生長發(fā)育初期四角蛤蜊對空氣暴露的響應

馬貴范，郭文學，楊鳳，閆喜武

（1.威海海洋職業(yè)學院，山東 榮成 264300；2.榮成市漁業(yè)技術推廣站，山東 榮成 264300；3.大連海洋大學遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

貝類離水后，能在一段相當長的時間內維持生命力，這種離水后能維持生命活動的時間，稱為貝類“露空時間”[17]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，開發(fā)魚類、海參、蝦蟹等經濟動物與四角蛤蜊等灘涂貝類混養(yǎng)模式，是充分利用養(yǎng)殖水體，拓展養(yǎng)殖空間，優(yōu)化養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)結構和功能，提高對營養(yǎng)物質的吸收和利用，降低養(yǎng)殖污染物排放，實現(xiàn)生態(tài)養(yǎng)殖的重要途徑與發(fā)展方向[18,19]。生產中，貝類苗種的轉運是在離水狀態(tài)下進行，若“露空時間”過長，貝類會因不能從周圍環(huán)境中獲得足夠的氧和排出二氧化碳而死亡。研究結果表明，不同發(fā)育時期的灘涂貝類稚貝轉移至野外進行中間培育，成活率出現(xiàn)從10%～70%不等[20]，這可能與稚貝的發(fā)育時期和露空時間有關。本實驗研究了不同發(fā)育時期的四角蛤蜊幼蟲或稚貝對空氣暴露的耐受性，以及空氣暴露后的生長存活，探明四角蛤蜊早期生長發(fā)育對空氣暴露的響應，精準掌握四角蛤蜊不同發(fā)育時期幼蟲或稚貝的空氣暴露耐受性規(guī)律，更好地指導養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2012 年8 月在莊河市海洋貝類育苗場進行，所需四角蛤蜊取自該場的繁殖群體。

1.2 方法

根據(jù)四角蛤蜊早期生長發(fā)育規(guī)律，研究了D 形幼蟲、變態(tài)期幼蟲、30 日齡稚貝和60 日齡稚貝對空氣暴露的響應。根據(jù)日常觀察和預實驗測定結果，每個時期的幼蟲或稚貝設置不同的空氣暴露時間梯度，研究其對空氣暴露的響應和恢復自然條件后的生長存活情況。D 形幼蟲為孵化后1 d 的幼蟲，殼長（99.5±5.8）μm；變態(tài)期幼蟲為孵化后15 d 的幼蟲，殼長（246.5±23.9）μm；30 日齡稚貝殼長為（1 065±195）μm；60 日齡稚貝根據(jù)殼長分成大規(guī)格（9.15±0.87）mm、中規(guī)格（7.01±0.71）mm 和小規(guī)格（4.41±0.66）mm。實驗組每組幼蟲數(shù)量約50 個，稚貝數(shù)量約30 枚，每組設置3 個重復?？諝獗┞督Y束后幼蟲連續(xù)培養(yǎng)7 d、稚貝連續(xù)培養(yǎng)15 d 后觀察其生長情況。

1.2.1 D 形幼蟲在不同空氣暴露時間下存活率與生長的比較

試驗在室溫28.8 ℃，濕度為50%～60%下進行。用300 目的篩絹過濾一定數(shù)量的D 形幼蟲，平均分攤在7 塊300 目的篩絹（10 cm×10 cm）上，再用干紗布從篩絹網(wǎng)底部吸干水分后，懸空在燒杯（500 mL）中進行空氣暴露試驗（圖1）。

