間60 s/次，放電次數(shù)20 次）、30 min（放電時(shí)間60 s/次，放電次數(shù)30 次）。使用蒸餾水培養(yǎng)液浸泡和噴淋，放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每12 h 取一次樣，測(cè)定紅小豆GABA 含量。

我?guī)е?，走在海邊，腦子里又想起了自己童年時(shí)的那片海，想起了海邊的那幾塊礁石。小時(shí)候，我們還常常爬到礁石上玩，可現(xiàn)在礁石不見了，有人說它們被淹沒到了海水里，有人說它們被加工成了度假村里的假山，也有人說它們被沖到另一個(gè)海灘去了……

1.2.5.2 冷等離子體處理電壓對(duì)GABA 含量的影響 控制等離子體頻率120 Hz，反應(yīng)時(shí)間20 min，設(shè)置電壓為：30、60、90、120 kV。使用蒸餾水培養(yǎng)液浸泡和噴淋，放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每12 h 取一次樣，測(cè)定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.3 冷等離子體處理頻率對(duì)GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，反應(yīng)時(shí)間20 min，設(shè)置頻率為：60、90、120、150 Hz。使用蒸餾水培養(yǎng)液浸泡和噴淋，放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每12 h 取一次樣，測(cè)定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.4 NaCl 濃度對(duì)GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，反應(yīng)時(shí)間20 min。培養(yǎng)液分別使用25、50、75 mmol/L 的NaCl 溶液浸泡和噴淋，放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每12 h 取一次樣，測(cè)定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.5 CaCl2濃度對(duì)GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，反應(yīng)時(shí)間20 min。培養(yǎng)液分別使用2、4、6 mmol/L 的CaCl2溶液浸泡和噴淋，放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每12 h 取一次樣，測(cè)定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.6 L-Glu 濃度對(duì)GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，反應(yīng)時(shí)間20 min。培養(yǎng)液分別使用1、2、3 mg/mL 的L-Glu 溶液浸泡和噴淋，放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每12 h 取一次樣，測(cè)定紅小豆GABA 含量。

1.2.6 紅小豆芽培養(yǎng)液優(yōu)化設(shè)計(jì) 通過對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，按照Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以GABA 含量為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)芽時(shí)間、CaCl2濃度、L-Glu 濃度、NaCl 濃度四個(gè)因素分別取三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，通過Design Expert 13 軟件對(duì)29 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)等離子體處理富集γ-氨基丁酸的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 GABA 含量測(cè)定 參照姜秀杰等[18]的方法稍作修改，將樣品烘干粉碎，過100 目篩。用蒸餾水定容到50 mL（樣品為1.0 g），30 ℃超聲提取2 h，濾紙過濾。8000 r/min 離心10 min，取上清液備用。將GABA 標(biāo)品配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液或樣品上清液1 mL，加入1 mL 硼酸緩沖溶液（pH9.0），2 mL 5%重篜酚溶液（w/v），1 mL 10%次氯酸鈉溶液，充分混勻。沸水浴10 min，冰水浴降溫約15 min，溶液顏色由黃色慢慢變?yōu)樗{(lán)綠色，待化合物顏色穩(wěn)定后加入60%乙醇2 mL，再次混合均勻。645 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 未處理與不同CAPP 時(shí)間處理對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響

本實(shí)驗(yàn)中從種子吸水達(dá)到飽和的狀態(tài)開始計(jì)時(shí)，即發(fā)芽0 h。在正常發(fā)芽情況下，發(fā)芽72 h 紅小豆的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段基本結(jié)束并開始生殖生長(zhǎng)階段[19]，此時(shí)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變不再適合人類食用，因此發(fā)芽時(shí)間在72 h 之后的芽豆不再測(cè)定GABA。

