二甲雙胍對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及增殖、凋亡的作用

趙 博，楊小軍，歐陽(yáng)運(yùn)萍，陳 濤，李 鵬

急性肺損傷指各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷， 造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全，死亡率較高[1]，且目前臨床上未有特效藥物用以治療急性肺損傷，因此亟需尋求有效手段治療急性肺損傷。在急性肺損傷過程中會(huì)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子， 體外實(shí)驗(yàn)表明一些致病因素如炎性細(xì)胞因子等可致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡1 型細(xì)胞凋亡[2，3]。因此，遏制肺部的炎癥反應(yīng)與凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是改善急性肺損傷的有效治療手段。二甲雙胍為口服類降糖藥物，其安全性已得到充分證實(shí)。 研究表明二甲雙胍可改善脂多糖（lpopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷[4]。 但是二甲雙胍對(duì)氧化應(yīng)激所造成急性肺損傷的作用機(jī)制研究較少。 有報(bào)道指出二甲雙胍能夠通過p38 絲裂原活化蛋白激酶 （p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。p38 MAPK 參與了多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展， 是較為關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路， 近年來與慢性阻塞性肺疾病、 急性肺損傷、哮喘等常見呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系密切[6]。有研究顯示，遏制p38 MAPK 信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕肺損傷[7]。 肺Ⅱ型上皮細(xì)胞是氧化損傷的主要靶標(biāo)，具有較難分離獲取且難以在體外傳代的特點(diǎn)[8]。人肺泡上皮細(xì)胞A549 與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有相似的形態(tài)及生化特性，故而筆者以人肺泡上皮細(xì)胞A549 為研究對(duì)象， 探討二甲雙胍是否通過調(diào)控p38 MAPK 信號(hào)通路表達(dá)發(fā)揮對(duì)肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、 增殖及凋亡的作用，為氧化應(yīng)激所致肺損傷的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺泡上皮細(xì)胞A549，購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 藥品與試劑

過氧化氫（H2O2）、二甲雙胍（純度≥98%。 上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；p38 MAPK 通路抑制劑SB 203580，p38 MAPK 通路激活劑C16-PAF（純度≥99%。 上海源葉生物科技有限公司，中國(guó)）；F-12K 培養(yǎng)液（北京索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)）；胎牛血清（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，中國(guó)）；放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell count Kit-8，CCK-8）、5-乙炔基-2" 脫氧尿嘧啶核苷 （5-acetylidene-2"deoxyuracil nucleoside，EdU）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、鼠抗人[p38 MAPK、p-p38 MAPK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）-3、細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）及β-肌動(dòng)蛋白（beta-actin，β-actin）一抗]、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（山羊抗鼠IgG）（上海翌圣生物科技股份有限公司，中國(guó)）；酶聯(lián)免疫吸附分析 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒 （上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；Hoechst 33258 染色試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司，中國(guó)）。

1.1.3 主要儀器

層流超凈工作臺(tái)（型號(hào)VS-840-1。上海博迅實(shí)業(yè)有限公司， 中國(guó)）； 倒置熒光顯微鏡 （型號(hào)WMJ-9930BD。 上海豫光儀器有限公司，中國(guó)）；超純水儀（型號(hào)OSJ-UP。 博科醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)Multiskan FC。 美國(guó)Thermo 公司）；智能高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)TG18G。 鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 人肺泡上皮細(xì)胞A549 培養(yǎng)

于超低溫冰箱中取肺泡上皮細(xì)胞A549 凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，加F-12K 培養(yǎng)液（含1%青-鏈霉素、10 %胎牛血清、5 % CO237 ℃） 培養(yǎng)， 待細(xì)胞貼壁（80 %～90%）后傳代，取第3 代（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及給藥

