穩(wěn)定同位素技術(shù)在水生動物食性研究的應(yīng)用

田金龍，李俊偉，董宏標(biāo)，曾祥兵，張家松

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)村農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518121）

食性研究能夠分析動物與環(huán)境之間的聯(lián)系，是生態(tài)學(xué)中一項(xiàng)重要的研究內(nèi)容[1]。常規(guī)的動物食性研究方法有直接觀察、胃內(nèi)容物分析、食物殘留物分析以及排泄物分析等[2]。這些方法有較大的局限性，如樣品只能夠反映動物近期的攝食情況，無法客觀反映中遠(yuǎn)期的攝食情況以及發(fā)育過程中食性的轉(zhuǎn)變；短暫而非長期的攝食對象影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]；而對于珍稀和微小物種的研究存在著樣品損傷程度高、研究周期長、勞動強(qiáng)度大和技術(shù)要求高等特點(diǎn)[4]。

水生生態(tài)系統(tǒng)具有復(fù)雜的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)水生動物食性研究方法效果較差。同位素示蹤技術(shù)將觀察與識別水平上升至分子層次[5]，廣泛應(yīng)用在地球化學(xué)、農(nóng)業(yè)化學(xué)、環(huán)境化學(xué)等研究領(lǐng)域，是科學(xué)研究的精確手段。國際原子能機(jī)構(gòu)年報指出：同位素示蹤技術(shù)的影響廣度可能只有現(xiàn)代電子學(xué)和數(shù)據(jù)處理才能與同位素相比[6]。其具有示蹤與指示等功能，以檢測快捷、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以判斷動物食物來源、攝食偏好、棲息地環(huán)境、分布格局以及洄游路線等關(guān)鍵信息[7,8]。面對水生動物復(fù)雜的營養(yǎng)級結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定同位素技術(shù)不僅能反映出實(shí)時的營養(yǎng)級位置與能量流動，還可用于研究養(yǎng)殖生物生長過程中食性的轉(zhuǎn)換和食物鏈中捕食者與被捕食者的相互關(guān)系。本文介紹了穩(wěn)定同位素技術(shù)原理以及在水生動物體內(nèi)的分布、影響因素和食性案例，為穩(wěn)定同位素在水生生物食性研究中的應(yīng)用提供參考。

1 穩(wěn)定同位素技術(shù)的原理

自然界中大多數(shù)元素都存在兩個或者兩個以上的同位素，不同同位素之間的細(xì)微化學(xué)差異是由中子的數(shù)量決定[9]。在食物流動中，較重的同位素在攝食動物中具有累積的傾向，以重同位素形式（13C和15N）保留在組織中，而輕同位素形式（12C 和14N）則被排泄出機(jī)體。這種代謝效應(yīng)導(dǎo)致動物消費(fèi)者與生長者之間的同位素差異，稱為同位素分餾效應(yīng)，導(dǎo)致自然環(huán)境中某一物種在食物網(wǎng)位置越高，其組織中的重同位素就越多[10-13]。因此，同位素差異為穩(wěn)定同位素作為生物標(biāo)志物或者示蹤劑在水生動物食性研究中的應(yīng)用提供了條件[14]。目前水生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)用較多的同位素是碳（13C/12C）、氮（15N/14N）和硫（34S/32S）[15]。碳穩(wěn)定同位素的分餾程度小，可用于檢測水生動物的攝食種類；氮穩(wěn)定同位素則存在一定程度的同位素分餾，可以檢測個體的生長代謝過程，或者群體狀態(tài)下食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)級；硫同位素則在微生物的代謝規(guī)律、環(huán)境污染、氣候變化的響應(yīng)中有重要作用。因此，分析動物組織的穩(wěn)定同位素可以得出所處特定時間段的食物來源、生存環(huán)境、分布特征及洄游路線等關(guān)鍵信息[16]。

一般來說，穩(wěn)定同位素值用符號δ 來表示，其定義為：

式中，X 表示所測定元素，如：C、N、O、H 和S等，R 為元素重同位素和輕同位素的比值，R 標(biāo)準(zhǔn)品為國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)品的同位素比值。

