不同鹽離子對藜麥蛋白凝膠特性及分子間作用力的影響

馮瀟，武朝升，楊玉玲，付麗霄，陳龍薇，湯曉智

不同鹽離子對藜麥蛋白凝膠特性及分子間作用力的影響

馮瀟，武朝升，楊玉玲，付麗霄，陳龍薇，湯曉智

南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

【目的】研究添加不同鹽離子對藜麥蛋白凝膠特性的影響，探究鹽離子影響凝膠特性的分子機(jī)理，為藜麥蛋白凝膠加工提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎脡A提酸沉法提取藜麥蛋白。在pH 7.0條件下制備添加50 mmol?L-1不同鹽離子（NaCl、CaCl2、CaSO4、MgCl2）的藜麥蛋白溶液（20%，w/v）。水浴加熱后制備凝膠，測定鹽離子對凝膠質(zhì)構(gòu)、持水力、色差以及水分分布的影響。通過掃描電鏡和流變儀研究不同鹽離子對藜麥蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)和流變特性的影響，分析分子間相互作用及其二級結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】中性條件下，鹽離子的加入降低了藜麥蛋白凝膠的硬度和持水力（＜0.05），增強(qiáng)了凝膠的彈性。添加MgCl2的藜麥蛋白凝膠具有最低的硬度和持水力。NaCl對凝膠的色差沒有顯著影響。相同濃度下，二價鹽離子的加入顯著提高了凝膠的亮度和白度，CaCl2的加入使凝膠白度從59.62提高至67.80。添加鹽離子促進(jìn)藜麥蛋白的顆粒聚集，使凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加粗糙，加入二價鹽離子的蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更粗糙和更大的縫隙。同時，相較于空白組和添加NaCl的凝膠，添加二價鹽離子顯著降低了藜麥蛋白凝膠內(nèi)的二硫鍵含量，并削弱了凝膠內(nèi)的靜電相互作用。鹽離子的加入使蛋白凝膠的-折疊和-轉(zhuǎn)角含量降低，-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加，降低了二級結(jié)構(gòu)的有序性?！窘Y(jié)論】在中性條件下，不同鹽離子的加入在不同程度上影響藜麥蛋白的凝膠特性和凝膠的微觀結(jié)構(gòu)；相同摩爾濃度下，所有二價鹽離子比NaCl制備的凝膠微觀結(jié)構(gòu)更粗糙，凝膠硬度和持水力更低，主要是因?yàn)樘砑佣r鹽離子顯著降低了藜麥蛋白凝膠內(nèi)二硫鍵的含量，并削弱了凝膠內(nèi)的靜電相互作用。

藜麥分離蛋白；蛋白凝膠；二級結(jié)構(gòu)；水分分布；分子間作用力

0 引言

【研究意義】藜麥（）是一種偽谷物[1]，營養(yǎng)豐富，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）認(rèn)為藜麥?zhǔn)俏ㄒ灰环N能滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物，被稱為丟失的遠(yuǎn)古“營養(yǎng)黃金”[2]。藜麥種子中的蛋白含量約15%[3-4]，且氨基酸組分均衡，包含全部人體必需氨基酸[5]。凝膠性能被認(rèn)為是植物蛋白重要的功能性質(zhì)之一，對藜麥蛋白的加工適宜性至關(guān)重要[6-7]。蛋白凝膠的性質(zhì)不僅取決于蛋白本身，還取決于凝膠條件，如加熱溫度和方式、pH、離子濃度和類型[8-9]。研究不同鹽離子對熱誘導(dǎo)藜麥蛋白凝膠的影響，對藜麥蛋白凝膠的加工具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人已對藜麥蛋白的提取方式、物理改性（微波加熱、高壓均質(zhì)）以及酶處理對凝膠特性的影響進(jìn)行了探究[10-12]。在pH 8或9下提取的蛋白具有較好的凝膠特性，較高pH（10、11）由于堿性環(huán)境導(dǎo)致蛋白變性，從而使所提取的蛋白無法形成凝膠[11]。對藜麥蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿柑幚砜稍鰪?qiáng)其凝膠特性，采用堿性蛋白酶處理1 min后，可增強(qiáng)藜麥蛋白表面疏水性和凝膠的疏水相互作用[13]。SHEN等[14]研究了不同干燥方式對藜麥分離蛋白流變特性的影響，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥對蛋白的功能性質(zhì)影響最小，且具有最高的儲能模量。HUANG等[15]研究了微波加熱和水浴加熱以及加熱溫度（70、80和90 ℃）對藜麥分離蛋白（QPI）的聚集和凝膠特性的影響。結(jié)果表明微波加熱方式和更高的溫度（90 ℃）可以提高凝膠的強(qiáng)度和持水力。電磁場的存在導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部的分子極化和旋轉(zhuǎn)，使藜麥蛋白分子排列更加有序，增強(qiáng)了凝膠強(qiáng)度。鹽離子對藜麥蛋白凝膠特性影響的相關(guān)研究較少。YANG等[16]通過流變學(xué)和超小角X射線散射和中子散射技術(shù)對不同濃度NaCl（0—300 mmol?L-1）和CaCl2（20、50 mmol?L-1）影響藜麥分離蛋白的凝膠過程進(jìn)行了探究，表明鹽離子可以降低凝膠溫度，使凝膠強(qiáng)度增加；與此同時，加入CaCl2比NaCl使蛋白質(zhì)的聚集更迅速，從而導(dǎo)致在低溫下形成弱的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。但是在Yang等[16]的研究中，由于藜麥蛋白濃度較低（100 mg?mL-1），并沒有形成自支撐凝膠。KASPCHAK等[17]研究了在55 mmol?L-1CaCl2和MgCl2存在下進(jìn)行熱處理（20—90 ℃）后，濃度為10%的藜麥蛋白凝膠的流變學(xué)特征。表明添加CaCl2和MgCl2在酸性條件可以增強(qiáng)凝膠的流變特性，然而在中性條件下降低了凝膠的儲能模量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前僅通過流變學(xué)對不同鹽離子添加的QPI凝膠強(qiáng)度和QPI聚集行為進(jìn)行了探究，本研究分析不同鹽離子對藜麥蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的凝膠特性影響，進(jìn)一步研究鹽離子影響凝膠特性的機(jī)理?！緮M解決的關(guān)鍵問題】制備了含有50 mmol?L-1不同離子（NaCl、CaCl2、CaSO4、MgCl2）的自支撐藜麥蛋白凝膠，通過分析不同鹽離子對藜麥蛋白凝膠的水分分布、二級結(jié)構(gòu)、分子間相互作用和微觀結(jié)構(gòu)的影響，闡釋鹽離子對藜麥蛋白凝膠特性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年6月至2022年6月在南京財經(jīng)大學(xué)糧油質(zhì)量檢測工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

