肽酰精氨酸脫氨酶4和組蛋白H3瓜氨酸化與高級別腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)性研究

孔晨旭 ,李振江 ,耿慧霞 ,王來

1 河南大學 淮河醫(yī)院,河南 開封 475004;2 河南大學 護理與健康學院,河南 開封 47600;3 河南大學 生命科學學院,河南開封 47600

腦膠質(zhì)瘤又稱為神經(jīng)膠質(zhì)瘤,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤,WHO 將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個級別。低級別膠質(zhì)瘤向高級別類型轉(zhuǎn)化、進展迅速,且具有很強的侵襲性和對化療的不敏感性。膠質(zhì)瘤的級別越高,患者的生存期越短,如Ⅳ級別膠質(zhì)瘤患者的生存期一般小于15個月。多種病理機制參與膠質(zhì)瘤級別的進展,如腫瘤細胞分泌胞外囊泡通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境內(nèi)細胞之間信息的交流,促進膠質(zhì)瘤的級別的進展、復(fù)發(fā)、侵襲和抗藥性[1]。

肽基精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminases,PADs)是蛋白質(zhì)翻譯后加工過程中的一類同工酶,該酶可將蛋白質(zhì)表面的精氨酸殘基脫氨后轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釟埢?具有很強的底物結(jié)合特異性并且在不同的組織中發(fā)揮不同的生理功能[2]。高等生物共有PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6等5類肽酰精氨酸脫亞胺酶亞型[3]。PAD4由于具有經(jīng)典的核定位信號,推測其為唯一一個定位于細胞核內(nèi)的肽基精氨酸脫氨酶,暗示其在基因表達調(diào)控方面的重要作用[4]。PAD4通過瓜氨酸化H3和H4組蛋白中的多個精氨酸殘基,在中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps,NETs)形成和機體抵御微生物入侵的先天免疫方面發(fā)揮重要作用[5]。近年的研究發(fā)現(xiàn),PAD4調(diào)控組蛋白的瓜氨酸化廣泛參與腫瘤的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。然而,PAD4的表達水平及其介導(dǎo)的組蛋白3瓜氨酸化(citrullinated Histone H3,H3cit)與高級別腦膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系并不明確。本研究以腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)標本為研究材料,觀察PAD4和H3cit的表達水平與高級別腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系,以期對膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供科學的參考。

圖1 正常與高級別腦膠質(zhì)瘤PAD4的表達情況

圖2 正常組織與高級別腦膠質(zhì)瘤組蛋白3瓜氨酸化表達情況

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2021年1月—2022年1月在河南大學淮河醫(yī)院進行手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者30例,其中:男22例、女8例;年齡36～72歲,平均(50.1±6.3)歲。取瘤旁正常組織為對照組。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)中的分級法對腫瘤進行分級,Ⅲ級有18例,Ⅳ級有12例。本研究已獲得河南大學生物醫(yī)學科研倫理分委員會的準許(HUSOM2021-0106),并獲得了患者或家屬的書面知情同意書。

1.2 免疫組織化學檢測

將所有的組織標本用中性甲醛固定,石蠟包埋,石蠟切片機以4～5 μm的厚度切片;烤箱烤片,二甲苯脫蠟,不同梯度乙醇水化,去離子水漂洗充分。切片浸泡檸檬酸抗原修復(fù)液中,微波爐加熱進行抗原修復(fù)。切片置于去離子水中浸泡,滴加內(nèi)源性過氧化物酶,室溫避光放置5 min,PBS緩沖液沖洗。滴加小鼠抗PAD4一抗(1∶200,Abcam,貨號:128086)和兔抗H3cit一抗(1∶150,Abcam,貨號:5103),37 ℃孵育2 h,PBS緩沖液沖洗3次。滴加HRP標記的抗小鼠/兔IgG二抗(中杉金橋),室溫孵育30 min,PBS緩沖液沖洗。DAB顯色試劑盒(Solarbio,貨號:DA1010)顯色。光學顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤PAD4表達增加

臨床標本檢測(圖1)顯示,PAD4在細胞核內(nèi)表達,但在正常組織內(nèi),表達水平較低,而Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤細胞表達水平遠遠高于正常組織,且表達水平的高低隨膠質(zhì)瘤分期的增加而增加。