GABA 屬于抗逆環(huán)境的活性物質(zhì)，起促進(jìn)生長(zhǎng)代謝作用，隨發(fā)芽時(shí)間不斷延長(zhǎng)，在芽成熟后植物體內(nèi)便也達(dá)到平衡狀態(tài)[20-21]。觀察未處理與處理組紅小豆發(fā)芽過程中GABA 富集量的變化見圖1，在發(fā)芽0～72 h 內(nèi)，紅小豆在正常發(fā)芽條件（未等離子體處理）下，隨發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)GABA 含量不斷增加；CAPP 處理的紅小豆隨發(fā)芽時(shí)間的增加GABA 含量不斷增加，但在發(fā)芽48 h 后不再明顯升高。造成這種現(xiàn)象的原因是等離子體可以縮短種子萌發(fā)期，F(xiàn)ilatova 等[22]研究等離子體有促進(jìn)種子早熟作用，結(jié)果表明石竹種子在等離子體作用下，種子胚內(nèi)的生命物質(zhì)被激活，種皮軟化，從而加快了種子萌發(fā)和出苗的速度。

圖1 未處理和不同CAPP 時(shí)間對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響Fig.1 Effects of untreated and different CAPP time treatments on GABA content during germination of adzuki bean

未處理與不同CAPP 時(shí)間處理的紅小豆在同一發(fā)芽時(shí)間GABA 富集量的變化見圖1。在發(fā)芽0～24 h 階段，正常發(fā)芽的紅小豆GABA 含量緩慢上升，而等離子體處理組GABA 含量增加明顯。造成該現(xiàn)象的原因可能是CAPP 處理的紅小豆吸水速度快，吸水程度高，快速激活了種子中的內(nèi)源酶。種子吸收水分程度取決于三個(gè)因素：種子的組成、種皮的濕潤(rùn)性和水分[23]。相同種子和水分情況下，等離子體處理可以改變種子表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)和粗糙度，導(dǎo)致種子的濕潤(rùn)性發(fā)生巨大變化。已有研究證實(shí)空氣等離子體處理后種皮與水的表觀接觸角急劇減小，導(dǎo)致種子的濕潤(rùn)性增加[24-25]。ALVES JUNIOR 等[26]更深入研究等離子體處理對(duì)豆科種子吸水兩大部位（珠孔和肺門）的變化，發(fā)現(xiàn)離子體處理增加肺門的水分吸收量，同時(shí)珠孔表現(xiàn)出更開放的形態(tài)。在發(fā)芽24～48 h 時(shí)，CAPP 處理20 min 和30 min 的紅小豆GABA富集效果都較好。在發(fā)芽48～72 h 時(shí)，只有CAPP處理20 min 組的GABA 富集效果較好，且含量較高。造成這種情況的原因可能是等離子體處理種子的時(shí)間越長(zhǎng)，ROS 和RNS 對(duì)種子的刺激越大，傷害越深。因此，在紅小豆發(fā)芽前期等離子體刺激越大合成GABA 越多。當(dāng)?shù)入x子體時(shí)間為20 min，在發(fā)芽48 h 就達(dá)到頂峰，為104.601±1.192 mg/100 g。發(fā)芽72 h 時(shí)最高為106.718±1.030 mg/100 g，但從成本方面考慮選擇等離子體處理時(shí)間為20 min，發(fā)芽時(shí)間48 h。

