大蒜、洋蔥提取液在防治香菇常見病害細(xì)菌的應(yīng)用研究*

譚 波,黃坤寧,楊久玲,申 鷹

(1貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心,貴州 貴陽(yáng) 550000;2貴州省分析測(cè)試研究院,貴州 貴陽(yáng) 550000)

0 引言

香菇(Lentinusedodes)作為中國(guó)傳統(tǒng)食用菌之一,是世界第二大栽培食用菌[1]。香菇不僅營(yíng)養(yǎng)豐富而且具有很高的食藥用價(jià)值和保健功能[2-6],在我國(guó)食品產(chǎn)業(yè)中占有較大的比重?！笆濉睍r(shí)期,我國(guó)香菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,香菇產(chǎn)量占全球香菇總產(chǎn)量的95%以上,是我國(guó)總產(chǎn)量最高、生產(chǎn)區(qū)域最廣、影響最大的食用菌產(chǎn)品[7]。然而,香菇在菌袋出菇過(guò)程中經(jīng)常受到芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌等細(xì)菌的危害,導(dǎo)致香菇子實(shí)體停止生長(zhǎng),菌蓋、菌柄及菌褶褐變、腐爛并散發(fā)惡臭,菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育異常[8-9],出菇率下降,對(duì)香菇的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。

大蒜(AlliumsativumL.)屬百合科蔥屬,多年生草本植物,具有很多生物活性物質(zhì),其提取物對(duì)多種球菌、桿菌、真菌和病毒都有不同程度的抑制和殺菌作用[10-13]。洋蔥(AlliumcepaL.)屬百合科蔥屬,二年生草本植物,含有各種有效的抑菌成分,其提取物可抑制葡萄球菌屬、鏈球菌屬、弧菌、芽孢桿菌等多種微生物的生長(zhǎng)[14-17]。近年來(lái),隨著生物農(nóng)藥研究的興起,大蒜、洋蔥提取物對(duì)病原菌的抑菌作用成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。大蒜和洋蔥提取物正逐步在食品中得到應(yīng)用,均主要集中在食品保鮮和品質(zhì)影響[18-24],而對(duì)香菇菌種生長(zhǎng)影響及其在香菇雜菌抑制效果方面少有報(bào)道。在當(dāng)前倡導(dǎo)無(wú)公害、無(wú)污染、無(wú)農(nóng)藥殘留的發(fā)展背景下,解決香菇菌種的雜菌污染問(wèn)題,尋找一種“綠色藥劑”,進(jìn)行雜菌防治顯得尤為重要。本試驗(yàn)通過(guò)研究大蒜、洋蔥提取液及其混合液對(duì)香菇常見的病原細(xì)菌的抑制效果,及對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響,旨在研究從源頭防控香菇病原細(xì)菌危害的方法,為香菇產(chǎn)業(yè)的持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇(CICC14019)、香菇(CICC14030)、香菇(CICC14009),中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis,CMCC(B)63501]、蠟樣芽孢桿菌[Bacillus cereus,CMCC(B)63303]:-20 ℃凍存,熒光假單胞菌(P.Fluorescens,ATCC13525):常溫液體石蠟封存,廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心食品安全菌種保藏中心。

95%乙醇,分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;氯化鈉(NaCl),分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司;大蒜、洋蔥購(gòu)自貴州省貴陽(yáng)市白云區(qū)。

1.2 儀器與設(shè)備

組織研磨機(jī),Tube MILL control,IKA;電子天平,LT2002,常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司;生化培養(yǎng)箱,BSP-250,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;蒸汽滅菌器,SX700,KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC(日本);生物安全柜,Ⅱ級(jí)A2,賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,RE-2000A,上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵,SHB-Ⅲ,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;超聲波清洗器,SK250HP,上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī),L550,長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取液制備

