響應面法結合超聲輔助提取烏梅總黃酮工藝研究

劉麗軍 ,姚李欣 ,盧文芳 ,王金梅 ,張娟娟?

1 河南大學 淮河醫(yī)院,河南 開封 475000;2 黃河科技學院 河南省食藥兩用植物資源綜合利用工程技術研究中心,鄭州 450063;3 河南大學 國家食用菌加工技術研發(fā)專業(yè)中心,河南 開封 475004

烏梅為薔薇科杏屬植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥近成熟并烘制的果實,作為藥材首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其性平,味酸,澀,歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)。烏梅為藥食同源中藥材,具有斂肺止咳、澀腸止瀉、消腫解毒、生津止渴和安蛔等功效[1]。常見的烏梅炮制品包括凈烏梅、烏梅炭、烏梅肉和醋烏梅,其主要化學成分為有機酸類、糖類、脂類、甾醇類、生物堿類、黃酮類、萜類等[2-3]?，F(xiàn)代藥理學研究[4-6]顯示,烏梅具有抑菌、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤、抗氧化等作用。隨著研究的深入,在現(xiàn)代醫(yī)學中烏梅及其提取物已開始應用于臨床,并在抗過敏[7]、口腔抑菌[8]、止瀉[9]等方面開始發(fā)揮重要作用。

植物中總黃酮的常用提取方法包括浸取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解提取法、超臨界流體萃取法等,其中超聲輔助提取已被證明在輔助植物材料提取過程中可以顯著縮短提取時間和提高提取率。在超聲應用過程中,會產(chǎn)生空化效應和機械效應,從而使溶劑更容易滲透到植物原料中,破壞植物細胞壁,促進有效成分釋放[10-11]。因此,本試驗選用超聲輔助提取烏梅總黃酮,在單因素試驗的基礎上通過響應面法優(yōu)化烏梅總黃酮的提取工藝,為其進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

烏梅(購自張仲景大藥房,樣品保藏于河南省黃河科技學院藥用資源綜合利用重點實驗室);蘆丁對照品(黃河科技學院河南省食藥用植物資源綜合利用工程技術研究中心提供,純度達98%以上);無水甲醇、乙醇(天津市富宇精細化工有限公司);硝酸鋁、亞硝酸鈉(天津市德恩化學試劑有限公司)。

BSA224S型電子天平(德國賽多利斯公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(500 W、40 kHz,昆山市超聲儀器有限公司);高速多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱量25 mg蘆丁標準品置50 mL容量瓶,加無水乙醇溶解定容至刻度,搖勻得0.5 mg/mL蘆丁對照品溶液。精密吸取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL可密封試管中,各加水至5 mL,混合搖勻;分別加質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液0.6 mL,搖勻后靜置6 min。加入質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH 溶液3.0 mL,加水至刻度線,搖勻后靜置15 min,于506 nm 波長處吸測定光度A。以蘆丁濃度c為橫坐標,吸光度A為縱坐標繪制標準曲線[12-13],如圖1所示:

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.2 烏梅總黃酮的提取

稱取干燥烏梅200 g,粉碎后過30目篩。稱取1.0 g的烏梅粉置于錐形瓶中,在一定的甲醇料液比、提取溫度和提取時間的條件下進行總黃酮的超聲提取,然后將得到的提取液過濾,定容至25 mL容量瓶,備用。

1.2.3 烏梅總黃酮的測定

準確量取樣品溶液0.3 mL于10 mL 比色管中,按照1.2.1節(jié)中所述方法進行操作,按下式計算黃酮提取量。

式中:W表示黃酮提取量,mg/g;c表示根據(jù)吸光度值計算出的溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;D表示溶液的稀釋倍數(shù);m 表示藥材的取樣量,g。

1.2.4 單因素實驗

采用1.2.2節(jié)中烏梅總黃酮的提取方式,料液比(1∶20 g/mL,1∶30 g/mL,1∶40 g/mL,1∶50 g/mL,1∶60 g/mL,1∶70 g/mL)、粉碎目數(shù)(10,20,30,40,50,60 目)、提取溫度(10 ℃,20 ℃,30 ℃,40 ℃,50 ℃,60 ℃)和提取時間(20 min,30 min,40 min,50 min,60 min,70 min)這4個因素作為單因素實驗條件,考察單因素對烏梅中總黃酮提取量的影響。

1.2.5 響應面實驗設計

綜合單因素實驗,選取料液比(X1)、粉碎目數(shù)(X2)、提取溫度(X3)和提取時間(X4)為響應面模型的自變量。以烏梅中總黃酮提取量為評價指標,運用Design-Expert 8.0.6軟件設計,每個因素共涉及高、低、中三個水平分別用 1、0、-1表示,變量水平見表1。

表1 Box-Behnken法試驗設計因素和水平

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗中依次改變單一變量料液比、粉碎目數(shù)、提取溫度和提取時間,各試驗均平行3次,結果取平均值。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對烏梅總黃酮提取量的影響

由圖2可知,隨著料液比的增加,烏梅總黃酮提取量逐漸增加,當固液比為1∶60時,烏梅總黃酮提取量達到最大,繼續(xù)增大料液比,提取率反而趨于下降?？赡苁且驗殡S著料液比的繼續(xù)增加,溶劑的滲透壓增大,導致其他雜質(zhì)溶出,目標分析物的提取率下降。料液比過小會導致藥材內(nèi)的有效成分提取不完全,而過大又會造成溶劑的浪費,因此選擇固液比1∶60。

