人腸道乳酸片球菌的分離鑒定及其發(fā)酵枸杞汁性能分析

李曉靜，魏曉博，程 雪，張志剛，劉洪濤，劉慧燕,，方海田,

（1.寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430065）

枸杞中含有多種活性成分。其中枸杞多糖是最豐富的活性成分，具有豐富的藥理活性和保健活性[1]，如降血糖、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用[2-3]。枸杞中的有效成分可以改善腸道微生物群的組成和豐度[4]，而枸杞對(duì)腸道微生物組、微生物代謝產(chǎn)物及其相互作用的影響的研究仍然非常有限[5]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，進(jìn)入并定植在胃腸道后，能夠與宿主共生，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境[6]。乳酸菌不僅可以調(diào)節(jié)人體代謝平衡，還是發(fā)酵產(chǎn)品中的主要微生物[7]，其在發(fā)酸過程中，不僅可以改善食品本身帶有的氣味及產(chǎn)品特性，還可以提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8-10]。此外，乳酸菌在發(fā)酵過程中，產(chǎn)生大量的蛋白酶及各種微量的脂肪酶，可將食品中的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)和脂肪降解為更易被人體吸收的小分子氨基酸及脂肪酸等。其自身不僅可以合成維生素B1、B2、B3、B5 等，還可以產(chǎn)生某些游離氨基酸或氨基酸衍生物，抑制丙烯疏胺的合成[11-12]。乳酸菌在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛，常被用來發(fā)酵酸奶及其他乳制品、蔬菜以及肉制品等[13]。由于枸杞自身并沒有突出的香味，并且藥味濃重，使用商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的枸杞汁風(fēng)味和口感不佳，影響了乳酸菌發(fā)酵枸杞汁飲品的生產(chǎn)和市場(chǎng)開發(fā)[14]。因此，開發(fā)新的發(fā)酵劑來改善枸杞汁的藥味濃重和口感不佳具有重要意義，而從人腸道篩選一株安全、有益且發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌的相關(guān)研究較少。

本研究從人腸道分離篩選乳酸菌，通過形態(tài)觀察、分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其耐酸、耐膽鹽及發(fā)酵性能進(jìn)行測(cè)定，篩選性能優(yōu)良的乳酸菌，最后將其應(yīng)用到發(fā)酵枸杞汁中。對(duì)發(fā)酵前后的枸杞汁中多糖、還原糖及抗氧化能力進(jìn)行對(duì)比分析，以期改善發(fā)酵枸杞汁的品質(zhì)和風(fēng)味，為發(fā)酵枸杞汁的工業(yè)化生產(chǎn)和新發(fā)酵劑的制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞 寧夏中寧枸杞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院提供（采收時(shí)間：2021 年6 月）；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；6%苯酚、濃硫酸、3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）、0.2 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、30 mmol/L 吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）、338 μmol/L 還原型輔酶Ⅰ（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、72 μmol/L 氯化硝基四氮唑藍(lán)（Nitrotetrazolium blue chloride，NBT）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖 北京擎科生物科技有限公司；牛膽鹽、HCl 特正商貿(mào)有限公司；MRS 培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海生物技術(shù)有限公司。

BXM-30R 壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó) BIORAD 公司；BIO-RAD CFX96 梯度PCR 儀 美國(guó)BIO-RAD 公司；FR980 恒溫培養(yǎng)箱 上海復(fù)日科技有限公司；SpectraMax iD3 多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器上海有限公司；S210 pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離篩選 招募3 位無消化系統(tǒng)疾病的志愿者，并且最近3 個(gè)月沒有接受抗生素治療。制備10%（w/v）人類糞便懸液：稱取2 g 新鮮人類糞便，在超凈臺(tái)中加入10 mL 無菌PBS 旋渦1～5 min，使糞便充分打散，釋放腸道微生物。500 r/min 離心5 min，使糞便中的渣滓沉降至管底，取上清至Ep 管中，再加入PBS 渦旋離心，使糞便中的渣滓沉降至管底，取上清至50 mL 無菌Ep 管中，得到人糞便菌懸液[15]。

將人糞便菌懸液用無菌PBS 稀釋至10-6、10-7、10-8，分別涂布于MRS 固體平板。37 ℃培養(yǎng)24～36 h后，在平板中選取形態(tài)、顏色、大小不同的單菌落，進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，以提高菌株的純度[16]。