將洋蔥、大蒜各去掉外皮,分別用組織研磨機(jī)研碎,40 ℃酶解30 min,與95%乙醇按照質(zhì)液比1∶2的比例充分混勻,在35 ℃水浴下超聲提取45 min,離心10 min后收集上清液,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,得到浸提液母液,濃度為2 g/mL,過(guò)濾除菌,冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種復(fù)壯及菌懸液制備

將凍存的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌從冰箱取出恢復(fù)至室溫,將其和熒光假單胞菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)一天得到試驗(yàn)菌株,使用無(wú)菌棉簽挑起經(jīng)復(fù)壯后的試驗(yàn)菌株單個(gè)菌落于9 mL無(wú)菌生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)媳葷岫葷舛鹊木鷳乙?再用9 mL無(wú)菌生理鹽水將其稀釋為106CFU / mL試驗(yàn)菌株菌懸液。

1.3.3 培養(yǎng)基制備

生理鹽水:稱取8.5 g氯化鈉溶于1000 mL純水中,分裝,121 ℃高壓滅菌15 min,冷卻后備用。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂:稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂3.3 g,加入100 mL純水溶解,121 ℃高壓滅菌15 min,50 ℃保溫備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:稱取PDA 4.01 g,加入100 mL純水溶解,121 ℃高壓滅菌15 min,50 ℃保溫備用。

1.3.4 抑菌試驗(yàn)

用無(wú)菌水將大蒜、洋蔥提取液稀釋,制成終濃度分別為2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL的提取液。同時(shí)按照大蒜和洋蔥的提取液比例為1∶1,1∶3,1∶7,3∶1混合。取1 mL“1.3.2”中制備的各試驗(yàn)菌株菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻,倒15～20 mL至平板,待平板凝固后,在平板上等距離放置4個(gè)滅菌牛津杯,在牛津杯中加入0.2 mL提取液,每個(gè)提取液做3個(gè)重復(fù),同時(shí)用無(wú)菌水做空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)18 h,采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.5 大蒜、洋蔥提取液對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)影響試驗(yàn)

分別取濃度為2 g/mL的大蒜、洋蔥提取液及其混合液31.25 μL、62.5 μL、125 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL、4000 μL與100 mL PDA培養(yǎng)基混勻倒入培養(yǎng)皿,分別制成含提取液終濃度為0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、80 mg/mL的PDA平板備用,用不加提取液的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。接種直徑為0.5 cm的香菇菌絲塊,25 ℃培養(yǎng)4～8 d,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,當(dāng)空白對(duì)照菌落直徑達(dá)培養(yǎng)皿的2/3時(shí),按以下公式計(jì)算相對(duì)抑制率(%):

相對(duì)抑制率=

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜、洋蔥提取液及其混合液對(duì)香菇中常見病害細(xì)菌抑菌效果

采用“1.3.4”方法對(duì)各濃度的大蒜、洋蔥提取液及其混合液分別開展抑菌試驗(yàn),結(jié)果見表1-表3。

表1 大蒜提取液對(duì)香菇中常見病害細(xì)菌的抑菌效果

表2 洋蔥提取液對(duì)香菇中常見病害細(xì)菌的抑菌作用

表3 大蒜、洋蔥混合提取液對(duì)香菇中常見病害細(xì)菌的抑菌作用

表1-表3結(jié)果顯示,大蒜、洋蔥提取液及其混合液均對(duì)香菇常見病害細(xì)菌有抑菌作用,抑菌效果為大蒜提取液>混合液>洋蔥提取液。大蒜提取液對(duì)3種香菇常見病害細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌作用,且抑菌效果為蠟樣芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌>熒光假單胞菌。洋蔥提取液僅對(duì)芽孢桿菌有抑菌作用,且對(duì)兩種芽孢桿菌的抑菌效果相當(dāng)。大蒜、洋蔥混合液對(duì)3種病害細(xì)菌均有抑菌作用,隨著大蒜濃度的增加抑菌效果也隨之增強(qiáng);但對(duì)3種細(xì)菌的抑菌效果與單一的大蒜或洋蔥提取液的不同,其抑菌效果為枯草芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>熒光假單胞菌。

