獸用疫苗生產(chǎn)中常用細(xì)胞系的致瘤性研究

劉昕澤，宗樹成，王楠，張賀楠，謝云浩，郭富城，巴利民

（1.中牧實業(yè)股份有限公司 北京 100070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點實驗室 北京 100095）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為幾個世紀(jì)以來疫苗生產(chǎn)的最關(guān)鍵的一個里程碑，最初的疫苗來源于被感染機體的體液、組織或者器官，最常用的是使用感染的鼠（小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等）、兔子、羊等動物的組織器官經(jīng)研磨后獲得。1930 年后，研究人員開始使用雞胚進(jìn)行病毒培養(yǎng)，并用于人和動物疫苗生產(chǎn)，目前該方法仍然被大量使用，但SPF 雞胚的來源受限，供應(yīng)不足，疫苗生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低等特性，科研人員開始尋求更為方便的易于大規(guī)模培養(yǎng)的病毒培養(yǎng)方法，因此細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用到疫苗生產(chǎn)[1,2]。最初使用的細(xì)胞基質(zhì)是從動物體內(nèi)分離出來的原代細(xì)胞，不進(jìn)行凍存儲備或者在一定程度上作為基礎(chǔ)細(xì)胞庫進(jìn)行少量凍存。原代細(xì)胞增殖能力有限，傳代的代次往往不高于5 代，因此每批疫苗都必須重新制備新的原代細(xì)胞。此外原代細(xì)胞分離培養(yǎng)時受動物個體差異，存在污染風(fēng)險、批間差較大等問題。隨著對疫苗產(chǎn)量需求和疫苗安全性要求越來越高，迫切需要開發(fā)出安全、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、高效的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)。有研究人員在1954 年使用猴腎細(xì)胞生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎病毒，成為疫苗領(lǐng)域的一個標(biāo)志性事件[3,4]。此后，MDBK、HEK293、MDCK、EB66、BHK-21、PK、ST、marc145 等細(xì)胞陸續(xù)被開發(fā)，應(yīng)用于人或動物疫苗生產(chǎn)。這些細(xì)胞均表現(xiàn)出無限增殖的能力，疫苗生產(chǎn)時建立基礎(chǔ)種子庫和生產(chǎn)用細(xì)胞種子庫，可隨時從細(xì)胞庫中復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行疫苗生產(chǎn)[5]。但是這些細(xì)胞系進(jìn)行持續(xù)傳代時存在染色體遺傳變異的可能性，具有潛在的遺傳不穩(wěn)定性和致瘤性。因此在疫苗生產(chǎn)中必須限定細(xì)胞代次進(jìn)行使用，只有傳代代次較低的非致瘤性的細(xì)胞方可用于疫苗生產(chǎn)。在產(chǎn)品申報和疫苗生產(chǎn)時對生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行致瘤性檢驗尤為重要[6]。為確保生物制品的安全性，本文根據(jù)WHO 和2020 年版《中華人民共和國獸藥典》推薦的方法，對目前實驗室保存的幾種用于研發(fā)生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系致瘤性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為在獸用生物制品研發(fā)、生產(chǎn)中如何正確規(guī)范使用細(xì)胞基質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐[7]。