2 影響水生動物體內(nèi)穩(wěn)定同位素組成和分布的因素

2.1 食物來源對水生動物體內(nèi)穩(wěn)定同位素的影響

穩(wěn)定同位素是一種基于生產(chǎn)力的定量方法，不同的食物來源會影響動物體內(nèi)的同位素組成，可通過測定水生動物與其攝食物的穩(wěn)定同位素值來判斷食物來源、量化食物比例和同化物質(zhì)的速率、探究長期食性及生命活動規(guī)律[17]。水生動物組織中碳同位素反映了光合途徑中有機(jī)質(zhì)的來源，例如C3植物（Calvin 途徑）通過RUB 羧化酶固定CO2，而C4植物（Hatch-Slack 途徑）以PEP 羧化酶固定CO2。兩種羧化酶的不同途徑，導(dǎo)致13C 在不同植物之間分布差異，C3植物δ13C 值介于-34‰～-25‰，平均值約為-27‰；而C4植物的δ13C 值介于-17‰～-11‰，平均值約為-13‰[18]。因此，在海洋環(huán)境中穩(wěn)定碳同位素比值δ13C 可以顯示底棲和中上層、近岸和近海、淡水和海水?dāng)z食者之間的差異。氮同位素的分餾效應(yīng)使得δ15N 能夠反映水生動物機(jī)體營養(yǎng)水平，消費(fèi)者的穩(wěn)定氮同位素比值δ15N 在營養(yǎng)同化過程中高于生產(chǎn)者，可以反映出數(shù)周至數(shù)月內(nèi)的攝食行為[19]。通常情況下，用穩(wěn)定同位素混合模型來估計(jì)同化食物來源對動物組織的相對貢獻(xiàn)。早期Saito 等[20]建立同位素質(zhì)量平衡方程，能夠采用一種同位素定量計(jì)算對兩種食物的來源。

式中，C 表示測定的穩(wěn)定同位素種類，δ13Cm為消費(fèi)者同位素比值，δ13Cx、δ13Cy則代表食源x 和y的校準(zhǔn)后的穩(wěn)定同位素比值。

水生動物的食源往往多樣化，當(dāng)食源超過n+1時，方程組不確定，無法使用模型。Phillips 和Gregg等[21]改進(jìn)了同位素質(zhì)量平衡方程與編寫了IsoSource應(yīng)用程序，可以在食源數(shù)量超過n+1 的情況下計(jì)算潛在食源貢獻(xiàn)的頻率和范圍。

式中，f1、f2、f3表示三個未知的比例食源貢獻(xiàn)，m表示混合物，X、Y 表示測定的穩(wěn)定同位素種類，δXm和δYm則代表穩(wěn)定同位素種類X 和Y 校準(zhǔn)后的消費(fèi)者穩(wěn)定同位素值。

穩(wěn)定同位素技術(shù)在研究生態(tài)問題時也有局限性，尤其是當(dāng)某些食源的比例很不穩(wěn)定，特定值的選擇，例如最大值與最小值的選取會造成結(jié)果難以解釋。貝葉斯模型將概率模型擬合到同位素?cái)?shù)據(jù)中，涵括各種不確定性源、鑒別因子、大于n+1 的源、以及直觀的估計(jì)框架中的分層結(jié)構(gòu)，減少了分析水生生物食源的不精確性[22，23]。貝葉斯混合模型表達(dá)式為：

式中：Xij表示混合食源i 同位素j 的δ 值；Pk表示食物來源k 的比例；Sjk表示第k 個食物來源的第j 種同位素的δ 值，服從均值為m 方差的正態(tài)分布；Cjk表示第k 個食物來源的j 同位素的分餾系數(shù)，服從均值為λ 方差為τ 的正態(tài)分布；ε 是殘余誤差，表示其他各個混合物間無法量化的方差，其均值和標(biāo)準(zhǔn)差在通常情況下均為0。

