Hippo信號通路成骨、成肌分化功能研究進展

陳博 鄧強 李中鋒 彭冉東 王雨榕 劉晏東

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000

2. 甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000

Hippo信號通路是高度保守的通路,在調(diào)節(jié)組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、器官大小、干細胞自我更新或分化中起重要作用[1]。Hippo通路的輔因子YAP與TAZ通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄增強相關(guān)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEAD)家族轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)多種基因的表達,促進組織生長和細胞生存[2]。肌少-骨質(zhì)疏松癥(osteo-sarcopenia,OS)是肌少癥(sarcopenia,SP)和骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)并存的退行性代謝綜合征[3-4]。隨著全球人口老齡化的加劇,OS的發(fā)病率逐年上升[5],嚴重影響人們的健康并為社會醫(yī)療帶來巨大負擔(dān)[6]。肌肉和骨骼均起源于間充質(zhì)干細胞,組織發(fā)育具有同源性,OS可通過對間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞和肌管的效應(yīng)進而影響肌肉-骨骼系統(tǒng)。

在骨代謝中,由成骨細胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收之間的動態(tài)平衡對建立理想的骨重建具有重要意義,而成骨細胞分化又是骨穩(wěn)態(tài)和修復(fù)的關(guān)鍵過程。骨骼肌的再生修復(fù)依賴于衛(wèi)星細胞,衛(wèi)星細胞增殖為成肌細胞,成肌細胞可分化為多核肌管,從而促進肌肉的生長[7]。以往的研究證明,BMSCs和BMPs以及骨骼肌衛(wèi)星細胞和成肌細胞可在Hippo通路的誘導(dǎo)下進行成骨、成肌分化[8-12]。本文就Hippo信號通路在成骨、成肌分化功能中的作用和機制的近期研究進展進行綜述。

1 Hippo信號通路概述

哺乳動物Hippo信號傳導(dǎo)成分包括腫瘤抑制劑哺乳動物STE20樣蛋白激酶1(MST1,也稱為STK4)和MST2(也稱為STK3),它們與果蠅中的Hpo直向同源;支架蛋白Salvador同源物1(SAV1,與果蠅中的Salvador直向同源);腫瘤抑制因子同源物1(LATS1)和LATS2(其與果蠅中的核Dbf2相關(guān)家族蛋白激酶Warts直向同源);以及支架蛋白MOB結(jié)構(gòu)域激酶激活物1A(MOB1A)和MOB1B。MST1、MST2和SAV1形成復(fù)合物磷酸化并激活LATS1和LATS2激酶,LATS1和LATS2激酶與輔因子MOB1相互作用,MOB1進一步磷酸化轉(zhuǎn)錄輔激活因子YAP和TAZ。Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活通過阻止YAP和TAZ易位到細胞核中并促進它們在細胞質(zhì)中的降解來抑制YAP和TAZ的轉(zhuǎn)錄活性。在不存在Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制的情況下,YAP和TAZ可以在核中與不同的轉(zhuǎn)錄因子如TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員(TEAD)配對,以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,如編碼調(diào)節(jié)細胞增殖和存活的蛋白質(zhì)的基因[13]。

雖然YAP和TAZ最常與TEAD相互作用,但這些共激活因子也顯示出與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的能力,其中包括CCAAT/增強子結(jié)合蛋白-α(C/EBPα)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、早期生長反應(yīng)蛋白1(EGR1)、受體酪氨酸蛋白激酶erbB4(ERBB4)、成肌細胞決定蛋白1(MYOD1)等。此外,一些因子抑制YAP和/或TAZ作為核轉(zhuǎn)錄輔因子的活性,如支架蛋白血管動蛋白樣蛋白1(AMOTL1)可與YAP和原鈣粘蛋白Fat4物理相互作用以形成將YAP隔離在細胞質(zhì)中的復(fù)合物[14],轉(zhuǎn)錄輔因子退化樣蛋白4(VGLL4)直接與YAP競爭TEAD在核中的結(jié)合[15],腫瘤抑制劑因子NF2(神經(jīng)纖維蛋白2)也主要通過激活Hippo激酶活性而起到Y(jié)AP抑制劑的作用[16]。

