NEDD4泛素連接酶家族在骨質(zhì)疏松癥中的研究

劉延 劉青山 何大為

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué),上海 200433

2. 上海長海醫(yī)院脊柱外科,上海 200433

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是我國一種常見的全身性骨骼疾病,多發(fā)生在老年人,尤其好發(fā)于絕經(jīng)后女性[1]。其最主要的發(fā)病機制是由于各種原因?qū)е鹿侵厮馨l(fā)生失調(diào),介導(dǎo)骨形成的成骨細胞和介導(dǎo)骨吸收的破骨細胞之間的動態(tài)平衡被打破,從而導(dǎo)致骨質(zhì)流失過多以及骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞。并且這種疾病具有高度的遺傳性,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)確定了數(shù)百個易感位點[2-3]。然而,對具體的致病基因以及后續(xù)的分子機制仍然缺少完整的認知,目前的研究認為骨重塑過程中的OPG-RANK-RANKL信號通路是維持骨代謝動態(tài)平衡的主要調(diào)控路徑,而當(dāng)其介導(dǎo)的破骨細胞活化出現(xiàn)異常,會直接導(dǎo)致骨密度的下降[4]。

泛素化屬于蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要修飾手段,通過泛素激活酶(ubiquitin- activating enzyme,E1 )、泛素結(jié)合酶 (ubiquitin-conjugating enzymes,E2) 和泛素連接酶 (ubiquitin ligases,E3)的協(xié)同作用,將泛素蛋白或泛素鏈與底物蛋白以共價鍵的形式結(jié)合[5]。其中泛素連接酶的主要功能是將泛素轉(zhuǎn)移到其所識別的特異性底物蛋白上,同時又根據(jù)其與底物蛋白作用的結(jié)構(gòu)和機制的不同分為HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING結(jié)構(gòu)域家族、U-box結(jié)構(gòu)域家族3種類型。NEDD4泛素連接酶家族屬于其中的HECT家族,包含Nedd4/4 l、Wwp1/2、Smurf1/2、NEDL1/2和itch共9個成員[6]。近年來,隨著對泛素化過程以及泛素連接酶研究的深入,越來越多的證據(jù)表明泛素連接酶在骨重塑過程中重要的調(diào)節(jié)作用[7]。本文擬對NEDD4泛素連接酶家族成員對骨質(zhì)疏松癥的影響進行綜述。

1 泛素連接酶Smurf1

Smurf1是與骨重塑最相關(guān)也是研究最多的泛素連接酶,其主要在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,也是成骨細胞分化和骨量積累的主要負性調(diào)控因子[8]。在成骨細胞前體中過表達Smurf1基因會導(dǎo)致成骨細胞分化受到抑制,而在動物模型中分別過表達或者敲除Smurf1基因也都出現(xiàn)對應(yīng)的骨質(zhì)疏松癥以及骨硬化癥的表型[9-10]。近期一例因Smurf1基因異常復(fù)制所致的兒童骨質(zhì)疏松癥的病例報告也體現(xiàn)了Smurf1在人體內(nèi)對于成骨細胞的抑制作用[11]。

Smurf1主要通過兩種途徑抑制成骨細胞的分化。首先其能夠泛素化降解BMP與受體結(jié)合后激活的Smad1/5/8,從而阻斷成骨細胞發(fā)育所必須的BMP信號通路。其次Smurf1還能降解促進成骨細胞活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2,從而導(dǎo)致成骨細胞的分化、活性以及對BMP的反應(yīng)受到抑制(圖1)[9,12]。對于年齡相關(guān)性的老年骨質(zhì)疏松患者進行基因表達檢測發(fā)現(xiàn)Smurf1基因表達量沒有變化,但Smurf1的活性出現(xiàn)異常上升以及BMP-2水平的下降[9]。據(jù)此進行分組研究并建立小鼠模型,在加入靶向成骨細胞的 (DSS)6以及Smurf1的抑制劑查耳酮衍生物(chalcone derivative)的復(fù)合物 (DSS)6-chalcone derivative后,能夠促進年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松小鼠模型的全身骨形成,這對于藥物治療年齡相關(guān)性的骨質(zhì)疏松癥患者具有重要的指導(dǎo)意義[9]。單純的給予促進骨形成的藥物如重組人BMPs(rhBMPs)而未考慮如Smurf1等影響因素的作用,其臨床療效就會類似rhBMPs一樣出現(xiàn)巨大的個體間差異,從而減小了其臨床應(yīng)用的適用范圍。利用一系列Smurf1的抑制劑來促進骨質(zhì)疏松癥的恢復(fù)具有較好的臨床應(yīng)用前景[9,12-13]。