圖1 幼蟲空氣暴露裝置圖Fig.1 The device diagram of air exposure test for larvae

空氣暴露時間設置7 個梯度：0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min。在各個時間組的空氣暴露脅迫完成后，依次將每塊篩絹上的D形幼蟲平均分成三份，每份幼蟲數(shù)量約50 個，放入28 ℃砂濾海水中培養(yǎng)7 d，期間連續(xù)微量充氣，每日飽食投喂鮮活等邊金藻（Isochrysis galbana）2 次，換水1 次。觀察并記錄培養(yǎng)1 d、4 d 和7 d 時各組幼蟲的死亡情況；4 d 和7 d 時測量各存活組貝殼長，按下式計算各組的存活率與生長速度。死亡的判斷標準為幼蟲不能上浮和活動。幼蟲存活率和相對日生長（G）按下式計算：

幼蟲存活率=存活的幼蟲密度/實驗開始的幼蟲密度×100%；

結合電力電纜故障診斷的具體情況，需要對各種問題進行分析，電網(wǎng)本身不穩(wěn)定，為了保證供電的正常，需要做好故障診斷工作，盡快處理。電力電纜故障的診斷技術如下：

其中，L0：上一次測定的殼長（mm）；L1：本次測定的殼長（mm）；t0：上一次測定的日齡（d）；t1：本次測定的日齡（d）；G：相對日生長。

1.2.2 變態(tài)期幼蟲在不同空氣暴露時間下的存活率與生長的比較

變態(tài)期幼蟲空氣暴露時間梯度設置為0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h 和3 h，空氣暴露時平均室溫為29 ℃，濕度為50%～60%，空氣暴露脅迫后海水培養(yǎng)的溫度為28 ℃。其他同試驗1.2.1。

1.2.3 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時間下的存活率與生長的比較

試驗時平均室溫為29.6 ℃，濕度為50%～60%，時間梯度設置為0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h。具體操作為：隨機挑選約1 000 枚稚貝，平均分成9 份，依據(jù)設置好的空氣暴露時間進行試驗，每個時間梯度設置3 個平行?？諝獗┞睹{迫完成后放入正常海水常規(guī)培養(yǎng)15 d，每3 d 測量一次各組的殼長，其他同試驗1.2.1。以光學顯微鏡下觀察稚貝的貝殼張開或不能正常閉合為稚貝的死亡標準。

1.2.4 不同規(guī)格的60 日齡稚貝在不同空氣暴露時間下的存活率的比較

將60 日齡的稚貝依據(jù)殼長劃分為大（9.15±0.87）mm、中（7.01±0.71）mm、?。?.41±0.66）mm三種規(guī)格。每種規(guī)格每個時間梯度的稚貝數(shù)量為30枚，每組設置3 個平行。時間梯度設置為0 h、6 h、12 h、18 h、24 h 和30 h。其他同試驗1.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 統(tǒng)計軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）對數(shù)據(jù)進行分析處理,用LSD 法進行組間多重比較，顯著性差異水平設為P<0.05，Excel 作圖。采用半致死時間（LT50）來比較對空氣暴露的耐受能力。用100%存活的最長脅迫時間到0 存活的最短脅迫時間內的存活率（y）與脅迫時間（x）進行回歸分析，建立回歸方程，根據(jù)回歸方程求半數(shù)致死時間（LT50）。

2 結果與分析

2.1 D 形幼蟲不同空氣暴露時間下的存活率和生長比較

四角蛤蜊D 形幼蟲空氣暴露脅迫后的存活率結果如圖2 所示。空氣暴露組的幼蟲恢復到自然海水培養(yǎng)1 d 的存活率沒有明顯降低（P>0.05）。當連續(xù)培養(yǎng)到4 d 甚至更長（7 d）時，隨著空氣暴露時間的延長，幼蟲存活率顯著下降（P<0.05）。空氣暴露時間范圍在80 min 內，各處理組的存活率（4 d 和7 d）與對照組無顯著差異（P>0.05）；空氣暴露時間超過100 min，存活率顯著低于對照組（P<0.05）。

圖2 D 形幼蟲不同空氣暴露時間下的存活率Fig.2 The survival rate of D-shaped larvae in different air exposure periods

圖3 變態(tài)期幼蟲在不同空氣暴露時間下的存活率Fig.3 The survival rate of metamorphosis-stage larvae in different air exposure periods