2.2 CAPP 電壓對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響

控制冷等離子體裝置的時(shí)間為20 min，頻率為120 Hz 不變，觀察紅小豆正常發(fā)芽與不同等離子體電壓在發(fā)芽過程中GABA 富集量的變化。由圖2可知，使用不同電壓等離子體處理的紅小豆，其GABA 含量隨發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，最后趨于平衡。其中等離子體電壓為120 kV 處理紅小豆，其GABA 含量呈先上升后下降趨勢(shì)。除電壓為120 kV外，各組等離子處理的紅小豆都呈上升趨勢(shì)，且電壓越大，紅小豆GABA 含量越高。原因可能是種子在等離子體處理過程中，電壓越高空氣被電離的混合物越多，混合物中多種活性基團(tuán)和粒子能夠與種皮及表面微生物的發(fā)生更強(qiáng)烈的反應(yīng)[27]，從而促進(jìn)種子吸水，阻礙微生物生長(zhǎng)，使種子更易發(fā)芽，GABA 含量升高。若對(duì)紅小豆離子體處理電壓過高，則沒有上述的生長(zhǎng)代謝趨勢(shì)，反而有部分的豆子表面出現(xiàn)明顯的電流打擊的傷痕，其傷口破壞了豆子的免疫屏障，容易被有害微生物入侵。當(dāng)?shù)入x體電壓為120 kV，紅小豆發(fā)芽時(shí)間為24～72 h 階段內(nèi)，其GABA 呈先下降后不變的趨勢(shì)，說明電壓過大時(shí)對(duì)種子的萌發(fā)以及GABA 富集有抑制作用，其抑制機(jī)理有待深入研究。何瑞等[28]研究也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果，當(dāng)大氣壓等離子體處理電壓為3.4 kV 時(shí)最有利于穿心蓮種子萌發(fā)，繼續(xù)加大電壓，當(dāng)大氣壓等離子體處理電壓為5.95 kV 時(shí)則對(duì)穿心蓮種子的萌發(fā)有強(qiáng)烈抑制作用。因此控制一個(gè)合適的等離子體電壓才能最有利于種子萌發(fā)，針對(duì)不同種子其最佳等離子體電壓也不同。因此，針對(duì)CAPP 處理紅小豆種子最佳電壓為90 kV。

圖2 CAPP 電壓對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響Fig.2 Effect of CAPP voltage on GABA content during germination of adzuki bean

2.3 CAPP 頻率對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響

控制冷等離子體裝置的時(shí)間為20 min，電壓為90 kV 不變，觀察不同等離子體頻率條件下紅小豆發(fā)芽過程中GABA 富集量的變化。由圖3 可知，不同頻率的等離子體處理紅小豆，隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，其GABA 含量呈先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)。等離子體處理頻率越高其GABA 富集的含量也越高。120 Hz 和150 Hz 等離子體處理紅小豆，發(fā)芽48 h 之后GABA含量分別達(dá)到最高為104.601±1.192 mg/100 g 和101.467±2.225 mg/100 g，兩者無(wú)顯著性差異，繼續(xù)發(fā)芽其GABA 含量也無(wú)明顯變化。已有研究表明通過優(yōu)化原料基質(zhì)特性（如水分含量）和調(diào)整等離子體電源設(shè)置（電壓，頻率）以增加反應(yīng)物質(zhì)的產(chǎn)生，可以提高微生物滅活效率[29]。但因紅小豆表面呈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，具有空隙和波紋化的粗糙表面可以在一定程度上保護(hù)植物細(xì)胞和表面微生物免受等離子體產(chǎn)生的ROS 和RNS 侵害[30]。改變冷大氣壓等離子體機(jī)器的頻率是加速種子吸水，發(fā)芽，增加植物幼苗生長(zhǎng)的有效手段。頻率小于90 Hz 時(shí)等離子體的處理效率較低，對(duì)微生物抑制作用較低，對(duì)刺激紅小豆發(fā)芽作用也較弱，頻率在120～150 Hz 時(shí)等離子體處理對(duì)紅小豆的刺激較大，有利GABA 的富集。因此，為延長(zhǎng)機(jī)器使用壽命，等離子體處理紅小豆的最佳頻率為120 Hz。

