piRNA-001184在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化的相關(guān)性研究

王志紅，賈國(guó)榮

piRNA-001184在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化的相關(guān)性研究

王志紅1，賈國(guó)榮2

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014017

探討piRNA-001184在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中的表達(dá)及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化的相關(guān)性。選取2020年8月至2022年12月于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的69例MM患者納入實(shí)驗(yàn)組，收集同期18例缺鐵性貧血患者納入對(duì)照組。應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)患者的piRNA-001184表達(dá)水平，采用Pearson線性相關(guān)分析piRNA-001184與CTGF、CDKN2A表達(dá)水平的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)組患者的piRNA-001184表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組[（21.56±6.19）（10.60±2.45），=7.388，<0.001]。不同病程患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=110.977，<0.001），表達(dá)水平依次為初發(fā)組>復(fù)發(fā)組>緩解組。不同國(guó)際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），表達(dá)水平依次為Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期。piRNA-001184表達(dá)水平與CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平均呈正相關(guān)（<0.05）。MM患者piRNA-001184表達(dá)明顯上調(diào)。監(jiān)測(cè)piRNA-001184可能對(duì)MM的診斷、分期及預(yù)后判斷有參考價(jià)值。

多發(fā)性骨髓瘤；piRNA-001184；DNA甲基化

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞克隆性增殖性疾病，是來源于終末分化的B淋巴細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。目前其發(fā)病機(jī)制仍未明確，研究證實(shí)DNA異常甲基化及非編碼RNA異常表達(dá)在MM中普遍存在[1-2]。DNA甲基化可在啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島起抑制抑癌基因失活的作用，從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生，而Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）可通過下調(diào)腫瘤抑制因子參與腫瘤的發(fā)生[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在MM中表達(dá)上調(diào)，而piRNA在MM中參與調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步促進(jìn)DNA發(fā)生甲基化修飾[5-6]。本研究探索MM患者piRNA-001184表達(dá)水平及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化水平的相關(guān)性，為MM的診斷、分期、治療及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年8月至2022年12月于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的69例MM患者納入實(shí)驗(yàn)組，收集同期18例缺鐵性貧血患者納入對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者的性別、年齡不限，MM的診斷符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2020年修訂）》[7]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，缺鐵性貧血診斷符合《血液學(xué)診斷及診療標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在嚴(yán)重感染；②合并消化道腫瘤或其他腫瘤。其中實(shí)驗(yàn)組患者男36例，女33例，國(guó)際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）Ⅰ期40例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例。對(duì)照組患者男8例，女10例。根據(jù)病程和預(yù)后又將實(shí)驗(yàn)組患者分為初發(fā)組（新診斷、未治療的MM患者，18例）、緩解組（療效達(dá)到完全緩解的MM患者，9例）和復(fù)發(fā)組（癥狀性復(fù)發(fā)的MM患者，42例）。收集所有患者的骨髓血5ml，標(biāo)本收集均獲得患者同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核通過。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（百源ASA－9600）；Ⅱ-2型生物安全柜（珠海再鑫儀器有限公司）；XiangYiH-1850R高速低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司）。用Trizol法提取RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購(gòu)自北京天根生化公司：miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit miRcute增強(qiáng)型 miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒50 rxn（KR211-02）、miRcute Plus miRNA qPCR Kit（SYBR Green）miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒20ulx500rxn（FP411-02）；piRNA-001184引物及hsa-U6檢測(cè)引物由北京天根生化公司設(shè)計(jì)合成；瓊脂糖、5%TBE緩沖液及good view（核酸染料）均購(gòu)自北京天根生化公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取 提取兩組患者的2ml骨髓血，利用Trizol法提取RNA，以供逆轉(zhuǎn)錄使用。

1.3.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制試劑，每次加入1.5μl RNA提取液，反應(yīng)條件：42℃ 60min（miRNA加A尾反應(yīng)及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、95℃ 3min（酶失活反應(yīng)），合成的cDNA直接進(jìn)行下游熒光定量檢測(cè)或放置于–20℃保存。