藜麥購買自北京金禾綠源商貿(mào)有限公司；其基礎(chǔ)組分含量為：淀粉58.49%、脂肪6.66%、蛋白質(zhì)13.55%、粗纖維5.08%、水分9.05%、灰分2.71%。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26XP高效冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；NM120-Analyst低場核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；CM-5色差儀，日本Konica Minolta公司；MCR 302流變儀，澳大利亞Anton Paar公司；SP2傅立葉變換紅外吸收光譜儀，美國PE公司；TM 3000掃描電鏡，日本Hitachi公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥分離蛋白的制備 參考YANG等[16]的方法從藜麥粉中提取藜麥分離蛋白（QPI），并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。將脫脂藜麥粉?﹕10的比例懸浮于純水中，使用1 mol?L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，在25 ℃下攪拌2 h。將懸浮液在4 ℃下以10 000×離心15 min，獲得上清液。隨后使用1 mol?L-1HCl溶液將上清液的pH調(diào)節(jié)至4.5以沉淀蛋白質(zhì)。將混合物在4 ℃下10 000×離心15 min以回收沉淀的蛋白質(zhì)。然后將沉淀分散于Milli-Q水中，并在攪拌下用1 mol?L-1NaOH溶液中和至pH 7.0。將QPI溶液在-80 ℃下冷凍12 h，然后凍干，將凍干粉研磨成粉末。獲得的QPI通過凱氏定氮法測得蛋白含量為89.83%，其中脂肪含量≤3.4%，灰分含量≤1.6%。儲存在4 ℃冰箱中，以備進(jìn)一步使用。

1.3.2 藜麥蛋白凝膠的制備 采用凍干粉制備凍干粉含量為20 mg?mL-1的QPI溶液（pH 7.0），水化3 h。分別加入不同類型的鹽離子：NaCl（50 mmol?L-1）、CaCl2（50 mmol?L-1）、CaSO4（50 mmol?L-1）、MgCl2（50 mmol?L-1）并攪拌均勻。吸取10 mL溶液放入25 mL燒杯中，封口以避免加熱時水分蒸發(fā)。隨后將其放入水浴鍋中90 ℃加熱30 min，取出冷卻至室溫。在4 ℃冰箱儲存，用于后續(xù)的表征。

1.3.3 藜麥分離蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)測定 參考NIE等[18]方法并修改，對凝膠樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測定，使用探頭型號為P/36，參數(shù)設(shè)定為：測試前速率為1.0 mm?s-1，測試速率為1.0 mm?s-1，測試后速率為1.0 mm?s-1，探頭深入距離為5 mm，觸發(fā)力為5 g。所有測試在室溫下獨(dú)立重復(fù)3次，并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.4 持水力測定 參考CHEN等[19]的方法，將5 g凝膠樣品中以8 000 r/min在4 ℃下離心10 min，然后將上清液倒出。在離心前、后記錄離心管和凝膠的重量。WHC（%）的計算公式如下：

式中，W1：離心管的重量（g），W2：離心前離心管和凝膠的重量（g），W3：離心后離心管和凝膠的重量（g）。

1.3.5 色差分析 QPI凝膠測試參考馮瀟等[20]的方法。將儲存的凝膠在室溫下靜置1 h進(jìn)行白度測定，首先將不同的凝膠樣品切成直徑2 cm、高1.5 cm的圓柱形凝膠，然后使用色差儀測定凝膠樣品的L*、a*和b*值。L*值表示亮度，a*值表示紅綠色，b*表示黃藍(lán)色，所有樣品獨(dú)立重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。白度（W）計算公式如下：