2 Hippo信號通路促成骨分化的研究進展

2.1 Hippo通路調(diào)控BMSCs影響骨生成

Hippo-YAP信號軸對BMSCs的成骨分化有著顯著的影響[17]。通常骨髓衍生的BMSCs、破骨細胞和成骨細胞參與骨代謝。近年來,一些研究報道骨質(zhì)疏松癥主要歸因于BMSCs的成骨分化降低[18]。作為成骨細胞的前體[19],刺激BMSCs增殖并分化成成骨細胞,從而提高骨生成的作用是至關(guān)重要的。

2.1.1αCGRP通過Hippo-YAP途徑調(diào)控BMSCs影響骨生成:G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)是膜受體的一個大家族,被鑒定為Hippo途徑和YAP與TAZ的調(diào)節(jié)劑[20]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP,一種37個氨基酸的肽)是在骨代謝、心血管系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)和疼痛的調(diào)節(jié)中表達的重要神經(jīng)肽[21],相關(guān)研究已經(jīng)證明CGRP能夠在體外刺激BMSCs分化成成骨細胞[22-23]。CGRP有兩種形式:αCGRP和βCGRP。傳統(tǒng)上認為αCGRP是骨形成的生理激活劑,而βCGRP對此過程幾乎沒有影響[24]。研究表明,αCGRP-/-小鼠的骨形成和骨量減少下調(diào)[25],進一步實驗發(fā)現(xiàn),通過體內(nèi)慢病毒轉(zhuǎn)染,αCGRP在鈦種植體周圍的骨發(fā)育、代謝和重塑中發(fā)揮重要的病理生理作用。

Fei等[26]指出CGRP誘導(dǎo)的小鼠BMSCs的骨生成與Hippo途徑有關(guān)。Hippo-YAP信號傳導(dǎo)是GPCR的下游分支,由于CGRP受體屬于GPCR,并且觀察到受體組分之一的降鈣素受體樣受體 (calcitonin receptor-like receptor, CLR)可以阻止YAP磷酸化[27],因此αCGRP通過Hippo-YAP途徑調(diào)控BMSCs影響骨生成。Yu等[28]也在他們的研究中發(fā)現(xiàn),CLR是Hippo信號通路受體的一種成分,其可以阻止YAP磷酸化。因此,CLR可能促進骨代謝過程中的YAP功能。

Wang等[8]應(yīng)用αCGRP慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMSCs,并進行轉(zhuǎn)染鑒定和細胞周期檢測,在野生型和αCGRP-/-小鼠的BMSCs中研究了αCGRP對成骨分化的影響,結(jié)果顯示BMSCs的生物學(xué)功能包括遷移能力和成骨能力與其αCGRP的表達呈正相關(guān)。這項研究顯示,成骨細胞相關(guān)標志物表達水平的增加與Hippo通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)器YAP的表達增強有關(guān)。

因此,αCGRP在骨重建的內(nèi)在機制中發(fā)揮著重要作用,并且提示αCGRP能促進骨生成。然而,其內(nèi)在機制尚不清楚,是否涉及其他信號通路也一直是個謎。

2.1.2RAMP1通過Hippo-YAP途徑調(diào)控BMSCs影響骨生成:受體活性修飾蛋白1(receptor activity-modifying protein-1,RAMP1,一種含有148個氨基酸的蛋白質(zhì))是一種單通道跨膜分子,具有一個大的胞外氨基末端和一個短的胞內(nèi)羧基尾[29]。它主要的生物學(xué)作用是通過與細胞表面的CLR結(jié)合, 協(xié)助CLR向細胞膜的轉(zhuǎn)運, 并形成CGRP的特異性受體,并且可以增強GPCR功能的多樣性[30]。通常,功能性CGRP受體由至少3種蛋白質(zhì)組成:CLR、RAMP1和RCP[31]。此外,這些蛋白質(zhì)還在調(diào)節(jié)受體運輸、信號傳導(dǎo)和細胞的生物學(xué)特性如增殖、遷移和分化中具有廣泛的作用[32]。