1.2.2 革蘭氏染色 將菌種進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑單菌液體培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色，菌液涂片固定。滴加結(jié)晶紫后，染色1 min，水洗。滴加碘液后染色1 min，水洗。用95%的酒精脫色約30 s，水洗，吸去水分。滴加番紅后，染色1 min，水洗。吸干或在空氣中涼干后，油鏡鏡檢[17]。

1.2.3 菌株鑒定 初步鑒定：根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]有關(guān)細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性等對(duì)分離出的菌株進(jìn)行鑒定。

采用16s rDNA 基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以乳酸片球菌NXU-220218、NXU-220219、NXU-220220菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，正反向引物為8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反應(yīng)體系為（20 μL）：模板DNA 2 μL，KOD 酶（5 U/μL）0.4 μL，10×KOD buffer 2 μL，2 mmol/L d NTPs 2 μL，引物（F+R）1.2 μL。MgSO41.2 μL，dd H2O 11.2 μL，PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸。得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳。確認(rèn)聚合酶反應(yīng)擴(kuò)增片段，若PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1800 bp 左右，則可送測(cè)序，將16s rDNA 序列于NCBI 進(jìn)行BLAST同源序列檢索[19-20]，比較篩出菌株與已知菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和系統(tǒng)地位，如果同源性大于99%，則確認(rèn)為同一類細(xì)菌，借助Mega X 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹[21-22]。

1.2.4 乳酸菌生長(zhǎng)曲線 取2%乳酸菌懸液接種于MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，從0 h 開始，每隔2 h取樣一次，用分光光度法（波長(zhǎng)600 nm）測(cè)吸光度值（OD）。以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，一種菌液每次取樣做三次重復(fù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作生長(zhǎng)曲線[23]。

1.2.5 乳酸菌產(chǎn)酸能力 取2%乳酸菌菌懸液接種于MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，從0 h 開始，每2 h取樣一次，測(cè)定其pH。以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，一種菌液每次取樣做三次重復(fù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH 為縱坐標(biāo)，制作產(chǎn)酸曲線[24]。

1.2.6 乳酸菌耐酸能力 用鹽酸將MRS 液體培養(yǎng)基pH 調(diào)至2.0，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。按合適的接種量將菌懸液接種到pH 為2.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4 h，每種乳酸菌做三個(gè)重復(fù)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定各個(gè)乳酸菌的活菌數(shù)。與未經(jīng)過酸化的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株作對(duì)比，計(jì)算乳酸菌的相對(duì)生長(zhǎng)比率[25]，即存活率。

式中：N1為酸耐受前的活菌數(shù)，CFU/mL；N2為酸耐受4 h 的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.7 乳酸菌耐膽鹽能力 取一定的牛膽鹽于MRS 液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%（空白）、0.3%、0.5%和0.7%，調(diào)節(jié)pH 至6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。按合適的接種量將菌懸液分別接種至不同濃度牛膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～36 h 后觀察不同濃度膽鹽培養(yǎng)液中菌株的生長(zhǎng)情況，測(cè)定其波長(zhǎng)為600 nm 時(shí)OD 值，計(jì)算乳酸菌在膽鹽中的存活能力[26]。

式中：N0為未加牛膽鹽的OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm；N1為添加不同濃度牛膽鹽的OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm。

1.2.8 乳酸菌對(duì)人工胃液和人工腸液耐受性實(shí)驗(yàn)人工胃液的配制：NaCl 0.20%、胃蛋白酶0.30%，HCl調(diào)pH 至2.5，用孔徑0.20 μm 微孔濾膜過濾除菌，制得人工胃液備用[27]。

人工腸液制備：胰腺液：胰蛋白酶0.10%，調(diào)pH至8.0，過濾除菌備用。膽液：膽鹽1.80%，調(diào)pH 至8.0，過濾除菌備用。將胰腺液和膽液以2:1 混合即為人工腸液[28]。

按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到pH 為2.5 的人工胃液中混勻，37 ℃、100 r/min 搖床中培養(yǎng)，分別于0、1、2、3 h 后取樣，在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其透光率，并進(jìn)行乳酸菌活菌計(jì)數(shù)。

按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到人工腸液，混勻，37 ℃、100 r/min 搖床培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4 h后取樣，在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其透光率，并進(jìn)行乳酸菌活菌計(jì)數(shù)。