1.3.6 凝膠內(nèi)分子間作用力 參考LI等[21]和ZHENG等[22]的方法，將凝膠樣品（1 g）溶于10 mL不同溶液中：溶液S1（0.6 mol?L-1NaCl，pH 7.0）、溶液S2（0.6 mol?L-1NaCl、1.5 mol?L-1尿素）、溶液S3（0.6 mol?L-1NaCl、8 mol?L-1尿素）、溶液S4（0.6 mol?L-1NaCl、8 mol?L-1尿素、0.5 mol?L-1-巰基乙醇）。將混合物攪拌1 h，并在4 ℃下以10 000 r/min離心30 min。使用Bradford法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)。測量S1、S2、S3和S4的溶解度，其中S1、（S2-S1）、（S3-S2）、（S4-S3）分別代表靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵。

1.3.7 凝膠的水分分布 凝膠的水分分布狀態(tài)主要通過低場核磁共振的橫向弛豫時間T2表示[23]，將1 g不同的藜麥蛋白凝膠裝入核磁管中，采用低場NMR弛豫測定凝膠樣品的橫向弛豫時間T2。質(zhì)子共振頻率為19 MHz，溫度為（32±0.01）℃，采樣頻率為100 kHz，重復(fù)掃描次數(shù)為8，每組樣品重復(fù)3次，取平均值。采用儀器自帶的軟件進(jìn)行反演得到T2圖譜。

1.3.8 流變特性分析 參考YANG等[16]的方法并稍加修改，采用配備平行板（直徑40 mm、間隙1 mm）的流變儀。分析不同制備方法和不同鹽離子濃度的藜麥蛋白凝膠的流變特性。將QPI粉末分散在超純水中制備QPI溶液（200 mg?mL-1），并使用1 mol?L-1HCl或1 mol?L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0。25 ℃攪拌2 h后放入4 ℃冰箱過夜，使蛋白質(zhì)充分水合。按照上述1.3節(jié)制備方法，制備出含有不同鹽離子的溶液。再用磁力攪拌器攪拌2 h。用塑料滴管將QPI溶液轉(zhuǎn)移到平板上。并在樣品邊緣滴入硅油以防止蒸發(fā)。流變測量采用以下方案進(jìn)行：通過將樣品在5 ℃?min-1下從20 ℃加熱到90 ℃，在90 ℃下保持30 min，并在5 ℃?min-1下冷卻至25 ℃進(jìn)行溫度掃描。在此步驟中，頻率和應(yīng)變幅度分別保持在1 Hz和1%，以監(jiān)測凝膠形成。

1.3.9 凝膠的微觀結(jié)構(gòu) 將不同的凝膠樣品切成薄片，將凝膠樣品放在磷酸鹽緩沖液（0.1 mmol?L-1）中配制的2.5%戊二醛溶液（pH 6.8）中固定24 h，再用相同濃度的磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次漂洗15 min。然后分別使用50%—100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每次脫水15 min，再用無水乙醇溶液對凝膠樣品脫水3次，每次脫水15 min。將脫水好的凝膠樣品放入-80 ℃冰箱預(yù)凍，之后凍干、噴金。最后在20 kV電壓下使用掃描電鏡觀察凝膠樣品的表面結(jié)構(gòu)狀態(tài)并進(jìn)行拍照[24-25]。

1.3.10 凝膠的二級結(jié)構(gòu) 通過傅里葉紅外光譜儀（FTIR）測定凍干凝膠的二級結(jié)構(gòu)。將凍干凝膠樣品與溴化鉀以1﹕100（w/w）的比例完全混合，研磨后壓片。光譜采集范圍為4 000—400 cm-1，分辨率為4 cm-1，進(jìn)行64次掃描[26]。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)構(gòu)分析

從圖1可以看出，無離子添加的藜麥蛋白凝膠硬度最高，無論是一價陽離子還是二價陽離子的添加都會使藜麥蛋白凝膠的硬度降低，且二價鹽離子對凝膠硬度的降低比一價鹽離子更明顯。但是，鹽離子的加入不同程度地增加了凝膠的彈性。其中NaCl、CaSO4和MgCl2對彈性的增強(qiáng)更為顯著。MgCl2顯著增強(qiáng)了蛋白凝膠的黏聚性，其他鹽離子對黏聚性的影響不顯著。除CaSO4外，其他鹽離子顯著降低了蛋白凝膠的回復(fù)性（＜0.05）。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

2.2 持水力

圖2顯示添加NaCl的凝膠與對照組的持水力沒有顯著性差異，而二價鹽離子的加入，降低了藜麥蛋白凝膠的持水力。添加鈣離子（CaSO4、CaCl2）的凝膠與添加NaCl的凝膠持水力無顯著差異。在離子添加的凝膠中，添加MgCl2的藜麥蛋白凝膠持水力從空白組的76.77%降低到65.92%。

2.3 水分分布

每個樣品的弛豫時間曲線上有3個峰，這表明凝膠中存在3種水，分別是結(jié)合水（1—10 ms）、不易流動水（100—200 ms）和自由水（1 000—4 500 ms）。從圖3可以看出，NaCl對QPI凝膠的水分分布相比于對照組沒有顯著影響。添加CaCl2和CaSO4組的凝膠其結(jié)合水含量明顯增加，添加MgCl2顯著降低了凝膠中結(jié)合水的含量，添加NaCl、CaCl2和CaSO4的凝膠不易流動水含量無顯著性差異，而加入MgCl2顯著降低了藜麥蛋白凝膠不易流動水的含量，并增加了自由水的含量。