RAMP1可能是骨傷口愈合過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Lee等[33]在BMSCs中使用RAMP1過表達慢病毒系統(tǒng),堿性磷酸酶(ALP)活性測定和茜素紅染色顯示,在CGRP處理后,RAMP1促進了BMSCs的成骨分化。此外,實時聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡分析表明,RAMP1上調(diào)成骨表型標志物(ALP、矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨橋蛋白;P<0.05)。為了進一步揭示RAMP1在成骨分化中的機制,他們使用維替泊芬阻斷YAP1,結(jié)果顯示維替泊芬損害RAMP1誘導(dǎo)的骨生成。

有研究認為可以通過操縱RAMP1來調(diào)節(jié)CGRP功能。Bohn等[34]報告稱,全面表達人RAMP1的轉(zhuǎn)基因小鼠在各種組織中的CGRP信號傳導(dǎo)增加,以往的研究也證實了RAMP1亞基因轉(zhuǎn)移到血管平滑肌細胞中增加了CGRP功效。以往的研究表明RAMP1廣泛分布于成熟的成骨細胞中。最近的研究報告稱,RAMP1的過表達增強了鎂誘導(dǎo)的大鼠骨折愈合骨形成[35]。此外,Zhang等[36]證實,RAMP1過表達可促進外源性CGRP增強MG-63細胞的成骨分化。這些數(shù)據(jù)表明,RAMP1可能是骨生成過程中調(diào)節(jié)CGRP介導(dǎo)效應(yīng)的潛在治療靶點。

前期研究結(jié)果證實RAMP1是骨再生的關(guān)鍵介質(zhì),并表明RAMP1通過調(diào)節(jié)Hippo-YAP通路促進CGRP誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化,然而,RAMP1在成骨中的作用及機制尚不明確,未來仍需進一步研究。

2.2 Hippo通路調(diào)控BMPs影響骨生成

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是一種多功能的生長因子,在軟骨成熟和骨形成過程中起著重要作用[37]。BMP信號通路通過經(jīng)典的Smad和非經(jīng)典的p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑從質(zhì)膜受體轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞核,其傳導(dǎo)受多種內(nèi)源性和外源性分子機制在不同空間水平上以正向和負向方式調(diào)節(jié)[38]。研究表明YAP通過調(diào)控BMP信號通路誘導(dǎo)成骨細胞分化[39]。

以往的研究提出Hippo通路轉(zhuǎn)錄輔激活因子YAP和TAZ維持骨祖細胞的干細胞特性并抑制成骨細胞的終末分化,而其他研究提出它們增強成骨細胞的分化和骨形成。Brandao等[10]使用斑馬魚尾鰭再生作為模型,發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP通路是通過細胞非自主方式引導(dǎo)成骨細胞正確分化的基礎(chǔ)。結(jié)果表明,間充質(zhì)細胞中YAP活性通過旁分泌機制誘導(dǎo)成骨細胞中BMP信號的激活,從而指示成骨細胞分化的啟動。一方面,YAP可能與BMP信號一起通過調(diào)節(jié)dkk1a(Wnt信號傳導(dǎo)的負調(diào)節(jié)因子)的表達來抑制Wnt信號向近端胚基的擴展,從而限制骨祖細胞向遠端胚基的擴展。另一方面,更重要的是YAP促進了近端區(qū)域間充質(zhì)細胞中BMP2A(BMP信號傳導(dǎo)配體)的產(chǎn)生,這對于鄰近成骨細胞中BMP信號的激活以及成骨細胞的分化至關(guān)重要。

綜上所述,Brandao等[10]的研究提供了一種新的通過Hippo-YAP途徑形成骨的機制:將YAP整合到控制骨祖細胞維持和隨后分化的信號級聯(lián)中。證明了YAP抑制導(dǎo)致骨祖細胞的積累并以細胞非自主方式阻止成骨細胞分化,這種效應(yīng)與成骨細胞中BMP信號傳導(dǎo)的嚴重損害相關(guān),可能是通過抑制周圍間充質(zhì)細胞中配體BMP2A的表達。