1.2.9 乳酸菌發(fā)酵枸杞汁的制備 將枸杞和水以1:10 的比例混合浸泡5～6 h，加入0.15%（w/v）的果膠酶進(jìn)行打漿，然后進(jìn)行過濾除籽，并用檸檬酸將枸杞汁的pH 調(diào)至4.5 左右，混勻后進(jìn)行65 ℃，30 min水浴巴氏殺菌。冷卻至室溫后將培養(yǎng)好的乳酸菌菌懸液按5%的接種量接入枸杞汁中，輕輕搖晃，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。對(duì)發(fā)酵前后的枸杞汁進(jìn)行多糖、還原糖含量測(cè)定、抗氧化性實(shí)驗(yàn)。

1.2.10 枸杞汁中含糖量的測(cè)定

1.2.10.1 枸杞汁中多糖含量的測(cè)定 使用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量[29-30]。取待測(cè)樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品0.3 mL，在冰水浴中加入0.2 mL 6%苯酚溶液；振蕩搖勻后迅速加入1 mL 濃硫酸，加入后迅速在冰上轉(zhuǎn)動(dòng)試管，加速熱量釋放，以不放熱或微量放熱為宜?；靹蚝蠓兴?0 min，冷卻至室溫。酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。每孔加樣加入150 μL 測(cè)定液，在490 nm測(cè)定各孔吸光度。

1.2.10.2 枸杞汁中還原糖含量的測(cè)定 使用DNS法測(cè)定還原糖[31]，取待測(cè)樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品0.4 mL，加入0.8 mL DNS 試劑，混勻后沸水浴5 min，冷卻至室溫。酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。每孔加樣加入150 μL 測(cè)定液，在最大吸收波長(zhǎng)處（540 nm）測(cè)定各孔吸光度。

1.2.11 枸杞汁抗氧化能力的測(cè)定

1.2.11.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參考Bai 等[32]報(bào)道方法略有修改，在試管中先加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH 甲醇溶液，再加入枸杞樣品溶液2 mL，混勻后于37 ℃，避光反應(yīng)30 min，517 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算DPPH 自由基的清除率。

式中，Ac：2 mL PBS+2 mL DPPH 甲醇溶液的吸光值；As：2 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 甲醇溶液的吸光值。

1.2.11.2 超氧陰離子自由基清除活性測(cè)定 參考馬妮等[33]的方法，向96 孔板中依次加入50 μL 338 μmol/L NADH 溶液和50 μL 30 mmol/L PMS溶液，充分混勻后加入50 μL 72 μmol/L NBT 溶液，混勻后加入50 μL 不同發(fā)酵時(shí)間枸杞樣品，混勻后室溫反應(yīng)15 min，在560 nm 處測(cè)定吸光度，記為As，用相同體積的PBS 溶液代替樣品溶液，測(cè)定其吸光值，記為Ac。

式中，Ac：對(duì)照組吸光度；As：樣品組吸光度。

1.2.12 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 為進(jìn)行發(fā)酵枸杞汁的感官評(píng)價(jià)，由12 名均具有食品感官研究背景的老師和學(xué)生組成感官評(píng)定小組，對(duì)發(fā)酵枸杞汁的色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)等進(jìn)行1～10 分評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；Excel 2020 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；用Graph Pad Prism 8.0.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人腸道乳酸菌的分離和鑒定

2.1.1 菌株形態(tài) 從MRS 平板上獲得3 株單菌。圖1A 是三株單菌的單菌落圖，可以看出菌落均呈乳白色、菌落較小、圓形、表面濕潤(rùn)且光滑，邊緣整齊，用接種環(huán)容易挑起，為片球菌屬。本研究還通過革蘭氏染色分析了細(xì)菌形態(tài)，如圖1B 所示，這三種菌株均為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其細(xì)胞壁厚，革蘭氏染色后均為紫色，與李慧芬等[34]的研究結(jié)果一致，在顯微鏡下均為球狀或桿狀，成對(duì)、成鏈或聚團(tuán)狀排列，無芽孢。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)和革蘭氏染色分析Fig.1 Lactic acid bacteria colony morphology and Gram stain analysis