圖2 不同鹽離子添加對藜麥蛋白凝膠持水力的影響

圖3 添加不同鹽離子QPI凝膠的低頻-核磁共振圖譜（A）及凝膠水分分布（B）

2.4 色差分析

由表1可以看出，NaCl對所制備的藜麥蛋白凝膠顏色相較于對照組沒有顯著的影響。添加CaCl2、CaSO4和MgCl2顯著增加了凝膠的L*（亮度）和a*（紅綠值）。不同的鹽離子對凝膠的b*（黃藍(lán)值）無顯著影響。二價陽離子都不同程度上提高了蛋白凝膠的白度和亮度。CaCl2對凝膠白度的提升最明顯。

2.5 分子間作用力

如圖4所示，鹽離子對凝膠內(nèi)部的氫鍵沒有顯著影響，添加二價鹽離子降低了藜麥蛋白凝膠的靜電相互作用。不同鹽離子顯著影響凝膠的二硫鍵含量，NaCl的加入使凝膠相比于對照組的二硫鍵含量顯著降低。同時，添加二價鹽離子（CaCl2、CaSO4、MgCl2）比添加NaCl更為顯著地降低了二硫鍵的含量，其斷裂二硫鍵測得的可溶性蛋白含量從對照組的3.20 mg?mL-1分別降低到1.91、1.85和1.87 mg?mL-1。因此，鹽離子主要通過影響凝膠內(nèi)二硫鍵的交聯(lián)及氫鍵作用而影響藜麥蛋白的凝膠特性。

表1 不同鹽離子對QPI凝膠色差的影響

圖4 添加不同鹽離子對QPI凝膠內(nèi)分子間作用力的影響

2.6 凝膠的外觀及微觀結(jié)構(gòu)

從圖5可以看出，所有制備的凝膠均呈現(xiàn)為不透明的白色凝膠，制備的凝膠均為典型的顆粒狀聚集凝膠。微觀結(jié)構(gòu)中，未添加鹽離子的凝膠結(jié)構(gòu)空隙更小，分布更均勻。加入NaCl后，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)縫隙；加入CaCl2后，鹽離子的屏蔽效應(yīng)促使蛋白聚集，從而使凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得更粗糙，比加入NaCl出現(xiàn)更多的孔洞結(jié)構(gòu)。綜上，添加二價鹽離子使凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得更粗糙。

2.7 流變性質(zhì)

圖6顯示，在初始低溫階段，未添加鹽離子的藜麥蛋白溶液儲能模量（G'）和損耗模量（G''）均小于有鹽離子添加的溶液，對照組和添加NaCl組在初始溫度較低時的G''均大于G'，在后續(xù)加熱過程中G'急劇上升。添加二價鹽離子組則在初始階段G''和G'基本一致，加熱結(jié)束時，G'均大于G''，說明均形成了以彈性為主的凝膠。恒溫過程中，所有凝膠的儲能模量G'緩慢增加，而在最后的冷卻階段G'再次顯著上升。溫度掃描結(jié)束時，空白組藜麥蛋白凝膠的G'最高，其次為添加NaCl的凝膠。最低的是添加二價鹽離子所制備的凝膠，與質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果一致。

圖5 不同鹽離子對QPI凝膠外觀和微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.8 二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由其酰胺一區(qū)（1 600—1 700 cm-1）的特定區(qū)域確定，酰胺一區(qū)的不同區(qū)域被分配到特定的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[27]：-折疊（1 615— 1 637 cm-1、1 682—1 700 cm-1），-螺旋（1 646— 1 661 cm-1），-轉(zhuǎn)角（1 664—1 681 cm-1）和無規(guī)則卷曲（1 637—1 648 cm-1)。圖7為添加不同鹽離子藜麥蛋白凝膠的紅外圖譜，二級結(jié)構(gòu)的量化結(jié)果見表2。從表2可以看出，凝膠中-折疊和-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占的比例較高。隨著鹽離子的加入，-折疊和-轉(zhuǎn)角含量降低，-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加。

圖6 添加不同鹽離子的QPI溶液在溫度掃描分析中G'和G''的變化

圖7 不同QPI凝膠的紅外圖譜

表2 不同鹽離子對QPI凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

3.1 不同鹽離子影響藜麥蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)、外觀、顏色和流變特性

凝膠硬度主要與參與網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的蛋白數(shù)量和形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力有關(guān)。在凝膠制備過程中，適量鹽離子的添加能夠減弱分子間斥力作用，有利于蛋白分子間的交聯(lián)，促進(jìn)凝膠的形成；而當(dāng)鹽離子濃度較高時，蛋白質(zhì)會因靜電屏蔽而發(fā)生隨機(jī)聚集，且蛋白質(zhì)變性溫度會隨著鹽濃度的增加而提高，使蛋白質(zhì)在同樣加熱條件下變性和展開程度降低，從而使部分蛋白未參與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，降低凝膠的硬度[28]。

由于藜麥蛋白中主要的蛋白組分是11S球蛋白和2S清蛋白，7S球蛋白在藜麥蛋白中的含量極少（1.73%），11S球蛋白在藜麥蛋白熱凝膠中發(fā)揮著主要的凝膠作用[29]。不同于大豆分離蛋白，藜麥分離蛋白的變性溫度較高，根據(jù)基因型不同，開始變性溫度（T0）為92 ℃，變性溫度（Td）約為98 ℃[29]。在球蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠中，變性被認(rèn)為是凝膠的先決條件[30]。90 ℃加熱時，QPI部分發(fā)生變性，在不添加鹽離子時，部分變性的QPI參與凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成；而加入鹽離子后，QPI的變性溫度升高，則在相同加熱條件下參與凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變性QPI減少，因而凝膠硬度隨著鹽離子的添加而減小。這與KASPCHAK等[17]的研究類似，藜麥蛋白在pH 7.0時，其G′隨著NaCl濃度（0—300 mmol?L-1）的升高而降低。