3 Hippo信號通路促成肌分化的研究進展

骨骼肌包含一組指定的成體干細胞,稱為衛(wèi)星細胞,衛(wèi)星細胞的包含可能有助于增加肌肉質(zhì)量,而肌纖維損失導(dǎo)致肌肉質(zhì)量減少[40]。研究發(fā)現(xiàn)YAP和TAZ在人及小鼠的骨骼肌衛(wèi)星細胞和成肌細胞中均有表達[11]。Hippo通路下游效應(yīng)因子YAP和TAZ在骨骼肌衛(wèi)星細胞和成肌細胞的增殖和再生中起關(guān)鍵作用,尤其是通過TEAD轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達。轉(zhuǎn)錄輔因子YAP(YAP1)和TAZ(Wwtr1)主要通過結(jié)合TEAD1-4轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因表達。YAP和TAZ被Lats1/2磷酸化的多個HXRSS基序所抑制,從而促進細胞質(zhì)的定位、14-3-3蛋白結(jié)合和降解。YAP S127A和TAZ S89A是關(guān)鍵的磷酸化位點,YAP S127A和TAZ S89A中Ser127或Ser89分別突變?yōu)楸彼嶙柚沽诉@些殘基的磷酸化并導(dǎo)致組成型活性。

YAP與TAZ的信號傳導(dǎo)模塊控制骨骼肌的肌生成。TEAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在心臟和骨骼肌基因的啟動子和增強子中附近發(fā)現(xiàn)的CATTCC/GGAATG(MCAT或GTIIC基序)上[41],但TEAD1結(jié)合在橫紋肌肉瘤中受抑制的肌肉基因上[42],這可能與YAP和TAZ也可抑制基因表達有關(guān)。衛(wèi)星細胞負責(zé)出生后骨骼肌生長、肥大和修復(fù)再生[43],成肌細胞由肌衛(wèi)星細胞分化而來,并且有研究已經(jīng)表明YAP促進成肌細胞增殖[44]。YAP S127A在活化而非靜止衛(wèi)星細胞中的表達導(dǎo)致具有短潛伏期和100 %外顯率的胚胎橫紋肌肉瘤樣腫瘤[45]。YAP S127A在肌纖維中的表達引起肌病[46],而其他類型的YAP遞送或YAP突變體可引起肥大[47],結(jié)果可能取決于YAP水平。

3.1 效應(yīng)蛋白YAP調(diào)控成肌細胞影響肌生成

YAP的mRNA和蛋白質(zhì)表達在肌原細胞增殖期間高而在分化期間低[48]。此外,在C2C12細胞增殖期間,YAP Ser127磷酸化較低并且YAP定位于細胞核。分化后,YAP Ser127磷酸化增加約20倍,YAP從細胞核易位到胞質(zhì)溶膠。在分化階段,hYap1 S127A(一種不能在S127被Lats1/2磷酸化的YAP突變形式)的過表達誘導(dǎo)了兩種分化基因肌生成蛋白和Mef2c表達的降低,以及成肌細胞增殖基因Myf5的持續(xù)表達。

Gnimassou等[49]開發(fā)了可誘導(dǎo)的骨骼肌纖維特異性敲入小鼠模型(MCK-tTA-hYAP1 S127A)以測試組成型活性YAP(hYAP1 S127A)的過表達是否足以刺激肌肉肥大或纖維類型組成的改變,發(fā)現(xiàn)這種突變形式的YAP的表達在約5周后引起了一種肌病和肌肉萎縮,接著是一個再生過程,包括衛(wèi)星細胞的活化、增殖和分化。在分子水平上,衛(wèi)星細胞活化和分化的標志物Myf5、肌細胞生成素和Pax7以及蛋白質(zhì)降解的兩種標志物Atrogin-1和MuRF-1在mRNA水平上高度表達。值得注意的是,當(dāng)阻止YAP突變形式的表達時,纖維類型組成保持不變,萎縮和變性過程保持可逆。

然而,過表達總YAP而不是活性YAP可以通過與TEADs的相互作用誘導(dǎo)肥大,并且不依賴于mTOR的任何激活。Lin等[50]發(fā)現(xiàn)在肌原纖維成熟期間總YAP表達和S112磷酸化降低。此外,YAP表達的抑制引起肌原纖維大小的減小,并最終引起肌肉質(zhì)量的減小。這種質(zhì)量的減少與蛋白質(zhì)降解標記Atrogin-1、Musa1和MuRF-1的表達略微增加相關(guān)。因此得出結(jié)論,YAP的表達對于維持和增加肌原纖維的大小是必需的。Gnimassou等[49]通過激動劑消除對跖肌施加顯著的負擔(dān),發(fā)現(xiàn)YAP的更高表達以及TEADs進入跖肌的更高轉(zhuǎn)錄活性,由此突出YAP對肌肉上的機械負荷的敏感性。這種現(xiàn)象是伴隨Akt磷酸化以與YAP表達相似的模式增加以及伴隨注射雷帕霉素(PAPA)抑制mTOR后持續(xù)的肥大。Barker等[51]證實了YAP可以獨立于mTOR誘導(dǎo)肥大。這種肥大可能至少部分是由于MuRF-1的低表達和MyoD和c-Myc的高表達。