2.2 代謝過程對穩(wěn)定同位素富集的影響

生物體內(nèi)穩(wěn)定同位素值的變化不僅取決于反應(yīng)物的同位素組成，而且反應(yīng)動力學(xué)的途徑以及物理化學(xué)條件也影響穩(wěn)定同位素的富集。例如機(jī)體營養(yǎng)狀況、體型、飲食質(zhì)量、同化效率、排泄形式、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率等代謝影響因素[24,25]。由于穩(wěn)定同位素的物理化學(xué)差異而顯得高度規(guī)律，可以跟蹤宏觀化學(xué)反應(yīng)的分子通量來計(jì)算生物體內(nèi)穩(wěn)定同位素的通量。如分子發(fā)生在合成和分解代謝亞通量分配過程中的同化、生長以及轉(zhuǎn)換合成和原子在轉(zhuǎn)化過程中的重新構(gòu)建。這為研究水生動物食性微觀過程與宏觀現(xiàn)象提供一種新的方法，使得生物體與所處環(huán)境之間的質(zhì)量通道連通（圖1）。

圖1 同位素視角下細(xì)胞產(chǎn)物合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of cell product synthesis from isotope perspective

機(jī)體細(xì)胞中一種廣義化合物轉(zhuǎn)化為其他化合物的幾個步驟不會改變剩余化合物的同位素組成。如果只有一個底物參與宏化學(xué)反應(yīng)，則產(chǎn)物具有與底物相同的同位素組成：產(chǎn)物1 在分解代謝途徑中具有與底物1 相同的同位素組成。如果有兩個及以上的底物參與反應(yīng)，則產(chǎn)物2 的同位素組成取決于底物1 和底物2 的比例（圖1）。

3 穩(wěn)定同位素的應(yīng)用案例

3.1 食物來源分析

許多水生動物生長過程中往往會伴隨著食性的多次轉(zhuǎn)變，尤其是幼魚階段，攝食較為復(fù)雜。研究水生動物食性有助于人工飼養(yǎng)馴化和集約化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。以胃內(nèi)容物為主的分析方法對攝食習(xí)性與營養(yǎng)級的鑒定中，雖然對短期餌料生物的判別與鑒定直觀與精準(zhǔn)，但面對消化度高的餌料生物以及有機(jī)碎屑多的情況下，不能客觀反映長期的攝食偏好以及食性轉(zhuǎn)變[26]。穩(wěn)定同位素技術(shù)針對水生動物生長中的食性轉(zhuǎn)變與能量流動，長期的捕食與被捕食關(guān)系等方面具有一定優(yōu)勢與便利性。

Wild 等[27]結(jié)合穩(wěn)定同位素分析與貝葉斯混合模型，分析來自阿拉斯加灣抹香鯨（Physeter macrocephalus）和七種潛在食源的組織樣本。結(jié)果表明，δ13C 和δ15N 分餾系數(shù)分別為（1.28±0.38）‰和（2.82±0.30）‰，法式角鯊（Squalus suckleyi）、鰩（Rajidae spp）和巖魚（Sebastes spp）在抹香鯨食源中的比例依次為35%、28%和12%，為漁民和漁業(yè)管理人員提供了了解重要漁業(yè)物種信息。寧加佳等[28]在研究汕尾紅海灣海域口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）餌料中不同生物的食物貢獻(xiàn)比例發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄的δ13C值為-18.1‰～-16.3‰，δ15N 值為10.9‰～13.5‰，δ13C 和δ15N 分餾系數(shù)分別為（0.4±1.3）‰和（3.4±1.0）‰，δ13C 和δ15N 值的變化幅度均較大，意味著口蝦蛄的食物來源較多，其中各食源貢獻(xiàn)占比依次為貝類38.6%、蟹類22.9%、橈足類16.0%和魚類8.9%。為了確定稻-蝦共作養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）對稻田中豐富自然資源的利用效率，李聰?shù)萚29]通過穩(wěn)定同位素分析了不同蛋白含量的飼料（“碳/ 氮”C/N 分別為8、12和16）對養(yǎng)殖克氏原螯蝦生長的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)δ13C 和δ15N 分餾系數(shù)分別為（0.96±0.38）‰和（2.12±0.53）‰，人工投喂的飼料占比分別為38.03%～44.17%、22.13%～25.35%和18.85%～19.40%；據(jù)此而優(yōu)化了投喂策略，既避免了飼料浪費(fèi)與過量投喂，又提高了克氏原螯蝦對于稻田天然餌料的利用率，利于實(shí)現(xiàn)對稻田資源的合理利用。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中運(yùn)用穩(wěn)定同位素技術(shù)分析食性，可以優(yōu)化餌料種類組成，提高餌料利用率，實(shí)現(xiàn)健康高效生產(chǎn)。