凝膠的外觀被認(rèn)為是所形成網(wǎng)絡(luò)類型的良好指標(biāo)。具有有序結(jié)構(gòu)（纖維狀聚集）形成的凝膠是半透明的，而由顆粒聚集形成的凝膠由于顆粒聚集更大且聚集更隨機(jī)而呈現(xiàn)不透明的狀態(tài)[31]。這種微觀結(jié)構(gòu)特征直接影響凝膠的持水能力，顆粒聚集的凝膠持水力較低。表明高濃度的二價離子誘導(dǎo)了粗糙的顆粒凝膠結(jié)構(gòu)的形成，因此，添加二價鹽離子的凝膠持水力較低。

流變可以模擬蛋白加熱凝膠過程，在初始升溫階段所有樣品的G′都表現(xiàn)出先下降的趨勢，這可能與低溫下弱蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)[15-16]。G′達(dá)到1 Pa的溫度或G′和G″值相交叉時的溫度為蛋白的凝膠形成溫度，定義為凝膠溫度Tgel[32]。在升溫過程中，NaCl的加入使凝膠溫度降低，大豆和蠶豆蛋白中也有發(fā)現(xiàn)相似的趨勢[33-34]。而在降溫階段，所有樣品的G′和G″都表現(xiàn)出了上升趨勢，這可以歸因于冷卻階段氫鍵的作用。本研究結(jié)果表明，未添加鹽離子的最終儲能模量G′最高，鹽離子的加入在不同程度上對凝膠產(chǎn)生了不利的影響。這與YANG等[16]的研究相反，YANG等[16]通過研究NaCl、CaCl2對10%藜麥蛋白溶液流變特性的影響，發(fā)現(xiàn)鹽離子提高了凝膠的儲能模量?？赡艿脑蚴窃诘蜐舛鹊牡鞍兹芤褐校}離子的加入促進(jìn)蛋白的聚集以及蛋白與蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度的增強(qiáng)。而本研究采用的藜麥蛋白濃度為20%，蛋白溶液中的蛋白分子相互接觸更加密集，鹽離子的加入使溶液中的蛋白過度聚集，從而降低了加熱過程中蛋白質(zhì)的展開，導(dǎo)致蛋白-蛋白的相互作用減弱，反而降低了其凝膠強(qiáng)度。本研究結(jié)果與KASPCHAK等[17]的研究一致，在pH 7.0時，加入CaCl2（55 mmol?L-1）和MgCl2（55 mmol?L-1）的QPI凝膠強(qiáng)度均小于未添加離子的凝膠。

3.2 不同鹽離子影響藜麥蛋白凝膠水分分布、持水力

凝膠的持水力主要與凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及蛋白與水分子間的作用力有關(guān)，未添加鹽離子的藜麥蛋白變性溫度更低，蛋白內(nèi)部基團(tuán)暴露相對更充分，因此凝膠內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)相互作用更強(qiáng)。添加鹽離子使藜麥蛋白變性溫度增高，增強(qiáng)了蛋白的熱穩(wěn)定性，使蛋白內(nèi)部基團(tuán)暴露相對減少，從而降低了凝膠內(nèi)部蛋白的相互作用，導(dǎo)致凝膠的持水力較低[35]。添加鹽離子使蛋白聚集速度加快，凝膠化溫度降低，形成了較不均勻和粗糙的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致持水力的降低。PEYRANO等[36]研究了鈣離子濃度（0—40 mmol?L-1）對豇豆蛋白的影響，也表明高濃度鈣離子的加入，加速了蛋白聚集，導(dǎo)致形成不均勻結(jié)構(gòu)的顆粒凝膠持水力顯著降低。

3.3 不同鹽離子影響藜麥蛋白凝膠分子間作用力和二級結(jié)構(gòu)

凝膠的分子間作用力由二硫鍵占據(jù)主導(dǎo)地位，其中二硫鍵是促進(jìn)凝膠化的關(guān)鍵分子間作用力[25]。二硫鍵和疏水相互作用維持凝膠中蛋白-蛋白相互作用，靜電相互作用和氫鍵維持凝膠中蛋白-水之間的相互作用[37]。靜電相互作用的降低表明凝膠中蛋白-水之間的相互作用減弱，與持水力的結(jié)果一致（圖2）。不同鹽離子的加入在不同程度上降低了最終凝膠中二硫鍵的含量，加入二價鹽離子使二硫鍵的降低更為顯著，鹽離子主要通過影響凝膠中二硫鍵的含量進(jìn)而影響QPI的凝膠性能，與質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果一致（圖1）。鹽離子導(dǎo)致二硫鍵含量降低的原因可能是鹽離子影響QPI在加熱過程中的聚集行為，加入鹽離子后，靜電屏蔽效應(yīng)導(dǎo)致蛋白的聚集，從而使加熱過程中蛋白展開不充分，使凝膠中蛋白-蛋白相互作用減少。與此同時，鹽離子的加入使蛋白的變性溫度升高，同等加熱條件下降低了蛋白質(zhì)的展開程度，導(dǎo)致巰基的暴露減少，二硫鍵含量降低。