圖2 料液比對烏梅總黃酮提取量的影響

2.1.2 粉碎目數(shù)對烏梅總黃酮提取量的影響

中藥有效成分提取時,藥材粉碎大小對提取率影響很大。藥材粉碎顆粒越小,與溶劑的有效接觸面積就越大,提取率越高。在上述優(yōu)化條件的基礎上,考察粉碎目數(shù)分別為10、20、30、40、50、60目時,對烏梅總黃酮提取量的影響。結果見圖3。40目分樣篩對梅總黃酮提取量最高,這是因為粉末粒度越小,樣品中含有的有效成分越易被提取,但當粉末粒度太小時,容易被溶劑凝聚成團,從而阻礙有效成分的釋放[14]。因此選擇過篩目數(shù)40目。

圖3 粉碎目數(shù)對烏梅總黃酮提取量的影響

2.1.3 提取溫度對烏梅總黃酮提取量的影響

在上述優(yōu)化條件的基礎上,考察超聲溫度分別為10、20、30、40、50、60 ℃時,對烏梅總黃酮提取量的影響。結果如圖4所示,隨著提取溫度的升高,目標分析物提取率逐漸增大,當提取溫度為50 ℃時,提取率最大,但溫度繼續(xù)升高,提取率出現(xiàn)不斷降低的趨勢。原因可能是繼續(xù)升高體系的溫度,過高的溫度會使總黃酮中結構被破壞;也可能因為隨著溫度升高,細胞中其他內(nèi)容物溶出增多,導致溶液黏度增大,影響目標分析物向外溶出,從而使提取率下降。所以,選擇提取溫度50 ℃。

圖4 提取溫度對烏梅總黃酮提取量的影響

2.1.4 提取時間對烏梅總黃酮提取量的影響

在上述優(yōu)化條件的基礎上,考察提取時間分別為20、30、40 min、50、60、70 min時,對目標分析物提取率的影響,結果如圖5。隨著超聲波提取時間的增加,烏梅總黃酮提取量都有所增加,當超聲波時間增加至60 min時,提取率均達到頂峰,超聲波提取時間繼續(xù)增加,提取率趨于下降。其原因可能是總黃酮提取量基本達到飽和,不再明顯溶出。此外,提取時間過長會破壞異黃酮類化合物的結構,提取率下降[15]。因此,本試驗選擇超聲波提取60 min為最優(yōu)條件。

圖5 提取時間對烏梅總黃酮提取量的影響

2.2 Box-Behnken響應面法結果與分析

2.2.1 響應面優(yōu)化設計試驗結果

結合上述實驗結果,以料液比(X1)、粉碎目數(shù)(X2)、提取溫度(X3)和提取時間(X4)為考查對象,以烏梅總黃酮提取量(Y)為響應值,調(diào)整提取方案(見表2)。利用 Design-Eepert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合,建立二次多元回歸方程:

表2 響應面試驗方案和結果

回歸模型方差分析見表3。

表3 響應面模型方差分析

由表3 可知,回歸模型具有極顯著性(P＜0.001),失擬項不顯著(P＞0.05),說明該模型成立。模型的決定系數(shù)R2=0.966 8,校正決定系數(shù)=0.933 7,模型的決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)均較高且接近,說明模型準確性和通用性較高,可以用來分析和預測離子液體對3個目標化合物提取的效果。一次項X1,交互項X1X3、X1X4、X2X4、X3X4,二次項、對烏梅總黃酮提取量均有極顯著的影響(P＜0.01);二次項對烏梅總黃酮提取量具有顯著影響(P＜0.05);一次項X2、X3、X4,交互項X1X2、X2X3,二次項差異不顯著(P＞0.05)。單因素的P值大小也反映了各因素對目標化合物提取效率的影響程度。從結果來看,對烏梅總黃酮提取量影響最大的因素是料液比(X1)。

響應曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強弱,采用Design-Exper軟件對響應曲面圖進行分析,可以得到各因素交互作用對響應值的影響,結果見圖6。如果響應曲面較陡峭,說明該因素對烏梅總黃酮提取量的影響較大,響應值對于提取條件的改變就越敏感;如果響應曲面相對平緩,說明該因素的波動對響應值的影響較小[16]。由圖6,從響應面圖陡度可以看出來,料液比、提取時間相互作用最強烈,粉碎目數(shù)、提取溫度因素相互作用最弱。隨著料液比的增加,烏梅總黃酮提取量緩慢增加到最大值時,然后逐漸下降。隨著粉碎目數(shù)的增加提取率不斷增加,之后隨粉碎目數(shù)的增加,提取率變化不大。

圖6 各因素交互作用總黃酮提取量的響應面與等高線圖

2.2.2 最佳工藝的確定及試驗驗證

通過 Design-Exper 軟件對回歸方程進一步分析預測,取整數(shù)調(diào)整得出最佳工藝參數(shù)為:料液比,50 mL/g;粉碎目數(shù),30目;提取溫度,40 ℃;提取時間,70 min。在此最佳工藝條件下,對建立的數(shù)學模型進行驗證實驗,烏梅總黃酮提取量實際測得值為63.19 mg/g,與預測值(62.77 mg/g)相近,說明響應面分析法所得烏梅總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)準確可靠。

3 結論

本課題在單因素試驗的基礎上,利用響應面法優(yōu)化了烏梅總黃酮的超聲提取工藝。結果表明,在料液比50 mL/g、粉碎目數(shù)30目、提取溫度40 ℃和提取時間70 min的條件下,烏梅總黃酮的提取量為63.19 mg/g。與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲提取烏梅總黃酮時間更短,效率更高。與單因素方法相比,響應面法所得的料液比50 mL/g和提取溫度40 ℃低于單因素方法的料液比60 mL/g和提取溫度50 ℃,從經(jīng)濟角度考慮,低料液比和提取溫度更節(jié)約成本和能耗。因此,本研究結果可為烏梅總黃酮的有效提取提供依據(jù)。