2.4 NaCl 對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響

將等離子體處理的紅小豆分為4 組，依次噴灑不同濃度的NaCl 溶液，觀察不同濃度NaCl 溶液處理的紅小豆發(fā)芽過程中GABA 的富集情況。由圖4可知，CAPP+NaCl 處理組的GABA 含量高于等離子體處理組。隨著NaCl 的濃度增加，GABA 的含量呈先升高后減小的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間為48 h，NaCl 濃度為50 mmol/L 時(shí)，GABA 含量達(dá)到最高為122.456±1.888 mg/100 g。這是因?yàn)镹aCl 對(duì)植物富集GABA的兩條途徑都有促進(jìn)效果。AL-QURAAN 等[31]研究NaCl 對(duì)發(fā)芽小麥進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)5 個(gè)品種小麥的GAD基因表達(dá)上調(diào)。因此，在GABA 支路途徑中NaCl 會(huì)上調(diào)紅小豆GAD的相關(guān)基因表達(dá)，提高GAD酶活性，富集GABA。在多胺降解途徑中，XING等[32]研究表明在NaCl 處理下，大豆胚根的二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）活性增強(qiáng)，促進(jìn)多胺（Polyamines，PAS）降解，富集GABA。Yang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)NaCl 處理使豆芽氨基醛脫氫酶（Aminoaldehyde dehydrogenase，AMADH）、GAD 和DAO活性分別提高了39.7%、28.4%和21.2%。除此之外，還有研究表明NaCl 刺激植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激，不僅會(huì)提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，還能增加苯丙氨酸氨裂解酶，肉桂酸4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A 連接酶的活性和表達(dá)，這些反應(yīng)與表達(dá)也會(huì)減小GABA 合成抑制劑的作用[34-35]。因此，25～75 mmol/L 的NaCl 培養(yǎng)液有利于CAPP 紅小豆富集GABA，50 mmol/L NaCl 培養(yǎng)液效果最佳。

2.5 CaCl2 對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響

將正常發(fā)芽的紅小豆分為4 組，依次噴灑不同濃度的CaCl2溶液，觀察不同濃度CaCl2溶液處理的紅小豆發(fā)芽過程中GABA 的富集情況。由圖5可知，CAPP+CaCl2處理的豆子隨發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)，GABA 呈先升高后降低的趨勢(shì)。2 和4 mmol/L CaCl2處理的紅小豆在發(fā)芽在48 h 后才有明顯差異，4 mmol/L CaCl2處理的紅小豆富集效果更好。4 mmol/L CaCl2處理的紅小豆在發(fā)芽48 h 時(shí)達(dá)到最高為114.62±1.593 mg/100 g。植物中的GABA 合成主要來自GABA 支路中由谷氨酸脫羧酶（GAD）催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應(yīng)[36]。GAD 是一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴型酶，具有一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)，其活性受Ca2+/Ca M 控制[37]。王珊珊等[38]研究表明提高培養(yǎng)液中Ca2+濃度，促進(jìn)Ca M 區(qū)域與鈣離子結(jié)合可以提高GAD 的活性，從而加快谷氨酸合成GABA。朱云輝等[39]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度達(dá)到6.0 mmol/L 時(shí)，發(fā)芽苦蕎中GABA 含量達(dá)到最大，此后隨著Ca2+濃度增大，GABA 含量呈減小趨勢(shì)。因此，CaCl2在2～6 mmol/L范圍內(nèi)處理紅小豆發(fā)芽有助于富集GABA，4 mmol/L的CaCl2培養(yǎng)液效果最佳。

圖5 CaCl2 對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響Fig.5 Effect of CaCl2 on GABA content during germination of adzuki bean

2.6 L-Glu 對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響

將正常發(fā)芽的紅小豆分為4 組，依次噴灑不同濃度的L-Glu 溶液，觀察不同濃度L-Glu 溶液處理的CAPP 紅小豆發(fā)芽過程中GABA 的富集情況。由圖6 可知，隨發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA 的含量呈先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)使用L-Glu 濃度為1、2 mg/mL處理CAPP 紅小豆時(shí)，發(fā)芽48 h 達(dá)到最大為117.518±1.634、118.264±1.804 mg/100 g。L-Glu 是谷氨酸脫羧酶（GAD）的唯一底物[40]。在外源溶液中添加LGlu 可以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，增加底物從而增加GABA 含量。長(zhǎng)時(shí)間限制谷氨酰胺合成，或減少蛋白質(zhì)合成，或增加蛋白質(zhì)降解，可使GABA 富集，這是由于谷氨酸含量增多可使GABA支路中碳流量增加，并調(diào)節(jié)谷氨酸脫羧酶的活性[41]。陳慧等[42]用1.0 mg/mL 的MSG 溶液處理蠶豆發(fā)芽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAD 活性變化趨勢(shì)與GABA 含量變化相似。因此，使用1～3 mg/mL 的L-Glu 培養(yǎng)液可以提高紅小豆GAD 的酶活，增加GABA 含量。2 和3 mg/mL 的L-Glu 培養(yǎng)液效果都較好，且差別不大。