經過短時間（20 min）空氣暴露的D 形幼蟲恢復到正常海水培養(yǎng)0～4 d 與對照組相比表現(xiàn)出了一定的生長優(yōu)勢，但優(yōu)勢不明顯：4 d 兩者殼長有顯著差異（P<0.05），0～4 d 相對日生長無顯著差異（P>0.05，表1）；但連續(xù)培養(yǎng)7 d，對照組的相對日生長顯著高于其他空氣暴露組（P<0.05）。在整個培養(yǎng)期間，20 min 空氣暴露組的D 形幼蟲生長速度快于其他處理組，但差異不顯著（P>0.05）；空氣暴露100 min 后D形幼蟲的相對日生長最小，說明長時間的空氣暴露不僅對D 形幼蟲的存活有顯著影響（P<0.05），也會降低D 形幼蟲的生長速度。

表1 D 形幼蟲不同空氣暴露時間后的殼長和相對日生長Tab.1 The shell length and relative growth of D-shaped larvae in different air exposure periods

2.2 變態(tài)期幼蟲在不同空氣暴露時間下的存活率和生長的比較

空氣暴露后，變態(tài)期幼蟲的存活率，隨培養(yǎng)時間的延長先降低（1～4 d）后保持平衡（4～7 d）。在相同的培養(yǎng)時間范圍內，隨著空氣暴露時間的延長，幼蟲的存活率顯著降低（P<0.01）。培養(yǎng)1 d 時，0.5 h處理組的存活率為100%，1 h 和1.5 h 次之，均與對照組無顯著差異（P>0.05），空氣暴露2 h 幼蟲的存活率顯著降低（P<0.05），超過3 h 幼蟲全部死亡。當

注:同列中具有相同字母的平均值間差異不顯著（P>0.05），具有不同字母的平均值間差異顯著（P>0.05），下同。

Note:the same letters in the same column are not significant differences（P>0.05）,and means with the different letters in the same column are significant differences（P<0.05）,et sequentia.培養(yǎng)至4 d 甚至7 d 時，對照組的存活率最高，0.5 h和1 h 次之，但二者顯著低于對照組（P<0.05）（圖2）。

空氣暴露對變態(tài)期幼蟲的生長影響結果見表2。在前期（0～4 d），空氣暴露對變態(tài)期幼蟲的生長表現(xiàn)為無序性，生長速度除空氣暴露1 h 和空氣暴露2.5 h 組高于對照組（P>0.05）外，其他各組均顯著低于對照組（P<0.05），空氣暴露1.5 h 的生長速度最慢。在后期（4～7 d），幼蟲經過空氣暴露后，生長速度顯著高于對照組（P<0.05）；其他處理組之間部分存在顯著性差異（P<0.05），如空氣暴露1.5 h 和空氣暴露2 h 組的相對日生長最大，分別顯著高于空氣暴露1 h 組和2.5 h 組（P<0.05），其中空氣暴露1 h 組的相對日生長最低。

表2 變態(tài)期幼蟲不同空氣暴露時間后的殼長和相對日生長Tab.2 The shell length and relative daily growth of metamorphosis-stage larvae in different air exposure periods

2.3 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時間下的存活率和生長的比較

30 日齡稚貝（殼長1.13～1.25 mm）經過空氣暴露脅迫后，正常海水培養(yǎng)1 d 的存活率與培養(yǎng)15 d的存活率無差異（圖4）。空氣暴露2 h 內，稚貝存活率為100%；稚貝100%死亡的最短空氣暴露時間為6 h；在2～6 h 內，隨著空氣暴露時間的延長，存活率顯著降低（P<0.05），空氣暴露時間為4 h，存活率約為50%。

圖4 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時間下的存活率Fig.4 The survival rate of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