本實驗室保存的HEK-293 細(xì)胞系、LLC-PK1 細(xì)胞系、Marc145細(xì)胞系、PK15 細(xì)胞系、Vero 細(xì)胞系、ST 細(xì)胞系、BHK-21 細(xì)胞系均為獸用疫苗生物制品研發(fā)、生產(chǎn)中常見的傳代細(xì)胞系。其中HEK-293 用于腺病毒及其腺病毒載體等疫苗生產(chǎn)，HEK-293T 主要用于腺病毒的包裝和亞單位疫苗生產(chǎn)，Marc145 細(xì)胞應(yīng)用在豬藍(lán)耳病等疫苗生產(chǎn)，PK15 細(xì)胞應(yīng)用于豬圓環(huán)病等疫苗生產(chǎn)，Vero 細(xì)胞應(yīng)用于犬瘟熱-狂犬病聯(lián)苗、豬乙型腦炎活疫苗等疫苗生產(chǎn)，ST主要應(yīng)用于豬瘟、豬偽狂犬疫苗生產(chǎn)，BHK-21 細(xì)胞作為已知具有致瘤性的細(xì)胞，應(yīng)用于口蹄疫、偽狂犬病、狂犬病、SVV 等滅活疫苗生產(chǎn)。本試驗對這7 種細(xì)胞進(jìn)行致瘤性試驗，為生產(chǎn)獸用疫苗安全性評價提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1）細(xì)胞。HEK-293 細(xì)胞第30 代、HEK-293T 細(xì)胞第30 代、LLC-PK1 細(xì)胞第30 代、Marc145 細(xì)胞第30 代、PK15 細(xì)胞第35 代、Vero 細(xì)胞第140 代、ST 細(xì)胞第35 代、胎豬原代腎上皮細(xì)胞第8 代、BHK-21 細(xì)胞第50 代，上述使用細(xì)胞中，胎豬原代腎上皮細(xì)胞為實驗室使用SPF 胎豬腎組織自行分離的原代細(xì)胞，其余均為實驗室基礎(chǔ)種子庫細(xì)胞。其中Vero 為ATCC 引進(jìn)細(xì)胞株，代次以ATCC 原始細(xì)胞代次進(jìn)行記錄，其余細(xì)胞原始代次不清晰，以在本試驗開始傳代記錄為第一代。

2）試驗動物。Nu/Nu 裸鼠6 周齡雌鼠，共計90 只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京市海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖廠。

1.2 方法

1）試驗分組。將90 只裸鼠隨機平均分成9 組，每組10 只，分HEK-293 細(xì)胞組、HEK-293T 細(xì)胞組、LLC-PK1 細(xì)胞組、Marc145細(xì)胞組、PK15 細(xì)胞組、Vero 細(xì)胞組、ST 細(xì)胞組，每種細(xì)胞接種10 只裸鼠，胎豬原代腎上皮細(xì)胞陰性對照組和BHK-21 細(xì)胞陽性對照組各接種10 只裸鼠。

2）細(xì)胞收集與接種。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化、重懸、計數(shù)，試驗組每種細(xì)胞取2×108個細(xì)胞，陽性對照組取1×108個細(xì)胞，陰性對照組取2×108個細(xì)胞。

3）細(xì)胞接種。將收集的細(xì)胞1 000 r/min，離心5 min，分別用1 mL 無菌PBS 重懸。每只裸鼠右腋下皮膚消毒后，皮下緩慢注射0.1 mL 細(xì)胞懸液（表1）。

表1 試驗動物分組

4）觀察與剖檢。接種后的裸鼠每周觀察兩次，每次間隔3～4 d，觀察接種部位有無結(jié)節(jié)或腫塊。持續(xù)觀察至5 周，對各試驗組中出現(xiàn)腫塊的裸鼠進(jìn)行剖檢，做病理切片分析；對各試驗組中未出現(xiàn)腫塊的裸鼠分別取半數(shù)做剖檢，做病理切片分析。陰性對照組和陽性對照組在5 周取半數(shù)剖檢，做病理切片分析。對剩余裸鼠持續(xù)觀察至12 周后，全部剖檢，做病理切片分析。

5）病理組織切片。裸鼠頸部脫臼處死后，剪開接種部位，取接種部位附近皮膚、頜下淋巴結(jié)、肺臟、皮下組織、肝臟、脾臟，如有結(jié)節(jié)或腫塊，取出皮下結(jié)節(jié)或腫塊，將組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，將固定后的樣品制備石蠟包埋切片，經(jīng)H-E 染色后鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性、陰性對照組結(jié)果