將細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、1.25 mmol/L 二甲雙胍組、2.50 mmol/L 二甲雙胍組、5.00 mmol/L 二甲雙胍組、SB 203580 組、抑制劑組和激活劑組。 對(duì)照組細(xì)胞不做干預(yù)，H2O2組以400 μmol/L H2O2刺激A549 細(xì)胞24 h 構(gòu)建體外急性肺損傷細(xì)胞模型，1.25 mmol/L 二甲雙胍組、2.50 mmol/L 二甲雙胍組、5.00 mmol/L 二甲雙胍組在H2O2組基礎(chǔ)上分別加入1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，SB 203580 組在H2O2組基礎(chǔ)上加入10 mmol/L p38 MAPK 通路抑制劑SB 203580 進(jìn)行干預(yù)， 抑制劑組在5.00 mmol/L 二甲雙胍組基礎(chǔ)上加入10 mmol/L p38 MAPK 通路抑制劑SB 203580 進(jìn)行干預(yù)， 激活劑組在5.00 mmol/L 二甲雙胍組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L p38 MAPK 通路激活劑C16-PAF 進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)24 h（復(fù)孔×3）。 后置培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2）培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8 法

采用CCK-8 測(cè)定人肺泡上皮細(xì)胞A549 活力。

取8 組細(xì)胞（96 孔板，2×105）加細(xì)胞懸液100 μL干預(yù)24 h。加CCK-8 溶液（10 μL）培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)各孔光密度（optical density，OD）（450 nm 處）值后計(jì)算細(xì)胞活力。 細(xì)胞活力=OD（1.25 mmol/L 二甲雙胍組或2.50 mmol/L 二甲雙胍組或5.00 mmol/L 二甲雙胍組或H2O2組或SB 203580 組- 空白組）/OD （對(duì)照組-空白組）。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析法

采用ELISA 檢測(cè)人肺泡上皮細(xì)胞A549 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醇（malondialdehyde，MDA）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表達(dá)水平。

8 組細(xì)胞收集后于4 ℃、12 000 g 條件下離心（10 min） 取上清液， 按照ELISA 試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA 和IL-6 水平。測(cè)量各孔在450 nm 處的OD值后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相關(guān)因子表達(dá)水平。

1.2.5 EdU 法

測(cè)定人肺泡上皮細(xì)胞A549 增殖率。取8 組細(xì)胞，去除培養(yǎng)液后固定（4%多聚甲醛，0.5 mL）15 min，用牛血清白蛋白 （bovine serum albumin，BSA）（3 %，0.5 mL）洗滌3 次，洗去多余的多聚甲醛和細(xì)胞，然后用TritonX-100 （0.3 %，0.5 mL，10 min） 去除殘留BSA，再用BSA（3%，0.5 mL）洗滌3 次；每孔加200 μL Click 反應(yīng)液（12 孔板）后室溫下避光孵育（30 min），用BSA（3 %，0.5 mL）洗滌3 次；加入Hoechst 處理10 min 洗滌3 次后裝片，拍照（熒光顯微鏡）、數(shù)據(jù)處理（ImageJ 軟件）。 用ImageJ 分別計(jì)算紅色細(xì)胞和藍(lán)色細(xì)胞數(shù)量，最后計(jì)算細(xì)胞增殖率，計(jì)算方法為：紅色細(xì)胞數(shù)占藍(lán)色細(xì)胞數(shù)（即總細(xì)胞）的比值。

1.2.6 Hoechst 33258 染色法

測(cè)定人肺泡上皮細(xì)胞A549 凋亡率。

將干預(yù)24h 的細(xì)胞用PBS 洗滌細(xì)胞2 次（5 分/次），加入新鮮配置4%多聚甲醛，于4 ℃固定10 min。洗滌3 次，用Hoechst 33258 染色液（5 mg/L）染色10 min，洗滌3 次，封固后熒光顯微鏡觀察，對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行拍照。

細(xì)胞凋亡特征：核體積濃縮變小，染色不均濃染且所發(fā)熒光較強(qiáng)，呈亮藍(lán)色。

細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.7 Western blot 法

檢測(cè)人肺泡上皮細(xì)胞A549 中Caspase-3、Cyclin D1 與p38 MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