-折疊對于凝膠網(wǎng)絡(luò)和蛋白-蛋白之間的相互作用具有重要影響，因?yàn)?折疊結(jié)構(gòu)具有相對更大的表面積用于形成有序氫鍵[38]。隨著鹽離子的添加，QPI凝膠的-折疊含量出現(xiàn)降低[39]。這與QPI凝膠的硬度（圖1）和持水力下降（圖2）一致。YAO等[40]研究海藻酸鈉對肌原纖維蛋白凝膠的影響也表明了-折疊結(jié)構(gòu)與持水力的正相關(guān)關(guān)系。無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)屬于不規(guī)則結(jié)構(gòu)，不利于有序凝膠結(jié)構(gòu)的形成[37]。本研究中鹽離子的加入引起QPI凝膠無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的上升與SEM中凝膠結(jié)構(gòu)更粗糙的結(jié)果一致[38]。

4 結(jié)論

鹽離子通過調(diào)控藜麥蛋白的聚集行為及蛋白質(zhì)的變性溫度，影響藜麥蛋白在加熱凝膠過程中的展開程度、蛋白間的分子間相互作用及凝膠內(nèi)的水分分布，從而使凝膠的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)變，且凝膠的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得疏松及不均勻，降低了藜麥蛋白凝膠的硬度、回復(fù)性及持水力，增強(qiáng)了凝膠的彈性和黏聚性。本研究結(jié)果可為藜麥蛋白加工提供理論參考，生產(chǎn)中可根據(jù)不同的加工需求選擇適合的鹽離子。

[1] CEYHUN SEZGIN A, SANLIER N. A new generation plant for the conventional cuisine: Quinoa (Willd.). Trends in Food Science & Technology, 2019, 86: 51-58.

[2] 王龍飛, 王新偉, 趙仁勇. 藜麥蛋白的特點(diǎn)、性質(zhì)及提取的研究進(jìn)展. 食品工業(yè), 2017, 38(7): 255-258.

WANG L F, WANG X W, ZHAO R Y. Research progress on characteristics, properties and extraction of quinoa protein. The Food Industry, 2017, 38(7): 255-258. (in Chinese)

[3] STEFFOLANI M E, VILLACORTA P, MORALES-SORIANO E R, REPO-CARRASCO R, LEóN A E, PéREZ G T. Physicochemical and functional characterization of protein isolated from different quinoa varieties (Willd.). Cereal Chemistry, 2016, 93(3): 275-281.

[4] NAVARRO-LISBOA R, HERRERA C, Zú?IGA R N, ENRIONE J, GUZMáN F, MATIACEVICH S, ASTUDILLO-CASTRO C. Quinoa proteins (Willd.) fractionated by ultrafiltration using ceramic membranes: The role of pH on physicochemical and conformational properties. Food and Bioproducts Processing, 2017, 102: 20-30.

[5] 吉靜筠, 李洪巖, 王靜. 藜麥蛋白功能特性研究進(jìn)展. 中國食品學(xué)報, 2021, 21(11): 368-376.

JI J Y, LI H Y, WANG J. Research progress on the functional properties of quinoa protein. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(11): 368-376. (in Chinese)

[6] BOHRER B M. An investigation of the formulation and nutritional composition of modern meat analogue products. Food Science and Human Wellness, 2019, 8(4): 320-329.

[7] DAKHILI S, ABDOLALIZADEH L, HOSSEINI S M, SHOJAEE- ALIABADI S, MIRMOGHTADAIE L. Quinoa protein: composition, structure and functional properties. Food Chemistry, 2019, 299: 125161.

[8] TARONE A G, FASOLIN L H, DE ASSIS PERRECHIL F, HUBINGER M D, DA CUNHA R L. Influence of drying conditions on the gelling properties of the 7S and 11S soy protein fractions. Food and Bioproducts Processing, 2013, 91(2): 111-120.

[9] 朱秀清, 鄧筱琪, 朱穎, 王喜泉, 李玉玲, 夏曉雨. 大豆蛋白凝膠制備及其影響因素的研究進(jìn)展. 食品工業(yè)科技, 2023, 44(6): 405-414.

ZHU X Q, DENG X Q, ZHU Y, WANG X Q, LI Y L, XIA X Y. Advances in the gel preparation and its affecting factors of soybean protein. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(6): 405-414. (in Chinese)

[10] 蘇巧艷. 微波處理對藜麥蛋白功能特性的影響. 食品工程, 2021(2): 33-37.

SU Q Y. Effect of microwave teatment on functional properties of quinoa protein. Food Engineering, 2021(2): 33-37. (in Chinese)

[11] RUIZ G A, XIAO W K, VAN BOEKEL M, MINOR M, STIEGER M. Effect of extraction pH on heat-induced aggregation, gelation and microstructure of protein isolate from quinoa (Willd). Food Chemistry, 2016, 209: 203-210.

[12] LUO L, CHENG L R, ZHANG R J, YANG Z. Impact of high-pressure homogenization on physico-chemical, structural, and rheological properties of quinoa protein isolates. Food Structure, 2022, 32: 100265.

[13] WANG X Y, CHENG L R, WANG H F, YANG Z. Limited Alcalase hydrolysis improves the thermally-induced gelation of quinoa protein isolate (QPI) dispersions. Current Research in Food Science, 2022, 5: 2061-2069.

[14] SHEN Y T, TANG X, LI Y H. Drying methods affect physicochemical and functional properties of quinoa protein isolate. Food Chemistry, 2021, 339: 127823.