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 提取菌株的基因組DNA，利用特異性引物擴(kuò)增16s rDNA。如圖2 所示，對(duì)所提取的菌株基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，在1600 bp 附近觀察到了目的產(chǎn)物，條帶整齊，表明PCR 產(chǎn)物可用于測(cè)序分析。

圖2 16s rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 16s rDNA amplification product electrophoresis

通過16s rDNA 第一代基因測(cè)序，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)鑒定三株菌株均為乳酸片球菌，分別命名為NXU_220218、NXU_220219、NXU_220220。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果可知（圖3），菌株NXU_220218 與Pediococcus acidilacticiSRCM103367 同源性最高，NXU_220219 與NXU_220220 同Pediococcus acidilacticiSRCM102732 同源性最高，相似度均達(dá)到99%以上。結(jié)合其形態(tài)學(xué)確定三株菌均為乳酸片球菌種（Pediococcus lactis）。

圖3 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.2 3 株乳酸片球菌的生長(zhǎng)能力

接著比較了三株細(xì)菌的生長(zhǎng)特征。由圖4 可知，三株乳酸片球菌在2～8 h 間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。此外，NXU_220218 的生長(zhǎng)能力最好，三株細(xì)菌平穩(wěn)期時(shí)在波長(zhǎng)為600 nm 時(shí)測(cè)定的OD 值均在1.0 左右，由此可知，乳酸片球菌可以在MRS 液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的很好，并且存活率較高，而NXU_220219 和NXU_220220 生長(zhǎng)速度無顯著性差異，其48 h 內(nèi)生長(zhǎng)趨勢(shì)與陳亞男等[35]研究結(jié)果相似。

圖4 乳酸片球菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of Pediococcus lactis

2.3 3 株乳酸片球菌的產(chǎn)酸能力分析

如圖5 所示，0～2 h 菌株處于生長(zhǎng)適應(yīng)期，產(chǎn)酸較少，代謝緩慢，在對(duì)數(shù)期產(chǎn)酸較多，菌株代謝加快，pH 下降迅速。三株細(xì)菌在24 h 后產(chǎn)酸基本進(jìn)入穩(wěn)定期，其中，NXU_220218 產(chǎn)酸速度較其余兩株菌較快，但三株細(xì)菌產(chǎn)酸能力并無顯著性差異。

圖5 乳酸片球菌產(chǎn)酸曲線Fig.5 Acid production curve of Pasciococcus lactis

2.4 3 株乳酸片球菌的耐酸、耐膽鹽性能分析

耐酸耐膽鹽為探究乳酸菌耐受性的重要指標(biāo)。通常耐酸耐膽鹽能力越好，細(xì)菌定植于人體腸道的能力就越強(qiáng)。從圖6A 可以看出，于pH 為2 的酸性培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h 后，三株菌對(duì)酸均有一定的耐受能力。其中，NXU_220218 菌株的存活率較高于其余兩株細(xì)菌，其存活率達(dá)到了67%，表現(xiàn)出對(duì)酸較強(qiáng)的耐受性。

圖6 乳酸菌菌株耐酸、耐膽鹽能力檢測(cè)Fig.6 Lactic acid bacteria strain acid resistance and bile salt resistance test

從圖6B 中可以看出，在濃度為0.3%的牛膽鹽液體培養(yǎng)基中，所有菌株的存活率均較高，三株細(xì)菌中NXU_220218 的存活率較高，達(dá)到了65%，其余兩株菌存活率達(dá)到了50%。在濃度為0.5%的牛膽鹽液體培養(yǎng)基中，所有菌株的存活率明顯降低，但均在40%以上，在此濃度下NXU_220218 的存活率較高，達(dá)到了53%，其余兩株菌存活率達(dá)到了45%。在濃度為0.7%的牛膽鹽液體培養(yǎng)基中，三株菌株的存活率進(jìn)一步降低，三株細(xì)菌中NXU_220218 的存活率相對(duì)較高，其存活率達(dá)到了43%，而其余兩株菌存活率達(dá)到了32%。