取各組4 h 的細(xì)胞，提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)定量后上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h 后參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗 （p38 MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3、Cyclin D1 及β-actin），孵育過夜（4 ℃）后，用洗滌緩沖溶液洗滌，加二抗（山羊抗鼠IgG，孵育2 h），洗滌（3 次），顯影后拍照（凝膠成像系統(tǒng)）記錄。蛋白表達(dá)量為目的蛋白的蛋白灰度值（G）占內(nèi)參蛋白（β-actin）的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料表示方法為均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示， 多組間表示方法為單因素方差分析，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，兩組間比較Dunnett’t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度二甲雙胍組、 對(duì)照組、H2O2 組、SB 203580 組人肺泡上皮細(xì)胞A549 活力比較

干預(yù)24 h 后，與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，1.25、2.50 mmol/L二甲雙胍組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），因此選擇在5.00 mmol/L 二甲雙胍基礎(chǔ)上分別加入p38 MAPK 通路抑制劑和激活劑作為抑制劑組和激活劑組進(jìn)行p38 MAPK 通路驗(yàn)證。見圖1。

圖1 6 組A549 細(xì)胞的細(xì)胞活力比較Fig. 1 Comparison of cell viability histograms of A549 cells in 6 groups

2.2 6 組人肺泡上皮細(xì)胞A549 SOD、MDA 和IL-6表達(dá)水平比較

干預(yù)24 h 后，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞MDA、IL-6 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），SOD 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組MDA、IL-6 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），SOD 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較， 抑制劑組MDA、IL-6表達(dá)水平進(jìn)一步下降（P＜0.05），SOD 表達(dá)水平進(jìn)一步上升（P＜0.05），激活劑組MDA、IL-6 表達(dá)水平上升（P＜0.05），SOD 表達(dá)水平下降（P＜0.05）。 見表1。

表1 6 組A549 細(xì)胞MDA、SOD、IL-6 表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of A549 cells MDA，SOD and IL-6 in 6 groups

2.3 6 組人肺泡上皮細(xì)胞A549 的增殖率比較

干預(yù)24 h 后，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞增殖率顯著降低 （0.27±0.03vs0.56± 0.03。t= 0.360，P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細(xì)胞增殖率顯著升高（0.42±0.03vs0.27±0.03，0.43 ± 0.03vs0.27 ± 0.03。t= 0.241、0.257，P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較，抑制劑組細(xì)胞增殖率進(jìn)一步上升（0.54±0.03vs0.42±0.03。t=0.192，P＜0.05）， 激活劑組細(xì)胞增殖率下降 （0.28±0.04vs0.42±0.03。t=1.225，P＜0.05）。 見圖2。

圖2 6 組A549 細(xì)胞增殖率比較EdU 增殖圖（×20，比例尺長(zhǎng)度為100 μm）Fig.2 EdU proliferation images of A549 cells proliferation rate in 6 groups(×20，scale bar:100 μm)

2.4 6 組人肺泡上皮細(xì)胞A549 凋亡情況比較

干預(yù)24 h 后，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高（68.67%±3.06%vs7.67%±1.53%。t=46.938，P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細(xì)胞凋亡率顯著降低（38.00%±3.6 %1vs68.67 % ± 3.06 %，39.00 % ± 3.61 %vs68.67 % ± 3.06 %。t= 18.082、17.493，P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較， 抑制劑組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步下降（9.00%±1.73%vs38.00%±3.61%。t=19.691，P＜0.05），激活劑組凋亡率上升（57.67%±4.51%vs38.00%±3.61%。t=9.719，P＜0.05）。 見圖3。

圖3 6 組A549 細(xì)胞的凋亡Hoechst 33258 染色圖（×20，比例尺長(zhǎng)度為100 μm）Fig.3 Hoechst 33258 staining images of A549 apoptosis in 6 groups(×20，scale bar:100 μm)

2.5 6 組人肺泡上皮細(xì)胞A549 中Caspase-3、Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平比較