[15] HUANG K, SHI J R, LI M Y, SUN R L, GUAN W W, CAO H W, GUAN X, ZHANG Y. Intervention of microwave irradiation on structure and quality characteristics of quinoa protein aggregates. Food Hydrocolloids, 2022, 130: 107677.

[16] YANG Z, DE CAMPO L, GILBERT E P, KNOTT R, CHENG L R, STORER B, LIN X L, LUO L, PATOLE S, HEMAR Y. Effect of NaCl and CaCl2concentration on the rheological and structural characteristics of thermally-induced quinoa protein gels. Food Hydrocolloids, 2022, 124: 107350.

[17] KASPCHAK E, DE OLIVEIRA M A S, SIMAS F F, FRANCO C R C, SILVEIRA J L M, MAFRA M R, IGARASHI-MAFRA L. Determination of heat-set gelation capacity of a quinoa protein isolate () by dynamic oscillatory rheological analysis. Food Chemistry, 2017, 232: 263-271.

[18] NIE Y Q, LIU Y F, JIANG J, XIONG Y L, ZHAO X Z. Rheological, structural, and water-immobilizing properties of mung bean protein-based fermentation-induced gels: Effect of pH-shifting and oil imbedment. Food Hydrocolloids, 2022, 129: 107607.

[19] CHEN Y, WANG T, ZHANG Y F, YANG X R, DU J, YU D Y, XIE F Y. Effect of moderate electric fields on the structural and gelation properties of pea protein isolate. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2022, 77: 102959.

[20] 馮瀟, 張帆, 陳穎, 成佳欣, 岑凱悅, 湯曉智. 藜麥蛋白Pickering乳液添加對魚糜蛋白凝膠凍融穩(wěn)定性的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2022, 55(10): 2038-2046. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.013.

FENG X, ZHANG F, CHEN Y, CHENG J X, CEN K Y, TANG X Z. Effects of adding quinoa protein Pickering emulsion on freeze-thaw stability of fish surimi gel. Scientia Agricultura Sinica, 2022, 55(10): 2038-2046. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.013. (in Chinese)

[21] LI N N, YANG M, GUO Y H, TONG L T, WANG Y Q, ZHANG S, WANG L L, FAN B, WANG F Z, LIU L Y. Physicochemical properties of different pea proteins in relation to their gelation ability to form lactic acid bacteria induced yogurt gel. LWT-Food Science and Technology, 2022, 161: 113381.

[22] ZHENG L, WANG Z J, KONG Y, MA Z L, WU C L, REGENSTEIN J M, TENG F, LI Y. Different commercial soy protein isolates and the characteristics of Chiba tofu. Food Hydrocolloids, 2021, 110: 106115.

[23] 韓柯穎, 馮瀟, 楊玉玲, 李珊珊, 魏蘇萌, 陳玉敏. 添加山茶油對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 54(20): 4446-4455. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.017.

HAN K Y, FENG X, YANG Y L, LI S S, WEI S M, CHEN Y M. Effects ofoil on the properties of myofibrillar protein gel. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(20): 4446-4455. doi: 10.3864/ j.issn.0578-1752.2021.20.017. (in Chinese)

[24] Lü Y Q, XU L L, SU Y J, CHANG C H, GU L P, YANG Y J, LI J H. Effect of soybean protein isolate and egg white mixture on gelation of chicken myofibrillar proteins under salt /-free conditions. LWT-Food Science and Technology, 2021, 149: 111871.

[25] FENG X C, CHEN L, LEI N, WANG S X, XU X L, ZHOU G H, LI Z X. Emulsifying properties of oxidatively stressed myofibrillar protein emulsion gels prepared with (–)-epigallocatechin-3-gallate and NaCl. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(13): 2816-2826.

[26] AI M M, ZHOU Q, GUO S G, LING Z T, ZHOU L D, FAN H, CAO Y Y, JIANG A M. Effects of tea polyphenol and Ca(OH)2on the intermolecular forces and mechanical, rheological, and microstructural characteristics of duck egg white gel. Food Hydrocolloids, 2019, 94: 11-19.

[27] KONG J L, YU S N. Fourier transform infrared spectroscopic analysis of protein secondary structures. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2007, 39(8): 549-559.

[28] 吳超. 大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)與非網(wǎng)絡(luò)蛋白擴(kuò)散行為或網(wǎng)絡(luò)蛋白性質(zhì)關(guān)系的研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2017.

WU C. Study on the relationship between the gel structure of soybean protein and the diffusion behavior of non-network protein or the properties of network protein [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2017. (in Chinese)

[29] VAN DE VONDEL J, LAMBRECHT M A, DELCOUR J A. Osborne extractability and chromatographic separation of protein from quinoa (Willd.) wholemeal. LWT-Food Science and Technology, 2020, 126: 109321.

[30] RENKEMA J M S, GRUPPEN H, VAN VLIET T. Influence of pH and ionic strength on heat-induced formation and rheological properties of soy protein gels in relation to denaturation and their protein compositions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(21): 6064-6071.

[31] ZHENG L, TENG F, WANG N, ZHANG X N, REGENSTEIN J, LIU J S, LI Y, WANG Z J. Addition of salt ions before spraying improves heat- and cold-induced gel properties of soy protein isolate (SPI). Applied Sciences, 2019, 9(6): 1076.