30 日齡稚貝經過空氣暴露后的生長情況見表3 和表4。海水培養(yǎng)3 d 時，空氣暴露組稚貝的生長和對照組無顯著差異（P<0.05）；繼續(xù)培養(yǎng)至6 d 時，除空氣暴露4 h 組的相對日生長顯著高于對照組外（P<0.05），其他各處理組稚貝的的相對日生長與對照組無顯著性差異（P>0.05）；在培養(yǎng)的后期（6～15 d），各處理組的生長和對照組無顯著差異（P>0.05）；各處理組之間的平均日生長也無顯著差異（P>0.05）。從整個培養(yǎng)階段看，空氣暴露對1 mm 左右的稚貝生長無顯著性影響。

表3 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時間下的殼長Tab.3 The shell length of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

表4 30 日齡稚貝不同空氣暴露時間下的相對日生長Tab.4 The relative daily growth of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

2.4 60 日齡不同規(guī)格的稚貝在不同空氣暴露時間的存活率比較

從圖5 看出，60 日齡大規(guī)格稚貝100%存活的空氣暴露時間為18 h；中規(guī)格稚貝100%存活的空氣暴露時間為6 h；小規(guī)格稚貝（4.41±0.66）mm 空氣暴露6 h 的存活率約為93%。大規(guī)格稚貝空氣暴露24 h 出現(xiàn)死亡，100%存活率的最長空氣暴露時間在18～24 h，空氣暴露24～30 h，存活率急劇下降，空氣暴露30 h 無存活；中規(guī)格稚貝空氣暴露12 h存活率為77.8%，100%存活的最長空氣暴露時間在6～12 h，空氣暴露時間超過30 h，稚貝全部死亡；小規(guī)格稚貝空氣暴露6 h 開始出現(xiàn)死亡，空氣暴露24 h 無存活。

圖5 60 日齡稚貝在不同空氣暴露時間下的存活率Fig.5 The survival rate of 60-day-old juveniles in different air exposure periods

取大、中、小三種規(guī)格稚貝的100%存活的最長空氣暴露時間和0 存活的最短空氣暴露時間內的數(shù)據(jù)進行回歸分析，發(fā)現(xiàn)存活率（y，%）與空氣暴露時間（x，h）直線相關顯著（P<0.05）。直線方程依次為y=-8.3333x+255.56（R2=0.9643），y=-4.537x+129.44（R2=0.9558）和y=-5.7778x+130（R2=0.9074）。根據(jù)直線方程分別求出大，中和小規(guī)格稚貝的半致死時間分別為24.7 h、17.5 h 和13.8 h。60 日齡稚貝的耐空氣暴露能力為大規(guī)格>中規(guī)格>小規(guī)格。

3 討論

3.1 四角蛤蜊在不同發(fā)育時期的耐空氣暴露能力比較

空氣暴露對貝類存活率影響的研究已見于巨牡蠣（Crassostrea gigas）[21，26]、毛蚶（Scapharca subcrenate）[22]、長竹蟶（Solen stritus）[23]、海灣扇貝（Argopecten irradians）[24]、硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）[25]、橄欖蚶（Estellarca olivacea）[27]、扇墨西哥灣貝（Argopecten irradians concentricus）[28]、彩虹明櫻蛤（Moerella iridescen）[29]、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）[30]、文蛤（Meretrix meretrix）[31]和蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）[32]等。貝類的耐空氣暴露能力不僅與種類和空氣暴露時間的長短有關，還與貝類所處的發(fā)育時期及規(guī)格密切相關[24、26、30]。本研究中，不同發(fā)育時期的四角蛤蜊幼蟲或稚貝對空氣暴露的耐受性不同，同一發(fā)育階段不同規(guī)格的稚貝對空氣暴露的耐受能力也有較大的差異。以LT50為依據(jù)，得出四角蛤蜊不同發(fā)育時期的耐空氣暴露能力為：稚貝>變態(tài)期幼蟲>D 形幼蟲。與其他貝類不同發(fā)育時期的耐空氣暴露能力排序有所不同。海灣扇貝耐空氣暴露能力大小為：眼點幼蟲＞D 形幼蟲＞稚貝，太平洋牡蠣為：眼點幼蟲>殼頂中期幼蟲>稚貝>D 形幼蟲[24、26]。這可能與不同貝類不同發(fā)育時期殼的厚薄易碎程度以及試驗條件有關。四角蛤蜊D 形幼蟲和變態(tài)期幼蟲個體較小，殼薄易碎，離水后在較高室溫下水分蒸發(fā)較快，耐空氣暴露能力較低；稚貝的結構和成貝相似，軟體部儲存部分水分，露空后暫時利用那部分水分維持自身體內代謝，忍受空氣暴露的時間較幼蟲期長。在相同條件下，不同規(guī)格的四角蛤蜊稚貝的耐空氣暴露能力隨規(guī)格的增加而增大，這與蛤仔對空氣暴露耐受性的研究結果相一致[30]。因此，在四角蛤蜊苗種繁育、灘涂放養(yǎng)及運輸過程中，應避免長時間空氣暴露，尤其是早期幼蟲階段。