干預(yù)24 h 后，H2O2組細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)水平較對(duì)照組升高（0.50±0.01vs0.05±0.01。t=0.722，P＜0.05），Cyclin D1 水平較對(duì)照組降低 （0.30 ± 0.04vs0.80±0.03。t=0.802，P＜0.05）；5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組Caspase-3 水平較H2O2組降低（0.11±0.02vs0.50±0.01，0.13±0.04vs0.50±0.01。t= 0.626、0.594，P＜0.05），Cyclin D1 水平較H2O2組上升（0.50±0.05vs0.30±0.04，0.50±0.02vs0.30±0.04。t=0.321、0.321，P＜0.05）； 在抑制劑組細(xì)胞中Caspase-3 水平較5.00 mmol/L 二甲雙胍組進(jìn)一步下降 （0.05 ± 0.01vs0.11 ± 0.02。t= 0.096，P＜0.05），Cyclin D1 水平較5.00 mmol/L 二甲雙胍組進(jìn)一步上升（0.80±0.02vs0.50±0.05。t=0.481，P＜0.05），激活劑組Caspase-3 水平上升 （0.50 ± 0.03vs0.11 ±0.02。t=0.626，P＜0.05），Cyclin D1 水平下降（0.30±0.03vs0.50±0.05。t=0.321，P＜0.05）。 見圖4。

圖4 6 組A549 細(xì)胞中Caspase-3、Cyclin D1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of A549 cells Caspase-3 and Cyclin D1 protein expression in 6 groups

2.6 6 組人肺泡上皮細(xì)胞A549 中p38 MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較

對(duì)p38 MAPK 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p38 MAPK 和p-p38 MAPK 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較，pp38 MAPK 蛋白表達(dá)水平在抑制劑組中進(jìn)一步顯著降低（P＜0.05），而在激活劑組中p-p38 MAPK 表達(dá)水平上升（P＜0.05），p38 MAPK 表達(dá)水平在各組中均無顯著性變化（P＞0.05）。 圖5、表2。

表2 6 組A549 細(xì)胞中p38 MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of A549 cells expression levels of p38 MAPK signaling pathway-related proteins in 6 groups

圖5 6 組A549 細(xì)胞中p38 MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of A549 cells p38 MAPK signaling pathway-related protein expression in 6 groups

3 討論

急性肺損傷作為臨床常見的危重急癥，發(fā)病時(shí)通常出現(xiàn)肺泡通透性增加、急性低氧性呼吸衰竭和肺泡水腫等癥狀[9]。 由于急性肺損傷發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜且尚不完全明確，目前臨床上仍有較高的病死率[10]。 機(jī)械通氣療法對(duì)癥治療急性肺損傷是唯一提高其生存率的方法，臨床多為酮康唑、抗氧化劑、營(yíng)養(yǎng)素、糖皮質(zhì)激素等對(duì)癥治療方法，還未有明確有效藥物作為治療方法[11，12]。因此，探究有效藥物治療急性肺損傷具有重要意義。

