一例蛋雞J 亞群禽白血病的診斷

周戈 ，儲(chǔ)濤

（1.嵐皋縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)中心 陜西安康 725400；2.嵐皋縣佐龍鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站 陜西安康 725400）

禽白血病病毒（Avian Leukosis Viruses，ALV）是一類主要引起禽類各種造血細(xì)胞腫瘤性增生為特征的反轉(zhuǎn)錄病毒群[1]。該病病毒群根據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原差異性、病毒干擾實(shí)驗(yàn)、宿主范圍和基因組的分子生物學(xué)等特征，總共分為10 個(gè)亞群，被命名為A 亞群至J 亞群。其中A、B、C、D 亞群為外源性病毒，能夠誘發(fā)腫瘤性新生物；E、F、G、H、I 亞群為內(nèi)源性病毒，沒有致瘤性；J 亞群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus，ALV-J）具有其他亞群的所有特性，同時(shí)也表現(xiàn)出自身獨(dú)特性，其傳播性和致病性均比其它亞群強(qiáng)。近幾年國內(nèi)出現(xiàn)的禽白血病感染病例主要以J 亞群病毒感染為主[2]。

禽白血病的傳播方式有兩種，即水平傳播、垂直傳播[3]。水平傳播的途徑是直接接觸。除了直接接觸傳染外；間接方式也可以導(dǎo)致傳染。垂直傳播的途徑是從帶有禽白血病的種雞場(chǎng)引種，從而孵化出的雞苗帶毒。發(fā)病蛋雞主要表現(xiàn)為食欲不振、貧血、極度消瘦、產(chǎn)蛋率下降等癥狀；剖檢后可發(fā)現(xiàn)極度消瘦，龍骨發(fā)育不全，全身性貧血，增生型的特征性肉眼病變是肝、脾、腎呈彌漫性腫大；而且雞胚也發(fā)生病變。該病可以抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的表達(dá)，能引起雞多種具有傳染性的良性和惡性腫瘤，其高死亡率和淘汰率給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

禽白血病流行主要原因是種雞群凈化不徹底，無法控制傳染源，導(dǎo)致大量流行。筆者在安康嵐皋農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)期間，參與接診了一起安康嵐皋某雞場(chǎng)蛋雞死亡的病例，經(jīng)過一系列的檢測(cè)，最終確診為ALV-J 感染。現(xiàn)將基本情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1）發(fā)病情況。2021 年9 月，安康嵐皋某雞場(chǎng)12 月齡蛋雞出現(xiàn)食欲不振、精神沉郁、貧血、極度消瘦、產(chǎn)蛋率下降等癥狀，雞場(chǎng)飼養(yǎng)土雞數(shù)量約為4 000 羽。該雞群于2021 年9 月12 日開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，到9 月16 日為止共計(jì)發(fā)病400 羽，發(fā)病率為4.4%，死亡40 羽，死亡率10%。該雞場(chǎng)蛋雞的飼養(yǎng)方式是散養(yǎng)，免疫程序?yàn)槌Ｒ?guī)免疫，采用的飼料為全價(jià)飼料。觀察畜主帶過來的飼料樣品，未發(fā)現(xiàn)有霉變的情況，求診之前沒有使用過藥物，由此排除了中毒等原因造成蛋雞出現(xiàn)此癥狀的可能性，初步懷疑蛋雞出現(xiàn)此癥狀是傳染病造成的。再結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢結(jié)果，篩選出細(xì)菌、禽流感（AIV）、新城疫（NDV）和禽白血病四個(gè)可疑病因。

2）臨床癥狀。觀察病雞，可見縮頸，雞冠蒼白皺縮，食欲不振，精神沉郁，極度消瘦，排灰色稀狀糞便。病情嚴(yán)重的蛋雞甚至不能站立。

3）儀器與試劑。普通瓊脂培養(yǎng)基、50×TAE 緩沖液、雙蒸水、PBS溶液和75%乙醇為本實(shí)驗(yàn)室制備保存；革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；2×Buffer PCR Master Mix 購于天根生化科技（北京）有限公司；EB（Ethidium bromide，EtBr）、瓊脂糖、氯仿和異丙醇為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。生化培養(yǎng)箱：LRH-25oA 型廣東醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)：SPEGAIRTECH；PCR 儀：Hybaio 公司；冷凍高速離心機(jī)：18PR-52 型日本；冷凍臺(tái)式離心機(jī)：Heitthc 公司產(chǎn)品；紫外分光儀：PE 公司；電泳設(shè)備：BIORAD 公司。