2.5 3 株乳酸片球菌的對(duì)人工胃液和腸液的耐受能力分析

益生菌經(jīng)口服進(jìn)入機(jī)體后，先后接觸胃腸道的內(nèi)環(huán)境。腸道中細(xì)菌的生長(zhǎng)受pH、消化液、營(yíng)養(yǎng)成分等多種因素的影響。小腸中pH 約為7.6，一般食物在小腸中停留時(shí)間為3～18 h。因此，微生物若要定植腸道發(fā)揮作用，需耐受小腸中的胰蛋白酶及堿性環(huán)境。本研究人工腸液pH 為8.0，通過菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)菌株對(duì)人工腸液的耐受性，結(jié)果如圖7所示。由圖7A 可以看出，三株乳酸片球菌在人工胃液中均具有一定的耐受力，存活率均在60%以上，其中NXU_220218 的耐受能力最強(qiáng)。由圖7B可以看出，三株乳酸菌在人工腸液中存活率均較高，達(dá)到了85%。三株細(xì)菌之間并無顯著性差異，說明乳酸片球菌可能具有更強(qiáng)的腸道定植能力。

圖7 乳酸片球菌對(duì)人工胃液、腸液耐受能力分析Fig.7 Analysis of the tolerance of Pasciococcus lactis to artificial gastric juice and intestinal fluid

2.6 乳酸片球菌NXU_220218 對(duì)枸杞汁的發(fā)酵性能研究

枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是枸杞活性成分中的一種水溶性多糖，具有促進(jìn)免疫、抗氧化、降血糖血脂等作用[36]，然而作為一種高分子聚合物，大多數(shù)植物多糖口服后不能被人體細(xì)胞直接降解利用，而是通過腸道微生物分解代謝發(fā)揮作用，微生物將多糖降解為還原性低聚糖和單糖，故本研究通過測(cè)定枸杞中多糖和還原糖含量來評(píng)價(jià)菌種的發(fā)酵能力。

由圖8A 可以看出，三株細(xì)菌均能利用枸杞多糖進(jìn)行發(fā)酵，與空白組相比，菌株發(fā)酵后，枸杞多糖含量顯著降低。0～6 h，菌株利用枸杞多糖的含量達(dá)到最大，說明此時(shí)菌株利用多糖的能力最強(qiáng)，6～48 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的含量逐漸降低，最終趨于平穩(wěn)，說明此時(shí)菌株利用多糖的能力達(dá)到最大，證明多糖含量降低與菌株息息相關(guān)，菌株利用枸杞多糖進(jìn)行發(fā)酵，其研究結(jié)果與王艷萍等[37]研究結(jié)果一致。但是，三株乳酸片球菌利用多糖的能力無顯著差異，此外，本研究還檢測(cè)了發(fā)酵液中還原糖含量的動(dòng)態(tài)變化。圖8B 顯示，菌株接種至枸杞汁中使其還原糖含量顯著下降，枸杞汁中的還原糖濃度在前12 h 快速下降；說明此時(shí)菌株分解代謝多糖后利用了還原糖，故還原糖也由剛開始的最高含量逐漸降低，12～48 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖的含量逐漸降低，最終趨于平穩(wěn)，說明此時(shí)菌株利用還原糖的能力達(dá)到最大，其研究結(jié)果與王艷萍等[37]研究結(jié)果一致。而三株菌中NXU_220218 利用還原糖的速率較強(qiáng)于其余兩株細(xì)菌。

圖8 枸杞汁乳酸菌發(fā)酵液中多糖、還原糖濃度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Fig.8 Dynamic monitoring of total sugar and reducing sugar concentration in fermentation broth of lactic acid bacteria in goji berry juice

2.7 乳酸片球菌NXU_220218 發(fā)酵枸杞汁的DPPH自由基及超氧陰離子自由基清除率分析

為了更好地驗(yàn)證乳酸菌發(fā)酵枸杞汁后酚類物質(zhì)的抗氧化能力，故檢測(cè)了乳酸菌發(fā)酵對(duì)枸杞汁DPPH和超氧陰離子自由基清除能力的影響。如圖9A 所示，與空白組相比，三株細(xì)菌均對(duì)發(fā)酵枸杞汁的DPPH 自由基清除能力有一定的影響，0～12 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率逐漸升高，在12 h 時(shí)，NXU_220218 發(fā)酵的枸杞汁中的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最大，為57%，此結(jié)果與黃寧馨等[38]研究結(jié)果相似。NXU_220218和NXU_220219 的DPPH 自由基清除率較強(qiáng)，12 h后，NXU_220218 和NXU_220219的DPPH 自由基清除率沒有顯著變化。但是NXU_220220 呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，其DPPH 自由基清除率在12～36 h 仍然維持上升趨勢(shì)，36～48 h，DPPH 自由基清除率不再改變，說明枸杞發(fā)酵液可以有效清除DPPH 自由基，穩(wěn)定后三株菌發(fā)酵的枸杞汁DPPH自由基清除能力不變，可能是三株菌屬于同一菌種，故代謝產(chǎn)物差異較小。