二甲雙胍是臨床上已經(jīng)應(yīng)用多年的雙胍類口服降糖藥，除具有降糖作用外，近年來研究發(fā)現(xiàn)其還能發(fā)揮抗炎效應(yīng)及減少氧化應(yīng)激損傷[13，14]。 吳柯佳[15]研究顯示二甲雙胍能夠通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK） 抑制雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（rapamycin target protein complex 1，mTORC1）減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷，從而發(fā)揮抗炎作用。另有研究表明二甲雙胍能夠通過激活信號(hào)通路起到對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[16]。 Wang Y 等[17]在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷中的研究顯示， 二甲雙胍具有減輕肺組織的損傷的作用，但二甲雙胍作用H2O2誘導(dǎo)的急性肺損傷鮮有報(bào)道。 筆者研究發(fā)現(xiàn)，H2O2組處理A549 細(xì)胞后其活力明顯降低， 而5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細(xì)胞活力明顯高于H2O2組， 提示H2O2能夠降低細(xì)胞活力，5.00 mmol/L 二甲雙胍和SB 203580 則能夠促進(jìn)細(xì)胞活力。 因只有5.00 mmol/L 二甲雙胍組與H2O2組相比細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故而筆者研究選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后A549細(xì)胞凋亡率、MDA、IL-6 表達(dá)、Caspase-3 表達(dá)水平上升，增殖率、SOD 和Cyclin D1 水平下降，說明H2O2能夠抑制細(xì)胞增殖、 誘導(dǎo)凋亡并減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。 加入5.00 mmol/L 二甲雙胍和SB 203580 處理后，則顯著扭轉(zhuǎn)了這些指標(biāo)的變化趨勢(shì)，證明二甲雙胍和SB 203580 可以抑制H2O2誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞的凋亡、氧化損傷與炎癥反應(yīng)并改善細(xì)胞增殖，這與熊存全等[18]研究結(jié)果姜黃素能夠抑制A549 細(xì)胞凋亡并對(duì)H2O2誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞急性損傷具有保護(hù)作用的報(bào)道相符。 以上結(jié)果說明了二甲雙胍在H2O2誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞急性損傷中通過上調(diào)Cyclin D1 水平促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)Caspase-3 水平抑制細(xì)胞凋亡、氧化損傷及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到保護(hù)肺組織損傷的作用。

p38 MAPK 是MAPK 家族中的重要成員之一，近年來研究表明p38 MAPK 信號(hào)通路有調(diào)控急性肺損傷炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及內(nèi)皮通透性的作用[19，20]。Zhao Y 等[21]研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK 活化后能夠上調(diào)炎癥反應(yīng)及凋亡蛋白Caspase-3/7 表達(dá)， 促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 Grimsey NJ 等[22]發(fā)現(xiàn)p38α 自磷酸化可以調(diào)控IL-6 表達(dá)，影響內(nèi)皮細(xì)胞通透性。另有研究表明阻斷p38 MAPK 信號(hào)通路能夠減輕肺損傷[23]。 上述研究表明，p38 MAPK 信號(hào)通路與急性肺損傷及炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。王貴佐等[24]研究顯示二甲雙胍具有保護(hù)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷的作用。 武麗濤等[25]在二甲雙胍對(duì)急性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后，IL-6 表達(dá)水平降低，可能是通過抑制p38 MAPK 信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)。 另有在LPS 所致急性肺損傷研究中顯示黃芩苷能夠通過抑制p38 MAPK 信號(hào)通路起到有效保護(hù)作用[26]。 因此，筆者為探究二甲雙胍對(duì)H2O2誘導(dǎo)的急性肺損傷與p38 MAPK 信號(hào)通路的調(diào)控作用，開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)后p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組， 在加入5.00 mmol/L 二甲雙胍和SB 203580 后p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)顯著低于H2O2組，這提示可能是因?yàn)槎纂p胍和SB 203580抑制了p38 MAPK 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 在5.00 mmol/L二甲雙胍組基礎(chǔ)上分別加入p38 MAPK 信號(hào)通路抑制劑SB 203580 和激活劑C16-PAF 進(jìn)行p38 MAPK通路進(jìn)行驗(yàn)證， 發(fā)現(xiàn)加入抑制劑后， 細(xì)胞凋亡率、MDA、IL-6 表達(dá)、Caspase-3、p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低， 增殖率、SOD 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水則進(jìn)一步升高，而激活劑組則扭轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)。 提示二甲雙胍促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞的增殖，抑制凋亡、 氧化損傷及炎癥反應(yīng)， 可能是通過抑制p38 MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，筆者實(shí)驗(yàn)證明二甲雙胍能夠顯著緩解H2O2誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞A549 炎癥反應(yīng)，減輕氧化損傷，并通過上調(diào)Cyclin D1 促進(jìn)增殖，下調(diào)Caspase-3 抑制細(xì)胞凋亡， 其作用機(jī)制可能與抑制p38 MAPK 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。接下來可探究二甲雙胍是否通過其他信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的急性肺損傷保護(hù)作用，為阻斷急性肺損傷的相關(guān)研究提供新的切入點(diǎn)。