試驗觀察至5 周（第35 天），接種BHK-21 細(xì)胞系的陽性對照組內(nèi)裸鼠肋下均出現(xiàn)明顯腫塊（圖1 A），腫塊直徑7.9～16.3 mm，精神萎靡，采食量下降，剖檢后發(fā)現(xiàn)，裸鼠的淋巴結(jié)、肺臟、肝臟均無明顯結(jié)節(jié)。對裸鼠的腫塊、淋巴結(jié)、肺臟、腎臟、肝臟進(jìn)行病理切片檢測，結(jié)果顯示，腫塊組織細(xì)胞異型性大，核分裂明顯，核仁大而清晰，成團(tuán)塊或島嶼型（圖2 A）。部分裸鼠病理切片顯示肺臟有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（圖2 B）。接種胎豬原代腎上皮細(xì)胞系的陰性對照組內(nèi)裸鼠，精神、飲食未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，接種部位無明顯結(jié)節(jié)和腫塊產(chǎn)生（圖1 B），剖檢后頜下淋巴結(jié)、肺臟、腎臟、肝臟未出現(xiàn)異常。病理切片檢測結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。

圖1 裸鼠病理解剖學(xué)檢查

2.2 試驗組結(jié)果

試驗觀察至5 周（第35 日），接種HEK-293、LLC-PK1、Marc145、PK15、Vero、ST 細(xì)胞系的各試驗組裸鼠，精神、飲食未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，未見結(jié)節(jié)或可疑腫塊組織（圖1 C、E、F、G、H、I）。從各組中分別取5 只裸鼠進(jìn)行剖檢，對接種部位皮膚、淋巴結(jié)、肺臟、腎臟、肝臟進(jìn)行病理切片檢測，未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。繼續(xù)飼養(yǎng)觀察至12周后，將各組剩余裸鼠全部剖檢并對接種部位皮膚、淋巴結(jié)、肺臟、腎臟、肝臟組織進(jìn)行病理切片檢測，均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。

試驗觀察至5 周（第35 日），接種HEK-293T 細(xì)胞系的裸鼠均出現(xiàn)精神萎靡、采食量下降的異常表現(xiàn)，接種部位均有可疑腫塊產(chǎn)生，腫塊直徑5.8～10.6 mm（圖1 D），對腫塊進(jìn)行病理切片檢測為鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（圖3 D）。對其他組織進(jìn)行病理切片檢測，未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞。

3 結(jié)果與討論

生產(chǎn)用細(xì)胞系一般由人或動物原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化特性或特異性標(biāo)記的細(xì)胞群。2020 版獸藥典生產(chǎn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)致瘤性檢驗要求，對至少10 無胸腺小鼠，各皮下或肌肉注射107個被檢細(xì)胞，持續(xù)觀察12 周，對接種部位進(jìn)行剖檢及病理學(xué)檢查，各淋巴結(jié)和各器官中應(yīng)均無結(jié)節(jié)及腫瘤，以確保在生物制品生產(chǎn)時不會產(chǎn)生致瘤性。

本文對動物生物制品研發(fā)、生產(chǎn)中7 種常見細(xì)胞系的致瘤性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，可見HEK293-T 細(xì)胞對裸鼠具有致瘤性，未發(fā)生轉(zhuǎn)移。陽性對照BHK-21 細(xì)胞系接種后腫瘤細(xì)胞由接種部位轉(zhuǎn)移，在肺部組織中可觀察到肺部鱗狀細(xì)胞瘤細(xì)胞，因此HEK293-T 細(xì)胞、BHK-21 細(xì)胞不能用于活疫苗的生產(chǎn)，當(dāng)用于滅活苗生產(chǎn)時需系統(tǒng)評估制品經(jīng)滅活劑滅活后細(xì)胞基因組核酸對動物機體存在的潛在致瘤性風(fēng)險。本實驗室保存的HEK-293、LLC-PK1、Marc145、PK15、Vero、ST 細(xì)胞系無致瘤性，但有些研究表明Vero、Marc145、HEK-293 細(xì)胞存在致瘤性[8]，這種結(jié)果差異可能是因為細(xì)胞代次不同或者細(xì)胞高變異株亞型引起的，因此用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)必須在限定代次內(nèi)使用，不可高于規(guī)定的最高代次，以免出現(xiàn)致瘤性風(fēng)險[9]。■