圖9 乳酸菌發(fā)酵枸杞汁的DPPH 自由基及超氧陰離子自由基清除率分析Fig.9 Analysis of DPPH radical and superoxide anion radical scavenging rate of lactic acid bacteria fermented goji berry juice

圖9B 所示，與空白組相比，三株細(xì)菌對(duì)發(fā)酵枸杞汁對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力有一定影響，說明枸杞成分可以有效清除超氧離子自由基，0～12 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液的超氧陰離子自由基清除率逐漸升高，這可能是乳酸菌發(fā)酵過程中的酶（如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等）將高分子質(zhì)量的酚類化合物轉(zhuǎn)化為游離酚類物質(zhì)，以及高分子質(zhì)量的多糖降解而暴露出更多的活性基團(tuán)。在12 h 時(shí)，NXU_220218發(fā)酵的枸杞汁中的酚類物質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最大達(dá)42%，這與張金蘭等[39]研究結(jié)果類似；12 h 后，三組樣品的超氧陰離子自由基清除率不再受發(fā)酵時(shí)間影響，且無顯著性差異，可能是三株菌同屬同一菌種，其代謝物間差異較小。

2.8 3 種乳酸片球菌發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)價(jià)

在評(píng)價(jià)指導(dǎo)員的指導(dǎo)下篩選出12 位接受過“食品感官評(píng)定”課程并參與訓(xùn)練的評(píng)價(jià)員進(jìn)行感官品評(píng)。由圖10 可知，不同菌株發(fā)酵對(duì)枸杞汁的感官品質(zhì)影響不同。菌株NXU_220218 發(fā)酵枸杞汁的色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)強(qiáng)于其余兩株菌，其中色澤、香氣、組織狀態(tài)達(dá)到8 分；NXU_220219 的色澤強(qiáng)于NXU_220220，而未發(fā)酵的枸杞汁與發(fā)酵的枸杞汁相比，經(jīng)過菌株發(fā)酵的枸杞汁其色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)均強(qiáng)于未發(fā)酵的枸杞汁，說明經(jīng)過菌株發(fā)酵，產(chǎn)生了乙醇，且酮類物質(zhì)含量與種類的增加，賦予了枸杞香味。

圖10 感官評(píng)價(jià)圖Fig.10 Sensory evaluation diagram

3 結(jié)論

本研究通過從人腸道中分離出發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌，通過形態(tài)和16s rDNA 分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。共篩選得到三株乳酸菌分別為乳酸片球菌NXU_220218、乳酸片球菌NXU_220219、乳酸片球菌NXU_220220。根據(jù)生長(zhǎng)能力、產(chǎn)酸能力及耐酸、耐膽鹽、耐人工胃液腸液能力相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，其中NXU_220218 生長(zhǎng)速度最快，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在酸性條件下存活率達(dá)到67%，在0.3%的牛膽鹽中存活率達(dá)到65%，在人工胃液中其存活率達(dá)到了72%，而在人工腸液中其存活率達(dá)到了95%，且能夠使枸杞汁中的還原糖含量顯著性降低，能顯著提高枸杞汁對(duì)DPPH 和超氧陰離子自由基的清除率。結(jié)果表明，NXU_220218 在人體內(nèi)的定植能力較強(qiáng)，發(fā)酵性能良好。說明通過發(fā)酵作用腸道微生物可以代謝枸杞中的多糖，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵后的枸杞汁抗氧化活性總體顯著增高，說明腸道菌發(fā)酵枸杞汁過程生成有抗氧化性的產(chǎn)物，綜上，來源于人腸道的乳酸片球菌NXU_220218 可發(fā)酵利用枸杞多糖，可為解釋多糖的潛在作用機(jī)制和多糖的更好利用提供合理參考，但詳細(xì)的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，同時(shí)本研究也為從人腸道分離篩選出其他新型發(fā)酵劑提供了理論支撐，為開發(fā)富含活菌和多種活性成分的枸杞發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。