圖6 L-Glu 對(duì)紅小豆發(fā)芽過程中GABA 含量的影響Fig.6 Effect of L-Glu on GABA content during germination of adzuki bean

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化GABA 富集工藝

2.7.1 回歸模型的建立及方差分析 通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)冷等離子體處理90 kV，120 Hz，20 min 紅小豆種子有利于發(fā)芽和富集GABA，且NaCl、CaCl2和L-Glu 溶液三種誘導(dǎo)環(huán)境下，紅小豆發(fā)芽后GABA 的富集量都明顯提高。確定了4 個(gè)因素對(duì)L-Glu 聯(lián)合鹽脅迫發(fā)芽CAPP 紅小豆富集GABA 的影響的4 水平，對(duì)29 個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)量，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

在此基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 13 軟件對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，并建立回歸模型，得出二元回歸方程為：

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。由表3 可知，一次項(xiàng)A、D 與交互項(xiàng)AD 和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2表現(xiàn)為高度顯著（P<0.01），一次項(xiàng)B 與交互項(xiàng)CD表現(xiàn)為顯著（P<0.05）。模型總體極顯著（P<0.0001），說明預(yù)測(cè)結(jié)果與真實(shí)結(jié)果有相關(guān)性，決定系數(shù)R2=0.8970，失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說明殘差是由隨機(jī)誤差引起。因此可知該模型擬合度較高，且誤差在可接受范圍內(nèi)，表明可用于預(yù)測(cè)L-Glu 聯(lián)合鹽脅迫發(fā)芽CAPP 紅小豆富集GABA 工藝參數(shù)。根據(jù)二元回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小，判定各因素對(duì)響應(yīng)值影響的主次順序?yàn)榘l(fā)芽時(shí)間（A）>NaCl 濃度（D）>CaCl2濃度（B）>L-Glu 濃度（C）。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with response surface regression model

2.7.2 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)面是用于描述因素與響應(yīng)值之間關(guān)系的三維空間曲面圖，可直觀反映出各因素之間的交互作用，及其對(duì)L-Glu 聯(lián)合鹽脅迫發(fā)芽富集CAPP 紅小豆GABA 含量的影響程度。圖7～圖8 呈現(xiàn)的是對(duì)紅小豆富集GABA 有顯著交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)面坡度越陡峭，則表明響應(yīng)值越敏感。

圖7 發(fā)芽時(shí)間和NaCl 濃度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of the interaction between germination time and NaCl concentration

圖8 CaCl2 和NaCl 濃度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots of the interaction between CaCl2 and NaCl concentrations

發(fā)芽時(shí)間、NaCl 濃度二次項(xiàng)對(duì)發(fā)芽紅小豆GABA 含量有顯著影響，且等高線圖呈橢圓狀。由圖7 可知，A、D 因素在較高水平條件下，響應(yīng)值隨著每個(gè)因素水平的增大而增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，又逐漸減小。由于GABA 是紅小豆在發(fā)芽時(shí)期合成的抗逆環(huán)境活性物質(zhì)，尤其是在胚部分含量較多，隨著胚芽發(fā)育其不斷合成，當(dāng)胚芽發(fā)育成熟其GABA 含量便不會(huì)明顯增加。還有一種觀點(diǎn)也認(rèn)為NaCl 濃度增加會(huì)促進(jìn)紅小豆合成GABA，尹永祺等[43]研究發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫下多胺降解途徑對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA 貢獻(xiàn)率大于30%。但鹽離子濃度過高，超過植物承受的極限，就會(huì)導(dǎo)致GABA 的含量降低，最終表現(xiàn)為GABA 含量增加到極點(diǎn)后又逐漸減少。由圖8 可知，NaCl 濃度和CaCl2濃度都增加對(duì)發(fā)芽紅小豆GABA 含量明顯提高，呈相互促進(jìn)作用。任珺等[44]研究發(fā)現(xiàn)CaCl2有助于苦豆子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，有減輕鹽脅迫的作用。當(dāng)外源Na+將細(xì)胞質(zhì)膜上的Ca2+取代，引起Na+濃度增加，Na+/Ca2+比值的平衡遭到破壞，此時(shí)外源Ca2+會(huì)通過細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜的鈣通道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)Ca M 區(qū)域與鈣離子結(jié)合提高GAD 的活性，從而加快谷氨酸合成GABA[45]。外源Ca2+的施加也能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)K+和NO3-的吸收，補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)Ca2+的不足，保護(hù)膜的穩(wěn)定性，降低鹽脅迫下離子毒害作用[46]。