3.2 空氣暴露對不同發(fā)育階段的幼蟲、稚貝生長的影響

空氣暴露脅迫除影響貝類的存活外，還影響生長的貝類。本研究結果發(fā)現(xiàn)：（1）個別空氣暴露組（20 min）在前期（0～4 d）D 形幼蟲具一定的生長優(yōu)勢，但繼續(xù)培養(yǎng)至7 d 時，不僅生長優(yōu)勢消失，生長速度顯著減慢；（2）培養(yǎng)前期（0～4 d）變態(tài)期幼蟲在較對照組沒有明顯的生長優(yōu)勢，但隨著培養(yǎng)時間的延長（4～7 d），生長速度快于對照組；（3）4 h 的空氣暴露脅迫對稚貝的生長影響很小，基本上與對照組同步,表明不同發(fā)育時期的幼蟲或稚貝經過空氣暴露脅迫后的生長情況不同。而Hiwatari 等[10]對蛤仔的研究表明，稚貝在空氣暴露脅迫完成后期（7～14 d）出現(xiàn)明顯的生長優(yōu)勢。肖友翔[33]等對日本海神蛤（Panopea japonica）的研究表明，干露處理后，殼長約1.70 mm 日本海神蛤稚貝瞬時生長率顯著高于對照組，存在補償生長現(xiàn)象。這與四角蛤蜊稚貝空氣暴露脅迫后生長情況有所差別，說明空氣暴露對貝類產生的影響既與不同種類有關，也受早期生長發(fā)育階段、培育時長及實驗條件的影響。

3.3 小結

四角蛤蜊D 形幼蟲空氣暴露80 min 內7 d 的存活率與對照組無顯著差異，但7 d 后生長顯著低于對照組，建議D 形幼蟲期間盡量不要離水，若離水，露空時間不要超過20 min；變態(tài)期幼蟲空氣暴露時間控制在1.5 h 內，存活率依然很高，后期生長速度顯著高于對照組，說明四角蛤蜊幼蟲變態(tài)期間適當?shù)乜諝獗┞?，有利于刺激幼蟲的變態(tài)發(fā)育，在生產中，可以通過換水等方式對變態(tài)期幼蟲適當空氣暴露，以提高變態(tài)率；30 日齡稚貝空氣暴露2 h存活率仍可保持在100%，空氣暴露后對稚貝的生長沒有顯著差異，也不會降低，運輸30 日齡稚貝只適合短途運輸（≤2 h）；60 日齡的稚貝運輸時若保證100%的存活率，殼長約為9 mm 的稚貝可運輸18 h，7 mm 可運輸6 h，4 mm 運輸時間要小于6 h。實驗觀察受精卵空氣暴露5 min 后均不能孵化成D形幼蟲，受精卵應避免出現(xiàn)露空時間。