圖1 Smurf1調(diào)控成骨細胞分化的主要途徑Fig.1 The osteoblast differentiation pathways are regulated by Smurf1

2 泛素連接酶Smurf2

Smurf2與Smurf1具有高度的氨基酸序列相似性,也均由成骨細胞和增殖軟骨細胞表達,兩者在構(gòu)成上的不同在于Smurf1中少了一個WW1結(jié)構(gòu)域[14]。同時,Smurf2也是一種骨形成抑制分子,能夠泛素化Smad1/5進行蛋白酶體降解,從而負調(diào)控BMP信號通路(圖2)[15]。Smurf2-/-與Smurf1-/-的成骨細胞均表現(xiàn)為分化增強[15-16]。值得關(guān)注的是不同于Smurf1-/-小鼠的類似人骨硬化癥的表型,Smurf2-/-小鼠出現(xiàn)了類似骨質(zhì)疏松患者的表型,而且這種低骨量表型伴隨著破骨細胞數(shù)量的顯著增加[16]。進一步研究表明缺乏Smurf2的破骨細胞并沒有改變其內(nèi)在活性,而是因為Smurf2-/-成骨細胞分泌了過多的破骨細胞分化因子RANKL,導(dǎo)致破骨細胞的分化增多[16]。對于骨重塑的過程而言,Smurf2既有骨形成抑制因子的作用,又能夠抑制骨吸收作用。

圖2 Smurf2調(diào)控成骨細胞分化以及破骨細胞分化的主要途徑Fig.2 The osteoblast and osteoclast differentiation pathways are regulated by Smurf2

圖3 利用GEO2R對GSE56815中的40例樣本進行分析Fig.3 GEO2R is used to analyze 40 samples in GSE56815

Smurf2作用于成骨細胞從而抑制破骨細胞分化因子RANKL表達的具體過程已經(jīng)被揭示[16]。在正常人體內(nèi)的Smurf2能夠介導(dǎo)Smad3發(fā)生K-48位的泛素化,繼而被細胞內(nèi)的蛋白酶體識別后降解,抑制了Smad3與維生素D受體(VDR)之間的結(jié)合,從而抑制VDR與RANKL啟動子的結(jié)合,減少了RANKL的表達。并且利用1,25-(OH)2D3不能提高Smurf2-/-成骨細胞分泌的RANKL,這可能為治療內(nèi)分泌紊亂介導(dǎo)的骨破壞增加提供新的治療靶點[16]。同時,這個機制的發(fā)現(xiàn)證實了Smurf2與Smurf1在骨代謝過程中功能的差異。利用這個機制以及對體內(nèi)針對Smurf2調(diào)控因子的研究,如TRAF4[17]、MicroRNA-130a[18]、lncRNA CCAT1[19],有望為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的方向。值得關(guān)注的是,Smurf2對于骨重塑作用的雙面性仍然不能忽視。

3 泛素連接酶Wwp1

Wwp1在體內(nèi)也屬于一種成骨細胞分化抑制因子,主要作用機制是泛素化降解成骨細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2,而最近的研究多關(guān)注在利用富集在骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體中的MicroRNA抑制Wwp1從而促進成骨細胞分化以及骨折后的修復(fù)[20-21]。在相對應(yīng)的Wwp1-/-小鼠模型中,出現(xiàn)骨量增加的表型,并且小鼠的成骨細胞遷移和分化增強,表明Wwp1也能通過影響成骨細胞的遷移和分化來負性調(diào)節(jié)成骨細胞功能[22]。

