川烏配伍地榆的毒性研究*

馬彬焰,陳桃香,何席呈,胡家震,唐 娟,熊厚溪,胡成剛▲

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550025;2.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,貴州 畢節(jié) 551700)

近年來(lái)苗族醫(yī)藥得到較好的發(fā)展,苗族醫(yī)與藥緊密相連,苗醫(yī)治病奇效,苗藥起到關(guān)鍵因素,風(fēng)濕類疾病是苗醫(yī)治療的優(yōu)勢(shì)病種,其治療所用藥物大部分都具有毒與效雙重特性,這也導(dǎo)致安全用藥有一定的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。

在貴州省黔東南州調(diào)研過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)苗醫(yī)長(zhǎng)期使用烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)治療風(fēng)濕病、跌打損傷疼痛等疾病,同時(shí)藥方常配伍加入地榆,達(dá)到減毒存效的作用[4]。在臨床中的應(yīng)用,烏頭類藥材通常采用加工炮制品或與其他中藥(甘草、白芍、干姜等)配伍使用,保持良好療效的同時(shí)又能夠降低毒性,保證用藥安全。調(diào)查發(fā)現(xiàn)苗醫(yī)以川烏配伍地榆使用,且安全有效;經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),未見關(guān)于川烏與地榆配伍的相關(guān)報(bào)道。在前期工作的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)研究川烏及其與地榆配伍的毒性作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠,體重18～22 g,204只,8周齡內(nèi),雌雄各半(廠家:長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0014)。

1.2 藥材

川烏藥材采集于2021年5月,采自云南省麗江市,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳之坤教授鑒定為川烏(AconitumcarmichaeliiDebx.)的根。

取川烏粗顆粒1 kg,采用滲漉法,以75%乙醇作為滲漉溶劑,滲漉一周,收集滲漉液,合并濾液,45 ℃旋蒸濃縮濾液至一定體積(約1600 mL),將所有藥液分裝于自封袋中,水平擺放于-60 ℃低溫冰箱內(nèi),2天后取出,立即放入真空干燥機(jī)冷凍干燥,最后得到川烏酒泡液199.5 g凍干粉,得膏率為20%。

取地榆粗顆粒3 kg,加入5倍體積量蒸餾水,回流提取2次,每次15 min,過(guò)濾,合并濾液,濃縮至一定體積(約2000 mL),將所得濾液裝于自封袋中,水平放置在-60 ℃的低溫冰箱中,2天后取出,放入真空干燥機(jī)冷凍干燥,得到地榆水煎液300.7 g凍干粉,得膏率為30%。

分別將提取凍干粉于干燥器中保存,臨用時(shí)配成不同的劑量組。

1.3 儀器與試劑

轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016,德國(guó)),JT-12S自動(dòng)組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),BMJ-A型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠),RS36型全自動(dòng)染色機(jī)(常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司),PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司),數(shù)字切片掃描儀(Pannoramic 250,3DHISTECH(Hungary))。10%中性甲醛固定液(LL-A1-02,成都里來(lái)生物科技有限公司),無(wú)水乙醇(GB678-90成都海興化工試劑廠),米酒(實(shí)驗(yàn)室自釀38% Vol.),磷酸氫二鈉,甲醛,二甲苯,蘇木素染液(CR2102133,武漢塞維爾生物科技有限公司),伊紅染液(CR2101094,武漢塞維爾生物科技有限公司),中性樹膠(70050050,Biosharp生物公司)等。

2 方法[5-7]

2.1 劑量設(shè)置

取小鼠,雌雄各半,根據(jù)分層隨機(jī)法,隨機(jī)分成11組,采用階梯法來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。即空白組(10只),川烏給藥組:1.5 g/kg、1 g/kg、0.75 g/kg、0.5 g/kg、0.25 g/kg 5個(gè)劑量,川烏配伍地榆(1∶2)給藥組:2 g/kg、1.5 g/kg、1 g/kg、0.75 g/kg、0.5 g/kg 5個(gè)劑量,每組(16～18只)。正常對(duì)照灌胃等量米酒。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

將小鼠飼養(yǎng)觀察一周,適應(yīng)環(huán)境。動(dòng)物預(yù)試驗(yàn)下測(cè)得引起(0%)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡及(100%)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的劑量。給藥前12 h動(dòng)物禁食不禁水,結(jié)合預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果,按照20 mL/kg劑量對(duì)小鼠灌胃給藥,于給藥后的30 min內(nèi)詳細(xì)觀察并記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng),在給藥后的4 h和24 h內(nèi)觀察并記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、死亡狀況和死亡時(shí)間分布,對(duì)已死亡動(dòng)物進(jìn)行解剖。采用目測(cè)概率單位法計(jì)算各給藥劑量組小鼠的LD50值。

3 結(jié)果

3.1 中毒表現(xiàn)

空白組灌胃后,出現(xiàn)暈轉(zhuǎn)、站不穩(wěn)、麻木等現(xiàn)象,30 min后開始緩解,24 h后全部恢復(fù)正常。給藥組在30 min內(nèi),小鼠出現(xiàn)干嘔、顫抖、抽搐、喘息、嘔吐、口吐白沫、流涎、呼吸急促、運(yùn)動(dòng)減少、昏睡、僵住、膚白體涼、尿失禁、便稀、毛發(fā)凌亂等中毒表現(xiàn)。立即解剖死亡動(dòng)物,發(fā)現(xiàn)因呼吸系統(tǒng)衰蝎死亡,可見大量藥液殘留在胃中,少許藥液殘留于腸內(nèi),部分肝臟顏色偏暗,其他臟器未見異常。