1.2 方法

1）細(xì)菌的分離與鑒定。細(xì)菌分離培養(yǎng)：用接種環(huán)取心包積液、肝臟切面接種于普通瓊脂板上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h。觀察菌落形態(tài)。

2）AIV 和NDV 的PCR 檢測(cè)。利用實(shí)驗(yàn)室已確定的禽流感和新城疫病毒RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)采集的病料進(jìn)行檢測(cè)。

病料研磨：無菌條件下采集病雞胰臟、脾臟、肝臟等病料，2～8 ℃保存。取組織混樣約0.5 g，加1 mL 生理鹽水研磨到?jīng)]有塊狀的混雜液，然后將樣品轉(zhuǎn)到1.5 mL 滅菌離心管中，8 000 rpm 離心2 min，取100 μL 的上清液至1.5 mL 滅菌離心管當(dāng)中。

總RNA 提取：利用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。

①病料組織中加2～3 mLPBS 研磨，凍融三次8 000 r/min 離心3 min；②取上清液200 μL 樣品+1 mL Trizol 酶4 ℃裂解10～20 min；③加200 μL 氯仿，充分振蕩，12 000 r/min 離心10 min；④取上清液400 μL ，加等量的異丙醇，手動(dòng)上下顛倒混勻，4 ℃靜置10～20 min；⑤12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入750 μL 75%乙醇，手動(dòng)上下顛倒混勻；⑥12 000 r/min 離心10 min；⑦棄上清液，倒置在濾紙上，吹干5 min，加10 μL ddH2O。

反轉(zhuǎn)錄：用上述提取的總RNA 為模板，用OligaodT 引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體步驟按照TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄體系（見表1）說明書按如下進(jìn)行。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

AIV 和NDV 引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)AIV 和NDV 的保守片段，同時(shí)采用Primer Express 5.0 軟件，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增片段為453 bp 的AIV 的一對(duì)引物，擴(kuò)增片段為421 bp 的NDV 的一對(duì)引物，由TaKaRa 公司合成，引物序列如下：

AIV：P1:5’-ATGAGTCTTCTTCCGAGGTCA-3’；P2:5’-ACTCCA GCTCGTGTTGACAAT-3’

NDV：P1:5’-TTATAGTTAGTTTACCTGTCT-3’；P2:5’-GTAGTT TTTTCTTAAATCTTC -3’

AIV 和NDV 的PCR 擴(kuò)增（見表2）：

表2 AIV和NDV的PCR體系

AIV 的PCR 反應(yīng)體系：反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；PCR 產(chǎn)物4 ℃保存。

NDV 的PCR 反應(yīng)體系：反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；PCR 產(chǎn)物4 ℃保存。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分析：稱取0.3 g 瓊脂糖加入30 mL TAE 緩沖液，搖勻，微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，將制膠板放入制膠槽中，插入合適的梳子，將溶解的瓊脂糖TAE 緩沖液加入2 μL EB 后，混合均勻，倒入其中，直至厚度達(dá)4～6 mm，在室溫下冷卻凝固。將AIV的PCR 和NDV 的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物以及DL 600 Marker 在100 V 電壓下電泳30 min 后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行分析。

3）ALV-J 的PCR 檢測(cè)。從病雞中提取病料后進(jìn)行PCR 檢測(cè)。根據(jù)ALV-J 原始毒株HPRS-103 的基因組DNA-gp85 基因中的一段序列設(shè)計(jì)引物。引物序列如下：

P1:5’-CCCAAGCTTGGAGTTCATCTGTTGCGA-3’

P2:5’-CGCGGATCCGCGCCTGCTACGGCGGT-3’

ALV-J 的PCR 擴(kuò)增（見表3）：

表3 ALV-J的PCR反應(yīng)體系

ALV-J 的PCR 反應(yīng)體系：反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分析：稱取0.3 g 瓊脂糖加入30 mL TAE 緩沖液，搖勻，微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，將制膠板放入制膠槽中，插入合適的梳子，將溶解的瓊脂糖TAE 緩沖液加入2 μL EB 后，混合均勻，倒入其中，直至厚度達(dá)4～6 mm，在室溫下冷卻凝固。將ALV-J 的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物以及DL 2000 Marker 在100 V 電壓下電泳30 min 后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行分析。預(yù)期擴(kuò)增目的片段為968 bp。