1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng) 根據(jù)熒光定量檢測(cè)試劑盒配制反應(yīng)體系，每次加入1μl cDNA溶液及0.4μl piRNA-001184引物溶液。反應(yīng)條件：95℃起始模板變性15min一個(gè)循環(huán)，然后94℃ PCR循環(huán)中模板變性、20s、60℃ 34s退火及延伸，共42個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參。piRNA-001184引物序列：-ATTACCAA GGATTTATTGGATCTTCTTG-。計(jì)算piRNA-001184相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 配制瓊脂糖凝膠，將制成的凝膠電泳板放入電泳槽中，依次加入4μl PCR產(chǎn)物，電壓110V的條件下電泳40min。

1.4 CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平與piRNA-001184表達(dá)水平的相關(guān)性

根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]，分析在同一MM樣本中CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平與piRNA-001184表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。基因檢測(cè)結(jié)果用相對(duì)定量△CT值（△CT值=目的基因CT值–內(nèi)參基因CT值）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，三組比較采用單因素方差分析，三組間兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較

實(shí)驗(yàn)組患者的piRNA-001184表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組[（21.56±6.19）（10.60±2.45），=7.388，<0.001]。

2.2 不同病程患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較

不同病程患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=110.977，<0.001），piRNA-001184表達(dá)水平依次為初發(fā)組>復(fù)發(fā)組>緩解組，見圖1。

圖1 三組患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較

注：與初發(fā)組比較，*<0.05；與緩解組比較，#<0.05

2.3 不同ISS分期患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較

不同ISS分期患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），piRNA-001184表達(dá)水平依次為Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期，見圖2。

圖2 不同ISS分期患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較

注：與Ⅰ期比較，*<0.05；與Ⅱ期比較，#<0.05

2.4 piRNA-001184表達(dá)水平與CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平的相關(guān)性

不同病程患者的CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見表1。piRNA-001184表達(dá)水平與CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平均呈正相關(guān)（<0.05），見圖3、圖4。

表1 不同病程患者的CTGF、CDKN2A基因表達(dá)水平比較

圖3 piRNA-001184與CTGF基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析

圖4 piRNA-001184與CDKN2A基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

目前MM的發(fā)病率逐年升高，盡管化學(xué)藥物及靶向藥物的不斷問世使MM的治療方案有所優(yōu)化，但MM仍是一種無法治愈的疾病[10]。研究發(fā)現(xiàn)，piRNA可通過下調(diào)腫瘤抑制因子參與腫瘤的發(fā)生，如其在不同分型的大腸癌、肺腺癌、腎母細(xì)胞癌、胃癌、肝癌等實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)，為腫瘤的診斷及治療提供新的參考價(jià)值[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)在MM患者中不僅檢測(cè)到piRNA-823及其他類型piRNA的異常表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)DNA發(fā)生甲基化修飾[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組患者的piRNA-001184表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，說明piRNA-001184在MM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同病程MM患者的piRNA-001184表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，依次為初發(fā)組>復(fù)發(fā)組>緩解組，初發(fā)患者的腫瘤負(fù)荷較緩解及復(fù)發(fā)者高，提示在MM患者中piRNA-001184表達(dá)水平與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。ISS分期是在β2微球蛋白及血清白蛋白基礎(chǔ)上對(duì)MM的國(guó)際預(yù)后分期，對(duì)評(píng)判MM預(yù)后及腫瘤負(fù)荷有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨著ISS分期的增加，MM患者的piRNA-001184表達(dá)上調(diào)，提示piRNA-001184對(duì)MM的預(yù)后不良及腫瘤負(fù)荷有影響。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MM患者存在CTGF、CDKN2A啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化[9]，且不同病程中CTGF、CDKN2A表達(dá)水平存在差異。本研究表明piRNA-001184與CTGF、CDKN2A表達(dá)水平均呈正相關(guān)。推測(cè)MM患者piRNA-001184的異常表達(dá)可能對(duì)DNA甲基化水平有影響，進(jìn)而預(yù)測(cè)piRNA-001184的抑制劑或激動(dòng)劑可能在MM的去甲基化藥物治療方面發(fā)揮作用。本研究關(guān)于piRNA-001184與CTGF、CDKN2A基因甲基化的聯(lián)系只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并未進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證，接下來還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上，piRNA-001184在MM的診斷、治療及預(yù)后方面具有一定的參考價(jià)值，可為MM患者提供新的診療方案。

[1] LANDGREN O, KYLE R A, PFEIFFER R M, et al. Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) consistently precedes multiple myeloma: A prospective study[J]. Blood, 2009, 113(11): 5412–5417.