3.2 食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)級分析

食物網(wǎng)中的能量流動與物質(zhì)循環(huán)可以評估水生動物在所處環(huán)境中的適應(yīng)性變化，闡明不同營養(yǎng)級之間的相互聯(lián)系。穩(wěn)定同位素能夠分析有關(guān)原始營養(yǎng)來源的信息，即追蹤從底層生產(chǎn)者到頂級捕食者的能量流動和營養(yǎng)循環(huán)，估計(jì)營養(yǎng)水平，資源利用和食物來源，為適應(yīng)性過程、物種瓶頸、種群動態(tài)和保護(hù)優(yōu)先物種提供數(shù)據(jù)支撐[30]。通過穩(wěn)定同位素構(gòu)建棲息地選擇和利用模型，確定覓食策略和營養(yǎng)分流，評估物種的生存狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能，發(fā)現(xiàn)復(fù)雜食物網(wǎng)動力學(xué)背后的機(jī)制過程[31-33]。穩(wěn)定同位素營養(yǎng)級計(jì)算公式為：

式中，TL 表示所測定水生生物的營養(yǎng)級；δ15Nsample為系統(tǒng)消費(fèi)者氮穩(wěn)定同位素比值；δ15Nbaseline為該系統(tǒng)基線生物的氮穩(wěn)定同位素比值；△δ15N 為1 個營養(yǎng)級的富集度；a 代表所選取基線生物的營養(yǎng)級。

在水生態(tài)系統(tǒng)中，初級生產(chǎn)者的碳和氮穩(wěn)定同位素比率隨時空變化而變化。初級生產(chǎn)者和初級消費(fèi)者穩(wěn)定同位素值的變化規(guī)律對研究食物網(wǎng)至關(guān)重要。郭承秧等[34]研究了雅浦海溝的底棲生物營養(yǎng)級與食物來源，浮游植物的δ13C 和δ15N 分別為（-22.8±0.4）‰與（5.4±0.4）‰，浮游動物的δ13C和δ15N 為（-21.8±0.8）‰和（6.8±0.2）‰，而巨型底棲生物的δ13C 和δ15N 為-20.1‰～-16.8‰和11.9‰～17.9‰，此差異表明巨型底棲生物的初級食源浮游動物與浮游植物等在向下輸送過程歷經(jīng)食物鏈傳遞和細(xì)菌的降解。而營養(yǎng)級方面則海綿（3.4～4.7）、海參（3.3～3.6）、海蛇尾（3.4～3.5）、海星（3.2～3.7）、鉤蝦（2.9～3.3）、?？?.1），表明了不同物種間食源存在多元化。為了闡明大亞灣珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的簡化食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)，朱文濤等[35]應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)測定了大亞灣珊瑚礁區(qū)樣品的δ13C 和δ15N值，發(fā)現(xiàn)食物網(wǎng)δ13C 和δ15N 分別為-23.22‰～-10.76‰、4.32‰～15.82‰；營養(yǎng)級范圍分別為腹足類1.84～2.68、雙殼類1.70～2.49、魚類2.45～3.64，結(jié)果表明藻類與浮游植物等初級生產(chǎn)者為食物網(wǎng)提供了重要碳源。陸亞楠等[36]采用穩(wěn)定同位素技術(shù)分析了江蘇近海不同季節(jié)的生物類群，結(jié)果表明春季營養(yǎng)級范圍為1.52～4.28，夏季營養(yǎng)級范圍為1.25～3.52，秋季營養(yǎng)級范圍1.34～4.15。春季食源較廣，生物營養(yǎng)層次與群落多樣性高；夏季食源更豐富，但生態(tài)位分化程度底；而秋季食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)較單一，營養(yǎng)生態(tài)位分布較廣。這些穩(wěn)定同位素的應(yīng)用研究為近海漁業(yè)環(huán)境保護(hù)和漁業(yè)資源恢復(fù)與管理提供一定科學(xué)依據(jù)。