對于慢性炎癥性疾病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥患者,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者常常伴有骨質(zhì)疏松癥,這種骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的主要原因是患者體內(nèi)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)增多,從而導(dǎo)致TNF誘導(dǎo)的骨吸收增加和骨形成減少[23]。而Wwp1也在其中起著關(guān)鍵的作用,TNF通過Wwp1抑制間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。其具體作用機制為Wwp1促進了促成骨細胞分化轉(zhuǎn)錄因子JunB的泛素化降解,在間充質(zhì)干細胞中抑制其表達有望成為一種新的治療方式[24]。而最近的一項研究則提出了利用核酸適配體(aptamer)特異性的抑制Wwp1介導(dǎo)的蛋白酶體泛素化作為一種新的骨質(zhì)疏松治療策略[25]。

同時,筆者利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建的基因表達GEO數(shù)據(jù)庫所提供的在線分析工具GEO2R對GSE56815(高或低骨密度的絕經(jīng)前后女性血單核細胞的基因表達研究)進行分析[26]。該數(shù)據(jù)集包括了80例樣本,其中絕經(jīng)前后女性各40例,同時又根據(jù)骨密度高低可分為4組。在其中20例絕經(jīng)后高骨密度對比絕經(jīng)后20例低骨密度的單核細胞基因表達量來看,Wwp1的表達量呈現(xiàn)有意義的降低。

4 泛素連接酶Wwp2

Wwp2主要在軟骨細胞中表達,同時在顱面骨的發(fā)育過程中起到了重要的作用,Wwp2-/-的小鼠出現(xiàn)典型的顱面部骨骼發(fā)育畸形[27]。一項研究認為Wwp2能夠以非蛋白水解單泛素化的方式增強RUNX2的激活,并且在間充質(zhì)干細胞和成骨細胞中敲除Wwp2基因會導(dǎo)致成骨細胞的顯著缺陷,包括礦物質(zhì)沉積減少和成骨標(biāo)記基因的下調(diào),Wwp2是一種成骨的正向調(diào)節(jié)因子[28]。而另外一項研究認為Wwp2通過Runx2多泛素化和降解抑制Runx2誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎重要發(fā)病因素血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5(Adamts5),以保護骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細胞[29]。

5 泛素連接酶Itch

Itch對于成骨細胞和破骨細胞都具有抑制作用。首先Itch通過對破骨細胞分化的關(guān)鍵信號分子TRAF6的去泛素化來抑制破骨細胞分化[30],其次Itch還能促進成骨細胞相關(guān)蛋白的蛋白酶體降解而負性調(diào)節(jié)成骨細胞功能[31-32]。在Itch-/-小鼠中分離出的骨折愈合組織中表達了更高水平的成骨細胞相關(guān)基因,如Runx2等[31]。一項針對服用抗抑郁藥克羅米帕明(CLP)患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)其骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險大幅增加,進一步研究其機制發(fā)現(xiàn)CLP抑制了Itch,從而導(dǎo)致破骨細胞的分化失控,而唑來膦酸能夠抑制這種破骨細胞的分化增強[33]。這表明,Itch有潛力成為破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收增強類疾病的治療靶點。

6 小結(jié)

成骨細胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收之間的動態(tài)平衡是維持人骨量健康的重要因素,各種原因?qū)е碌墓侵厮芪蓙y都會誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。成骨細胞主要由人間充質(zhì)干細胞分化而來,而破骨細胞的分化則需要成骨細胞分泌的RANKL與巨噬細胞上的RANK受體結(jié)合,招募TRAF6,繼而激活下游NF-κB、MARK等信號通路[34-35]。各項研究證據(jù)都表明泛素連接酶能夠積極參與骨重塑過程,并且在其中扮演著重要的角色(圖4)。明確這些泛素連接酶的具體作用機制能夠為我們治療如骨質(zhì)疏松癥一類疾病提供新的方向。

圖4 Nedd4泛素連接酶家族成員對骨重塑過程的影響Fig.4 Effects of NEDD4 ubiquitin ligase family members on bone remodeling