[2] TACHITA T, KINOSHITA S, RI M, et al. Expression mutation and methylation of cereblon-pathway genes at pre- and post-lenalidomide treatment in multiple myeloma[J]. Cancer Sci, 2020, 111(4): 1333–1343.

[3] MOORE L D, LE T, FAN G, et al. DNA methylation and its basic function[J]. Neuropsychopharmacology, 2013, 38(1): 23–38.

[4] JIA L. Epigenetic roles of PIWI-interacting RNAs (piRNAs) in cancer metastasis (review)[J]. Oncol Rep, 2018, 40(5): 2423–2434.

[5] YAN H, WU Q L, SUN C Y, et al. piRNA-823 contributes to tumorigenesis by regulating de novo DNA methylation and angiogenesis in multiple myeloma[J]. Leukemia, 2015, 29(1): 196–206.

[6] AMODIO N, LEOTTA M, BELLIZZI D, et al. DNA- demethylating and anti- tumor activityof synthetic miR-29b mimics in multiple myeloma[J]. Oncotarget, 2012, 3(10): 1246–1258.

[7] 中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)血液科醫(yī)師分會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì), 中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)多發(fā)性骨髓瘤專業(yè)委員會(huì). 中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2020, 59(5): 341–346.

[8] 張之南, 沈悌. 血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2007.

[9] 阿納爾, 賈國(guó)榮, 李志芹, 等. CTGF、CDKN2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在多發(fā)性骨髓瘤中的研究[J]. 保健醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐, 2022, 19(S2): 164–166.

[10] 聞曉琳. 大腸癌中醫(yī)證候分布及其差異表達(dá)piRNA研究[D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2022.

[11] 劉永梅. piR-hsa-211106對(duì)肺腺癌的調(diào)控作用及其機(jī)制的研究[D]. 青島: 青島大學(xué), 2021.

[12] 張朝霞. PiRNA MW557525對(duì)Piwil2-iCSCs及腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2021.

[13] 夏言. 胃癌中piR-9994、piR-30715的表達(dá)意義及其與PIWIL4的相關(guān)性[D]. 福州: 福建醫(yī)科大學(xué), 2019.

[14] COSTA L J, USMANI S Z. Defining and managing high-risk multiple myeloma: Current concepts[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2020, 18(12): 1730–1737.

[15] MA H, WANG H, TIAN F, et al. PIWI-interacting RNA- 004800 is regulated by S1P receptor signaling pathway to keep myeloma cell survival[J]. Front Oncol, 2020, 10: 438.

[16] LI B, HONG J, HONG M, et al. piRNA-823 delivered by multiple myeloma-derived extracellular vesicles promotedtumorigenesis through re-educating endothelial cells in the tumor environment[J]. Oncogene, 2019, 38(26): 5227–5238.

Expression of piRNA-001184 in multiple myeloma and its correlation with CTGF, CDKN2A gene methylation

WANG Zhihong, JIA Guorong

1.Graduate School of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, Inner Mongolia, China; 2.Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014017, Inner Mongolia, China

To investigate the expression of piRNA-001184 in multiple myeloma (MM) and its correlation with CTGF, CDKN2A gene methylation.Sixty-nine MM patients treated in the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology from August 2020 to December 2022 were included in experimental group, and 18 patients with iron deficiency anemia were included in control group during the same period. The expression level of piRNA-001184 was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction, and the correlation between piRNA-001184 and the expression level of CTGF and CDKN2A was analyzed by Pearson linear correlation analysis.The expression level of piRNA-001184 in experimental group was significantly higher than that in control group [(21.56±6.19)(10.60±2.45),=7.388,<0.001]. There was statistical significance in expression level of piRNA-001184 in patients with different disease course (=110.977,<0.001), and the expression level was in initial onset group > relapse group > remission group. The expression level of piRNA-001184 in patients with different international staging system (ISS) was significantly different (<0.05), and the expression level was in stage Ⅰ< stage Ⅱ< stage Ⅲ. The expression level of piRNA-001184 was positively correlated with that of CTGF and CDKN2A genes (<0.05).The expression of piRNA-001184 was significantly up-regulated in MM patients. Monitoring piRNA-001184 may have reference value for the diagnosis, staging and prognosis of MM.

Multiple myeloma; piRNA-001184; DNA methylation

R733.3

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.31.006

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZY21075）

賈國(guó)榮，電子信箱：Jgr2178372@163.com

（2022–12–28）

（2023–10–15）