[32] RENKEMA J M S, KNABBEN J H M, VAN VLIET T. Gel formation by β-conglycinin and glycinin and their mixtures. Food Hydrocolloids, 2001, 15(4/5/6): 407-414.

[33] CHEN N N, ZHAO M M, CHASSENIEUX C, NICOLAI T. The effect of adding NaCl on thermal aggregation and gelation of soy protein isolate. Food Hydrocolloids, 2017, 70: 88-95.

[34] LANGTON M, EHSANZAMIR S, KARKEHABADI S, FENG X M, JOHANSSON M, JOHANSSON D P. Gelation of faba bean proteins - Effect of extraction method, pH and NaCl. Food Hydrocolloids, 2020, 103: 105622.

[35] ZHANG J H, JIANG L, YANG J, CHEN X X, SHEN M Y, YU Q, CHEN Y, XIE J H. Effect of calcium chloride on heat-inducedpolysaccharide-whey protein isolation gels: Gel properties and interactions. LWT-Food Science and Technology, 2022, 155: 112907.

[36] PEYRANO F, DE LAMBALLERIE M, AVANZA M V, SPERONI F. High hydrostatic pressure- or heat-induced gelation of cowpea proteins at low protein content: Effect of calcium concentration. Food Hydrocolloids, 2022, 124: 107220.

[37] Lü Y Q, XU L L, TANG T T, LI J H, GU L P, CHANG C H, ZHANG M, YANG Y J, SU Y J. Gel properties of soy protein isolate-potato protein-egg white composite gel: Study on rheological properties, microstructure, and digestibility. Food Hydrocolloids, 2023, 135: 108223.

[38] GUO M H, LIU S C, ISMAIL M, FARID M M, JI H W, MAO W J, GAO J, LI C Y. Changes in the myosin secondary structure and shrimp surimi gel strength induced by dense phase carbon dioxide. Food Chemistry, 2017, 227: 219-226.

[39] PENG Y, KYRIAKOPOULOU K, KEPPLER J K, VENEMA P, VAN DER GOOT A J. Effect of calcium enrichment on the composition, conformation, and functional properties of soy protein. Food Hydrocolloids, 2022, 123: 107191.

[40] YAO J, ZHOU Y, CHEN X, MA F, LI P J, CHEN C G. Effect of sodium alginate with three molecular weight forms on the water holding capacity of chicken breast myosin gel. Food Chemistry, 2018, 239: 1134-1142.

Effects of Different Salt Ions on the Gel Properties and Molecular Interactions of Quinoa Protein

FENG Xiao, WU ChaoSheng, YANG YuLing, FU LiXiao, CHEN LongWei, TANG XiaoZhi

College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory for Quality Safety Control and Deep Processing of Cereals and Oils, Nanjing 210023

【Objective】This research studied the effects of different salt ions on the gel properties of quinoa protein, and explored its molecular mechanisms, so as to provide a theoretical basis for the processing of quinoa protein gels. 【Method】Quinoa protein was extracted by alkali extraction and acid precipitation. Quinoa protein solution (20%, w/v) was prepared at pH 7.0. NaCl, CaCl2, CaSO4and MgCl2was added in quinoa protein solution till the concentration was 50 mmol?L-1, and then the solution was heated in a water bath to prepare quinoa protein gels. The effects of salt ions on the texture, water retention, color properties and water distribution of quinoa protein gels were analyzed. Meanwhile, the effects of salt ions on the microstructure and rheological properties of quinoa protein gels were studied by scanning electron microscopy and rheometer. The effects of salt ions on the molecular interactions and secondary structure of protein gels were also analyzed. 【Result】The addition of salt ions significantly decreased the hardness and water holding capacity, while increased the springiness of quinoa protein gels under pH 7.0. Quinoa protein gels with MgCl2showed the lowest hardness and water holding capacity. NaCl addition had no significant influence on the color properties of protein gels. However, the addition of bivalent salt ions significantly improved the lightness and whiteness of quinoa protein gels, and their whiteness increased from 59.62 to 67.80 with the addition of CaCl2. Furthermore, the addition of salt ions promoted granular aggregation of quinoa protein, which made the gel network structure become coarse. Coarse and larger gaps were observed in the microstructure of quinoa protein gels when divalent salt ions were added. Meanwhile, compared with blank gels and gels added with NaCl, the addition of divalent salt ions significantly decreased the content of disulfide bond, and weakened the electrostatic interactions within quinoa protein gels. Furthermore, the addition of salt ions decreased the contents of-sheets and-turns, increased the contents of-helix and random coil, which affected the orderliness of protein secondary structure. 【Conclusion】 Under neutral conditions, the gel properties of quinoa protein and microstructure of gels were affected by the presence of different salt ions to various degrees. Compared with the gel prepared with NaCl, quinoa protein gels with the same concentration of CaCl2, CaSO4, and MgCl2showed rougher microstructure, lower gel hardness and water holding capacity, as divalent salt ions significantly decreased the disulfide bond content and weakened the electrostatic interactions within quinoa protein gels.

quinoa protein isolate; protein gels; secondary structure; water distribution; molecular interaction

2023-02-06；

2023-08-18

國家自然科學(xué)基金（32001643，32372380）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20200831）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

馮瀟，E-mail：fengxiao@nufe.edu.cn。武朝升，E-mail：wuchaosheng3@163.com。馮瀟和武朝升為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者湯曉智，E-mail：9120111004@nufe.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）