3.2 小鼠的LD50值

觀察4 h、24 h內(nèi),各給藥組小鼠死亡情況,結(jié)果如表1-表5及圖1-圖2所示。

圖1 川烏配伍地榆前后4 h內(nèi)小鼠死亡率對(duì)比曲線圖

圖2 川烏配伍地榆前后24 h內(nèi)小鼠死亡率對(duì)比曲線圖

表1 川烏給藥組4 h內(nèi)小鼠死亡結(jié)果

表2 川烏給藥組24 h內(nèi)小鼠死亡結(jié)果

表3 川烏配地榆(1∶2)給藥組4 h內(nèi)小鼠死亡結(jié)果

表4 川烏配地榆(1∶2)給藥組24 h內(nèi)小鼠死亡結(jié)果

表5 川烏樣品4 h和24 h內(nèi)LD50值得比較

回歸方程為:Y=3.1362X+5.7994(r=0.985),其中,Y為概率單位加5后的值,X為劑量的對(duì)數(shù)LogX;a=0.01時(shí),查表得r為0.9590,所以LD50=0.5561 g/kg,置信系數(shù)a=0.05時(shí),95%的置信區(qū)間為:0.4529～0.6827 g/kg。

回歸方程為:Y=3.0519X+5.8730(r=0.9631),其中,Y為概率單位加5后的值,X為劑量的對(duì)數(shù)LogX;a=0.01時(shí),查表得r為0.9590,所以LD50=0.5175 g/kg,置信系數(shù)a=0.05時(shí),95%的置信區(qū)間為:0.3672～0.7294 g/kg。

回歸方程為:Y=3.5293X+4.6142(r=0.9537),其中,Y為概率單位加5后的值,X為劑量的對(duì)數(shù)LogX;a=0.01時(shí),查表得r為0.9590,所以LD50=1.2863 g/kg,置信系數(shù)a=0.05時(shí),95%的置信區(qū)間為:0.9398～1.7605 g/kg。

回歸方程為:Y=4.6532X+5.0066(r=0.9684),其中,Y為概率單位加5后的值,X為劑量的對(duì)數(shù)LogX;a=0.01時(shí),查表得r為0.9590,所以LD50=0.9967 g/kg,置信系數(shù)a=0.05時(shí),95%的置信區(qū)間為:0.7897～1.2581 g/kg。

4 小結(jié)與討論

4.1 小結(jié)

以有毒苗藥川烏為研究對(duì)象,以降低毒性研究為主線,對(duì)川烏生品及其與地榆配伍進(jìn)行急性毒性研究,結(jié)果表明:川烏配伍地榆后的毒性明顯低于川烏的毒性。川烏配伍地榆藥液在4 h和24 h內(nèi)的LD50值分別為1.2863 g/kg、0.9967 g/kg,置信區(qū)間分別為0.9398～1.7605 g/kg和0.7897～1.2581 g/kg;生川烏藥液在4 h和24 h內(nèi)的LD50值分別為0.5561 g/kg、0.5175 g/kg,95%的置信區(qū)間分別為0.4529～0.6827 g/kg和0.3672～0.7294 g/kg。

4.2 討論

在川烏劑量(1.5 g/kg)相同的條件下,川烏及其與地榆配伍給藥時(shí)間在4 h內(nèi),川烏配伍地榆后動(dòng)物死亡率低于單味川烏小鼠累計(jì)死亡率,表明給藥4 h內(nèi)可以看出配伍地榆后毒性有所降低;當(dāng)川烏及其與地榆配伍給藥時(shí)間在24 h后,單味川烏給藥劑量為1.5 g/kg,川烏配伍地榆給藥劑量為1.5 g/kg和2.0 g/kg(以川烏劑量計(jì)算)時(shí),3組給藥組的小鼠累計(jì)死亡率一致。綜上可知川烏及其與地榆配伍給藥造成動(dòng)物死亡的0%～100%劑量范圍為0.5～1.5 g/kg。

在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,由于川烏毒性較大,動(dòng)物存在個(gè)體差異,藥物在動(dòng)物體內(nèi)的吸收和釋放有一定的差異性,從而造成動(dòng)物中毒死亡情況為兩種:一是一次灌胃給藥4～24 h內(nèi),小鼠累計(jì)死亡數(shù)接近整組動(dòng)物數(shù)的一半;二是一次灌胃給藥24～72 h內(nèi),小鼠累計(jì)死亡數(shù)幾乎接近于零;為更好觀察川烏及其與地榆配伍后的毒性大小,選擇了給藥4 h和24 h時(shí)間段來(lái)確定LD50值。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)有毒藥材川烏生品及其與地榆配伍的毒性變化分析,探究配伍對(duì)有毒藥材川烏毒性的影響,為后續(xù)其藥效學(xué)及其配伍減毒作用機(jī)制的研究提供了參考依據(jù),同時(shí)也為臨床安全有效用藥提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。