3.3 水生動物洄游路線分析

洄游能使魚類獲得更有利的生存條件，更好地適應(yīng)環(huán)境、繁衍后代[37]。穩(wěn)定同位素利用個體中不同組織周轉(zhuǎn)率，以跟蹤δ13C 和δ15N 隨時間的變化，量化魚類洄游中的食物來源，推斷不同的棲息地環(huán)境進(jìn)而得出洄游路線[38-40]。通過洄游路線分析物種內(nèi)、種群內(nèi)和個體之間覓食行為的微觀棲息地變化，為監(jiān)測漁業(yè)資源、提高漁業(yè)生產(chǎn)效率及增殖放流等提供一個新的觀察角度，也可為珍惜洄游魚類的保護(hù)提供規(guī)劃。

為了確定安大略湖大西洋鮭（Salmo salar）種群是否會到大西洋溯河產(chǎn)卵，Guiry 等[41]利用考古發(fā)掘的骨骼與歷史博物館存檔的鮭鱗片進(jìn)行碳、氮、硫穩(wěn)定同位素分析，結(jié)果表明來自安大略湖的原始鮭種群其整個生命周期并沒有遷移到大西洋溯河產(chǎn)卵。該項(xiàng)研究時間跨度長達(dá)500 余年，為后續(xù)增殖放流和資源保護(hù)提供了重要依據(jù)。崔瑩等[42]通過采集野生中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）洄游路線上不同時間段的幼體及可能的食物來源，探討在洄游時期幼蟹的食性轉(zhuǎn)變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從大眼幼體到幼蟹，δ13C 值減小，而δ15N 值增加，表明野生絨螯蟹洄游遷徙過程中營養(yǎng)級增高，由攝食浮游生物轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞?，且逐漸加大攝取陸源性食物。Silva等[43]利用貝葉斯混合模型研究亞速爾群島藍(lán)鯨（Balaenoptera musculus）、塞鯨（Balaenoptera borealis）、長須鯨（Balaenoptera physalus）的營養(yǎng)生態(tài)位和遷移途徑。結(jié)果表明，長須鯨δ15N 值高于藍(lán)鯨和塞鯨，表明其具有較高營養(yǎng)位的攝食，混合模型則證明藍(lán)鯨和塞鯨主要利用來自非洲西北部上層和中上層熱帶/亞熱帶地區(qū)的食源，而長須鯨利用伊比利亞半島周圍食源。穩(wěn)定同位素技術(shù)的應(yīng)用為有效保護(hù)物種、遷移過程中的攝食信息起了關(guān)鍵性作用。

4 展望

穩(wěn)定同位素為水生動物的食性研究提供了新的技術(shù)途徑，可以從不同的角度開展研究，追蹤營養(yǎng)物質(zhì)的來源去向，在魚類等開口餌料的選擇、食性的轉(zhuǎn)換、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及捕食的多樣性等方面具有重要意義[44-47]。貝葉斯模型的引入可以在一定程度解決穩(wěn)定同位素的食性研究所面臨的方法學(xué)限制，但在食物網(wǎng)季節(jié)性變化與基線變化方面仍具有一定的挑戰(zhàn)[48-51]，未來需要對這兩點(diǎn)設(shè)計(jì)新模型和算法。

食物來源相似的同位素比例經(jīng)常重疊，無法識別特定食源物種，只能分辨大類的官能團(tuán)，這可能會掩蓋數(shù)量上次要但營養(yǎng)上重要的食源。通過與DNA 條形碼、脂肪酸分析等[52-55]其他檢測方法結(jié)合，進(jìn)行餌料豐度分析時，可以提高在物種水平上確定潛在食源的準(zhǔn)確性。未來隨著穩(wěn)定同位素檢測方法示蹤識別能力的提高，例如面對棲息地遷移、季節(jié)性食源變化和餌料出現(xiàn)頻率時，水生動物同化餌料存在一定的時間滯后性，考慮穩(wěn)定同位素動力學(xué)，量化穩(wěn)定同位素周轉(zhuǎn)率，建立特定條件下的同位素時鐘來提供準(zhǔn)確的參數(shù)[56]，可以更好地定位物質(zhì)、能量流動，為水生動物的食性研究提供更好的參考依據(jù)。