綜上所述,盡管一些研究表明YAP過表達或激活誘導(dǎo)肌肉萎縮,但其他人發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果,即YAP過表達后肥大。這些差異或許可以用誘導(dǎo)YAP表達的不同方式,病毒載體對基因突變和治療的持續(xù)時間來解釋。但也可能涉及其他未知因素,因此這個問題仍需進一步研究。

3.2 效應(yīng)蛋白TAZ調(diào)控成肌細胞影響肌生成

Sun等[52]在體內(nèi)和離體分析了TAZ,并與YAP進行了比較,小干擾RNA敲低或反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的野生型或組成型活性TAZ突變體在衛(wèi)星細胞中的表達表明,TAZ促進增殖,這是與YAP共有的功能。

然而,在肌發(fā)生的后期階段,TAZ促進成肌細胞的肌原性分化,而YAP抑制這種分化。在功能上,雖然TAZ(基因Wwtr1-/-)敲除小鼠的肌肉生長受到輕微影響,但對再生沒有明顯影響,相反,Pax7Cre-ERT2/1、YAPfl8x/fl8x和Rosa26Lacz小鼠產(chǎn)生再生缺陷。微陣列分析顯示了許多常見的TAZ與YAP靶基因,但TAZ也獨立于YAP調(diào)節(jié)一些基因,包括肌源性基因,如Pax7、Myf5和Myod1。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示,TAZ與YAP在生肌細胞中有許多新的結(jié)合配偶體,但TAZ也與不同于YAP的蛋白質(zhì)相互作用,這些蛋白質(zhì)通常參與肌生成和細胞骨架組織方面。最后,TAZ通過TEAD 4發(fā)揮作用,增強肌源性分化。

總之,TAZ和YAP在促進成肌細胞增殖方面具有重疊功能,但TAZ在肌發(fā)生的后期階段轉(zhuǎn)換為增強肌原分化。

4 總結(jié)與展望

隨著對Hippo信號通路以及YAP和TAZ的不斷深入研究,Hippo途徑在促進成骨、成肌分化功能中的作用也逐漸被證實,但其在作用過程中具體的發(fā)生機制以及作用中是否有其他信號通路的參與仍存在爭議。并且進一步的研究發(fā)現(xiàn),TGF-β、Wnt、Sonic-Hedgehog、Akt-mTOR等信號通路均可與Hippo信號通路發(fā)生交互作用[49]。

因此,未來應(yīng)進一步深入研究Hippo信號通路在調(diào)控成骨、成肌發(fā)生的細胞機制以及YAP與TAZ如何與其他信號通路的關(guān)鍵因子相互作用。Hippo通路在細胞和器官水平上感知內(nèi)源性和外源性信號以及調(diào)節(jié)生長的多個方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[53],所以未來該通路將在臨床諸多病癥的靶向治療上有著廣闊的研究前景。當(dāng)前,肌少-骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為全球性的公共健康問題和前沿研究難題[3],然而Hippo信號通路在其促進成骨、成肌分化功能中的作用展示了該通路未來治療肌少-骨質(zhì)疏松癥的廣闊前景和優(yōu)勢。故此,對Hippo信號通路在促進成骨、成肌分化過程中的相關(guān)作用機制和相關(guān)代謝的進一步研究,可為肌少-骨質(zhì)疏松癥臨床治療提供新的研究方向,為臨床技術(shù)的推廣帶來新思路?？偟膩碚f,鑒于YAP和TAZ作為組織再生促進劑的巨大潛力,我們現(xiàn)在可以期待Hippo-YAP/TAZ信號傳導(dǎo)的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究,為醫(yī)學(xué)的臨床方法探索新的道路。