2.7.3 最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證 利用Design-Expert 13 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行典型分析得到：發(fā)芽時(shí)間A=0.810551、CaCl2濃度B=0.179352、L-Glu 濃度C=0.21802、NaCl 濃度D=0.638318，將四個(gè)因素編碼值轉(zhuǎn)換成實(shí)際值為：發(fā)芽時(shí)間57.72 h、CaCl2濃度4.36 mmol/L、L-Glu 濃度3.22 mg/mL、NaCl 濃度65.95 mmol/L，上述為L(zhǎng)-Glu 聯(lián)合鹽脅迫發(fā)芽富集CAPP 紅小豆GABA 的最優(yōu)工藝參數(shù)，在此條件下發(fā)芽CAPP 紅小豆的GABA 含量是166.111 mg/100 g，為了驗(yàn)證回歸分析的可靠性，將前期回歸模型優(yōu)化工藝參數(shù)調(diào)整為：發(fā)芽時(shí)間58 h、CaCl2濃度4.4 mmol/L、L-Glu 濃 度3.2 mg/mL、NaCl 濃 度66 mmol/L。按照上述最優(yōu)發(fā)芽條件參數(shù)進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出發(fā)芽CAPP 紅小豆GABA 含量的實(shí)際值是（160.23±2.91 mg/100 g），理論值與實(shí)際值的相對(duì)誤差僅為3.54%，說明上述模型擬合較好，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用大氣壓冷等離子體裝置處理紅小豆種子聯(lián)合鹽脅迫的方法探究對(duì)其發(fā)芽富集GABA 的影響，發(fā)現(xiàn)大氣壓冷等離子體90 kV，120 Hz，20 min處理的紅小豆種子最有利于發(fā)芽富集GABA。NaCl、CaCl2和L-Glu 都具有誘導(dǎo)豆類發(fā)芽富集GABA 的作用，且NaCl>CaCl2>L-Glu。再利用響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件為發(fā)芽時(shí)間58 h、CaCl2濃度4.4 mmol/L、LGlu 濃度3.2 mg/mL、NaCl 濃度66 mmol/L，此條件下發(fā)芽CAPP 紅小豆GABA 含量為160.23±2.91 mg/100 g，是原料紅小豆GABA（22.5±0.2 mg/100 g）的7.12 倍。說明CAPP 紅小豆在發(fā)芽過程中，輔以L-谷氨酸和鹽處理，可有效提高GABA 富集量，進(jìn)一步證明了萌芽有利于提升紅小豆中營(yíng)養(yǎng)活性成分，為合理利用雜糧豆類資源以及開發(fā)高GABA 功能食品提供新的思路和理論支持。但對(duì)于L-谷氨酸聯(lián)合鹽脅迫CAPP 紅小豆發(fā)芽富集GABA 過程中體內(nèi)的離子濃度及酶活力的變化未進(jìn)一步探究，為深入了解紅小豆發(fā)芽富集GABA 機(jī)制，后續(xù)可對(duì)GABA 合成相關(guān)酶的酶活及代謝途徑進(jìn)行研究。