2 結(jié)果

2.1 病理變化

對(duì)病死雞進(jìn)行解剖，可見極度消瘦，龍骨發(fā)育不全，全身性貧血，主要病變情況有肝臟腫脹、脾臟腫脹、心冠狀脂肪消失、心臟腫瘤、肌肉腫瘤、腎臟腫瘤、肌胃腫瘤。

觀察畜主帶來的飼料樣品，沒有發(fā)現(xiàn)其他可導(dǎo)致雞出現(xiàn)此類情況的物質(zhì)，并且在此之前并沒有進(jìn)行藥物治療，所以初步懷疑是傳染病。

2.2 病因初步分析

根據(jù)臨床檢查與詢問得知，飼養(yǎng)規(guī)模約為9 000 羽，共計(jì)發(fā)病400 羽，發(fā)病率4.4%，死亡40 羽，死亡率10%。觀察畜主帶過來的飼料樣品，沒發(fā)現(xiàn)有霉變的情況，求診之前沒有使用過藥物，由此排除了中毒等原因造成蛋雞出現(xiàn)此癥狀的可能性，初步懷疑蛋雞出現(xiàn)此癥狀是傳染病造成的。再結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢結(jié)果，篩選出細(xì)菌、禽流感、新城疫和禽白血病四個(gè)可疑病因。

2.3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

培養(yǎng)24 h 后，發(fā)現(xiàn)普通瓊脂板上并無菌落，所以排除細(xì)菌的感染。

2.4 AIV 和NDV 的PCR 檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用RT-PCR 方法進(jìn)行禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）檢測(cè)，結(jié)果在條帶大小為460 bp 附近沒有擴(kuò)增出片段（見圖1）。所以排除AIV 和NDV 的感染。

圖1 禽流感病毒新城疫病毒PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.5 ALV-J PCR 的檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用PCR 方法進(jìn)行禽白血病病毒的檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出目的片段968 bp（見圖2）?？梢赃M(jìn)一步懷疑該病毒為ALV-J。

圖2 禽白血病病毒PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.6 序列分析

將禽白血病病毒PCR 產(chǎn)物送上海生物公司測(cè)序：將測(cè)得的序列與NCBI 網(wǎng)站上基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)（見表4）。

表4 J亞群禽白血病病毒DNA序列比對(duì)結(jié)果

由表4 可知，該檢測(cè)病樣DNA 序列與多株J 亞群禽白血病病毒DNA 序列同源性達(dá)99%，確定該病為禽白血病。

2.7 病因確定和處置

綜上所述，可以確定該雞場(chǎng)蛋雞是由ALV-J 感染所引起的，無細(xì)菌和AIV 以及NDV 感染。建議從以下幾個(gè)方面來預(yù)防：①保證充足的飼養(yǎng)密度；②提供合理的營(yíng)養(yǎng)，保證雞群的正常生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的充分發(fā)育；③淘汰病雞，防止正常雞受到感染；④防止雞群的垂直傳播和水平傳播，種蛋孵化應(yīng)選擇健康、不帶毒的孵化雞苗；及時(shí)清理病雞和可疑雞的排泄物和分泌物。

3 討論

從臨床上觀察病雞，可見縮頸，雞冠蒼白皺縮，食欲不振，精神沉郁，極度消瘦，排灰色稀狀糞便。病情嚴(yán)重的蛋雞甚至不能站立。對(duì)病死雞進(jìn)行解剖，可見極度消瘦，龍骨發(fā)育不全，全身性貧血，主要病變情況有肝臟腫脹，脾臟腫脹，心冠狀脂肪消失，心臟腫瘤，肌肉腫瘤，腎臟腫瘤，肌胃腫瘤。由此我們可以初步推斷出是ALV-J感染，或者與其他病菌混合感染，所以我們要進(jìn)行多方面的檢測(cè)來確定確切病因。首先我們進(jìn)行了細(xì)菌的分離與鑒定[4]，發(fā)現(xiàn)并無細(xì)菌感染，其次我們對(duì)病料進(jìn)行了AIV 和NDV 的PCR 檢測(cè)，病毒經(jīng)引物進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)凝膠電泳圖可以看出AIV 和NDV 為陰性，由此我們可以判斷此病例沒有AIV 和NDV 的混合感染。