2.2 大蒜、洋蔥提取液及其混合液對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響

采用“1.3.5”的試驗(yàn)方法,取各濃度的大蒜、洋蔥提取液及其混合液分別對(duì)3種香菇菌種開展菌種生長(zhǎng)試驗(yàn),結(jié)果見表4-表6;各提取液對(duì)3種香菇菌種菌絲抑制效果見圖1-圖3。

圖1 大蒜、洋蔥提取液及混合液對(duì)CICC14030的抑制效果

圖2 大蒜、洋蔥提取液及混合液對(duì)CICC14019的抑制效果

圖3 大蒜、洋蔥提取液及混合液對(duì)CICC14009的抑制效果

表4 大蒜提取液對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響

表6 大蒜、洋蔥混合提取液對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響

以上結(jié)果顯示,單一的大蒜提取液對(duì)3種香菇菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的影響,隨著大蒜提取液濃度的增加,對(duì)香菇的抑制作用也逐漸增強(qiáng);大蒜提取液濃度<5 mg/mL,抑制效果為CICC14019>CICC14030>CICC14009;大蒜提取液濃度>5 mg/mL,3種香菇菌絲均停止生長(zhǎng)。單一的洋蔥提取液在高濃度時(shí)才對(duì)3種香菇有明顯的抑制作用,抑制效果為CICC14019>CICC14030>CICC14009,在適當(dāng)?shù)难笫[提取液濃度下,對(duì)香菇CICC14009有一定的促生長(zhǎng)作用;當(dāng)洋蔥提取液濃度在1.25～20 mg/mL時(shí),對(duì)香菇CICC14009具有促生長(zhǎng)作用,且在濃度為1.25～10 mg/mL時(shí),隨著洋蔥提取液濃度的增加,促生長(zhǎng)作用也隨之增強(qiáng)。

大蒜、洋蔥提取液的混合液對(duì)3種香菇的影響效果與單一的大蒜、洋蔥提取液對(duì)3種香菇的影響效果相當(dāng),主要表現(xiàn)為隨著大蒜提取液含量比例的增加,對(duì)3種香菇的抑制效果增強(qiáng);隨著洋蔥提取液含量比例的增加,對(duì)3種香菇的抑制效果減弱。

3 結(jié)論

大蒜、洋蔥提取液及其混合液對(duì)香菇病害細(xì)菌均有抑菌作用,大蒜提取液的抑菌效果強(qiáng)于洋蔥提取液的抑菌效果;大蒜提取液對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌均有抑菌作用,洋蔥提取液僅對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌有抑菌作用,對(duì)熒光假單胞菌無(wú)抑菌作用。對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響根據(jù)香菇菌種的不同抑制效果也不相同,主要為大蒜提取液對(duì)香菇菌絲的抑制效果強(qiáng)于洋蔥提取液對(duì)香菇菌絲的抑制效果;大蒜提取液對(duì)3種香菇的抑制效果為CICC14019>CICC14030>CICC14009,洋蔥提取液在高濃度時(shí)對(duì)3種香菇有明顯抑制作用,在低濃度時(shí)對(duì)香菇CICC14009菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明,大蒜、洋蔥提取液均有抑菌作用,可作為天然抑菌劑開發(fā)應(yīng)用;洋蔥提取液具有改良香菇生長(zhǎng)培養(yǎng)基的潛力。

由于天然抑菌劑具有綠色安全、無(wú)毒無(wú)害、無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn),隨之被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域,越來(lái)越多的天然抑菌劑被發(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)用大蒜及洋蔥提取液作為抑菌劑,開展防治香菇病害細(xì)菌的研究,為今后的相關(guān)研究提供參考,以提高食用菌產(chǎn)業(yè)防治食用菌細(xì)菌性病害的水平,促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量持續(xù)發(fā)展。