2.2 Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組蛋白H3瓜氨酸化增加

臨床標本檢測(圖2)顯示,Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤細胞核內(nèi)組蛋白3的瓜氨酸化急劇增加,而正常組織細胞的核內(nèi),組蛋白3的瓜氨酸化水平較低,且隨著膠質(zhì)瘤分期的增加而瓜氨酸化水平亦增加,呈現(xiàn)一定的正相關(guān)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度異質(zhì)性腫瘤,嚴重威脅人類健康,預(yù)后效果極差[6]。WHO 根據(jù)腫瘤細胞周圍血管增生與細胞核分裂情況,將Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤歸為低級別,將Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤歸為高級別。膠質(zhì)瘤的級別越高,患者的生存期越低,其中,膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的惡性程度最高,5 a生存期低于6.9%[7]。目前,手術(shù)切除和術(shù)后的藥物化療相結(jié)合是治療膠質(zhì)瘤的主要選擇,但患者的預(yù)后依然很差[6]。隨著小分子藥物和抗體藥物的研發(fā)和應(yīng)用促使了腫瘤患者精準治療的實現(xiàn),因此探討不同分級腦膠質(zhì)瘤的特異分子更為重要[8]。

PADs的主要生物學功能是參與蛋白質(zhì)翻譯后精氨酸殘基的瓜氨酸化。PAD4通過調(diào)控中性粒細胞組蛋白H3的瓜氨酸化從而參與胞外誘捕網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps,NETs)形成,參與機體的固有免疫反應(yīng)。進一步的研究表明,PAD4調(diào)控的機體多種蛋白多肽鏈的精氨酸殘基瓜氨酸化組成了關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腫瘤等多種疾病的病理基礎(chǔ)[9]。哺乳動物有5 個PADs 酶家族成員,其中PAD2 和PAD4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重大作用[10]。PAD2超表達轉(zhuǎn)基因鼠促進皮膚癌的形成,通過STAT3信號通路的磷酸化調(diào)控腫瘤微環(huán)境狀態(tài)增強癌細胞的惡變率和轉(zhuǎn)移[11-12],而PAD4調(diào)控腫瘤細胞染色質(zhì)絲形成促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。對星形膠質(zhì)細胞瘤的研究[14-15]也表明,PAD4的表達增高,然而并沒有檢測到PAD2 和PAD3表達水平的增加。本文研究結(jié)果顯示,PAD4和H3cit在Ⅲ和Ⅳ級的腦膠質(zhì)瘤組織比正常組織表達水平增高,且隨著膠質(zhì)瘤級別的增加,表達量增加明顯,提示PAD4和H3cit的高表達與高級別腦膠質(zhì)瘤的進展相關(guān),有可能作為腦膠質(zhì)瘤的精準治療靶點。

外分泌體是促進膠質(zhì)母細胞瘤促瘤微環(huán)境形成的主要調(diào)控因子。肽酰精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminases,PADs)調(diào)控膠質(zhì)細胞瘤胞外囊泡(exosomes and microvesicles,EVs)的形成,影響囊泡內(nèi)分子變化,改變其功能[16]。廣譜PAD 抑制劑Cl-amidine影響膠質(zhì)母細胞瘤外分泌體的釋放和外分泌體攜帶microRNA 水平,如降低促瘤microRNA21的水平,增加抗瘤microRNA126的水平。膠質(zhì)母細胞瘤細胞內(nèi),觀察到阻抑素瓜氨酸化的增加,從而維持細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)定性和癌細胞的抗藥性。廣譜PAD抑制劑處理1 h后,PHB的瓜氨酸和表達水平降低,H3的瓜氨酸化也降低。這些結(jié)果提示,PAD修飾GBM 細胞內(nèi)蛋白的瓜氨酸化變化及內(nèi)分泌體的釋放表明PADs是修飾GBM 腫瘤細胞間通訊的新的靶標[17]。不同PADs亞型的特異性抑制劑作用不同GBM 細胞系提示對外分泌體的釋放和miRNA的影響是不同的,提示不同PAD的表達決定GBM 的異質(zhì)性并具有潛在的特異性治療特性[18]。這些研究結(jié)果提示,PAD4活性的小分子抑制劑有可能作為抑制膠質(zhì)瘤進展的潛在治療藥物。

綜上所述,PAD4和H3cit的高表達水平與高級別腦膠質(zhì)瘤存在一定的相關(guān)性,對這兩個蛋白分子的檢測有利于高級別腦膠質(zhì)瘤的病理診斷,也為腦膠質(zhì)瘤患者的精準治療提供參考依據(jù)。