最后對(duì)ALV-J 進(jìn)行了PCR 檢測(cè)，在PCR 檢測(cè)中，利用Marker（2 000 bp）陽性對(duì)照與陰性對(duì)照作為對(duì)照，從結(jié)果來看，被檢病樣DNA 大小均為968 bp 左右，將PCR 產(chǎn)物和rDNA 引物送至上海生物公司進(jìn)行測(cè)序后與NCBI 進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，該病樣與ALV-J有99%的同源性，確定該病為J 亞群禽白血病。

3.1 禽白血病易發(fā)原因

禽白血病易發(fā)離不開它的垂直傳播；雞場(chǎng)如若從帶有禽白血病的種雞場(chǎng)接種，從而孵化出帶毒的雞苗，使得禽白血病在雞群中世代存在提供了途徑。

其次，禽白血病的水平傳播是該病易發(fā)的主要傳播方式[5]；雞群在狹小的飼養(yǎng)空間里，正常雞很容易直接接觸病雞，且病雞的排泄物和分泌物也很容易被病雞所接觸，這給禽白血病的水平傳播提供了便捷的途徑。

再而，我國某些地方種雞本身就帶有禽白血病，畜主如若沒有及時(shí)發(fā)現(xiàn)并淘汰，此種雞便會(huì)成為傳染源，讓禽白血病肆意傳播。另一方面，如若疫苗受到禽白血病感染，然后將受污染的疫苗接種于雞群上，整個(gè)雞群將感染禽白血病，后果不堪設(shè)想。

禽白血病易發(fā)主要的原因還是種雞群凈化不徹底，無法控制傳染源，導(dǎo)致大量流行；如果不從源頭來預(yù)防禽白血病，禽白血病將屢禁不止。

3.2 禽白血病的預(yù)防

預(yù)防禽白血病主要還是種雞群凈化，畜主應(yīng)當(dāng)做好以下幾個(gè)方面：

①防止垂直傳播。畜主應(yīng)當(dāng)從沒感染禽白血病的種雞場(chǎng)接種，從而孵化出不帶毒、健康的雞苗；這樣可以從種源處杜絕污染，給雞群提供了可持續(xù)發(fā)展的道路；②防止水平傳播。畜主應(yīng)當(dāng)時(shí)刻關(guān)注雞群，發(fā)現(xiàn)病雞或可以排下的糞便或分泌物應(yīng)及時(shí)采取堆漚、生物發(fā)酵、消毒等手段，來殺死病毒[6]；③防止疫苗污染。在制造疫苗過程中，應(yīng)防止疫苗被禽白血病毒（ALV）感染，否則接種疫苗后將引起大規(guī)模的蛋雞發(fā)病，后果不堪設(shè)想，因此，雞場(chǎng)應(yīng)選用品質(zhì)有保證的疫苗；④凈化環(huán)境與消毒。對(duì)雞舍定期進(jìn)行高溫消毒，用酸性消毒劑噴灑消毒，可大量殺死病原，減少禽白血病發(fā)病率；⑤加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。對(duì)產(chǎn)蛋前后的易感群采取主動(dòng)保護(hù)措施，關(guān)注外界環(huán)境對(duì)雞群的影響。飼喂品質(zhì)可靠的飼料，及時(shí)清理發(fā)霉、變質(zhì)的飼料，保證雞群的正常生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的充分發(fā)育，合理添加維生素和微量元素來增強(qiáng)雞群的免疫力[7]；⑥保證充足的飼養(yǎng)密度。合理區(qū)分雞群，保證雞群不同大小個(gè)體不同欄舍等。保證充足的飼養(yǎng)密度，防止雞群擠在一起生活，隨著蛋雞的生長(zhǎng)發(fā)育，畜主應(yīng)當(dāng)適當(dāng)調(diào)整雞舍的大小來減少禽白血病的發(fā)病率。

4 結(jié)論

1）從安康嵐皋某雞場(chǎng)的病雞中提取出病料，進(jìn)行細(xì)菌的分離與鑒定和AIV 和NDV 的PCR 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并無禽流感病毒和新城疫病毒的感染，且無細(xì)菌感染。

2）從接種病料中設(shè)計(jì)出一對(duì)針對(duì)ALV-J 的特異性引物，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一個(gè)長(zhǎng)度為968bP 的片段，與預(yù)期片段大小相符。

3）經(jīng)序列分析，該檢測(cè)病樣DNA 序列與J 亞群禽白血病病毒DNA 序列同源性達(dá)99%，表明該病為禽白血病。■