靶向細(xì)胞器的DNA納米材料用于疾病治療

李文,周麗,馬祎

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院,江蘇 南京 211198)

隨著對疾病發(fā)展分子機(jī)制的研究,靶向細(xì)胞器進(jìn)行藥物遞送成為了精準(zhǔn)醫(yī)療更深層次的目標(biāo),開發(fā)高效的個(gè)性化藥物可解決耐藥性等臨床問題。DNA納米材料憑借其高度的可編程性等優(yōu)勢在眾多藥物載體中脫穎而出?？偨Y(jié)了DNA納米材料靶向不同亞細(xì)胞器進(jìn)行藥物遞送的應(yīng)用。

1 靶向細(xì)胞核

作為真核細(xì)胞的“中央處理器”,細(xì)胞核在細(xì)胞的代謝、生長和分化中起著重要的作用。細(xì)胞核的功能障礙可導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的不同疾病發(fā)生。靶向、干預(yù)細(xì)胞核可直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,有效治療各種疾病。將藥物傳遞到細(xì)胞核主要有兩種策略:(1)在納米載體表面修飾核靶向配體,如核定位信號肽(NLS)[1];(2)精確控制納米載體的尺寸,使其足夠小以便通過核孔通道進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[2]。其中,NLS在核靶向DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建中起到重要作用。研究表明,無修飾的純DNA納米結(jié)構(gòu)常以小窩蛋白依賴的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞,并自然存在于溶酶體中。通過功能化基團(tuán)修飾后的DNA納米結(jié)構(gòu)更有效逃逸溶酶體,靶向目標(biāo)細(xì)胞器發(fā)揮作用。Fun團(tuán)隊(duì)利用電擊化學(xué)將NLS功能化DNA四面體(TDN),利用熒光信號觀察TDN進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn)。結(jié)果顯示,NLS-TDN定位于細(xì)胞核內(nèi),而沒有NLS的TDN大多局限于細(xì)胞質(zhì)中,這一進(jìn)展為核靶向治療提供強(qiáng)大理論基礎(chǔ)[3]。作為遺傳物質(zhì)的儲存中心,向細(xì)胞核中遞送核酸藥物是疾病治療的有效手段。Ding等設(shè)計(jì)的TDN將反義寡核苷酸沉默原癌基因c-raf和核靶向肽進(jìn)行整合,功能化的DNA四面體可以被A549細(xì)胞內(nèi)化,并協(xié)助反義寡核苷酸向細(xì)胞核傳遞,從而增加下調(diào)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中靶標(biāo)mRNA的機(jī)會[4]。

另外,研究報(bào)道核酸適配體AS1411可主動靶向細(xì)胞核,并特異性結(jié)合核仁蛋白,防止DNA損傷修復(fù),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。在DNA納米材料設(shè)計(jì)時(shí)引入AS1411序列,可實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向給藥。Lin等人比較了AS1411修飾的TDN(Apt-TDNs)與純TDN缺氧條件下在不同細(xì)胞系中的攝取差異及對細(xì)胞生長周期的影響。大量的Apt-TDNs進(jìn)入并積累在MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞核中,而進(jìn)入L929細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)的Apt-TDNs數(shù)量相對較少。Apt-TDNs可以抑制MCF-7細(xì)胞生長,促進(jìn)L929細(xì)胞生長,而TDNs對MCF-7和L929細(xì)胞生長影響無明顯差異[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Apt-TDNs在缺氧條件下可有效地將抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核,少量進(jìn)入正常細(xì)胞,從而增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的作用,減少化療藥物對正常細(xì)胞的副作用。

除了采用納米材料表面修飾核靶向分子外,從納米結(jié)構(gòu)尺寸入手,直接構(gòu)建比核孔更小的納米載體是細(xì)胞核靶向治療的潛在方法?；贒NA自組裝技術(shù)與金屬納米顆粒的結(jié)合,Tan等人開發(fā)了一種可控制納米平臺(稱為納米卡車),可以將抗癌藥物送入細(xì)胞核。這種納米載體由一個(gè)金-銀納米棒(NR)和多個(gè)小的金納米顆粒(NPs)組成。具體來說,通過CS/DAS的雜交,小型載藥NPs(納米藥物)可以自組裝到大型納米棒的側(cè)面。由于納米棒在兩端被細(xì)胞類型特異性的內(nèi)化DNA適配體修飾,它可以作為引導(dǎo)載體,穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。然后,采用NIR激光器(808 nm)照射,通過基于光熱效應(yīng)的CS/DAS雙相變性,觸發(fā)納米藥物的釋放。因此,納米藥物可以進(jìn)入細(xì)胞核,在那里它們可以持續(xù)釋放化療藥物,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。此外,該研究小組還開發(fā)了一種可控大小的DNA納米花(NFs),將化療藥物阿霉素(Dox)遞送到細(xì)胞核。據(jù)報(bào)道,納米花是一種由DNA組分自組裝而成的多功能DNA納米結(jié)構(gòu)。在生物醫(yī)學(xué)中,DNA NFs作為藥物納米載體存在一定的缺陷,導(dǎo)致貨物生物利用度低、治療效果差的局限性。為了應(yīng)對這些限制,研究人員將含有金屬的人工類似物加入到DNA鏈中,以控制DNA納米花的大小和功能,并引入二茂鐵堿來控制納米花的大小從1 000～50 nm。所得到的材料Sgc8-NFs-Fc可以在過氧化氫的存在下,通過Fenton的反應(yīng)進(jìn)行自然降解。實(shí)驗(yàn)證實(shí),Sgc8-NFs-Fc/Dox可被癌細(xì)胞選擇性地吸收。此外,在Fenton反應(yīng)引起的自我降解后,負(fù)載的阿霉素迅速釋放并積累在細(xì)胞核中,誘導(dǎo)細(xì)胞毒性增強(qiáng)[8]。

2 靶向溶酶體

溶酶體作為細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)摹爸修D(zhuǎn)站”,在細(xì)胞自噬、病原體降解等生命活動中起著至關(guān)重要的作用。溶酶體腔內(nèi)微環(huán)境成分的變化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),包括自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病和癌癥。因此,溶酶體靶向治療具有重要意義。研究表明,大多數(shù)DNA納米材料被細(xì)胞攝取后,通過小窩蛋白內(nèi)吞途徑可自然定位于溶酶體。利用這一特性,DNA材料常被用于溶酶體靶向的精準(zhǔn)遞藥。例如,Odom的研究小組提出了一種基于DNA適配體與金納米顆粒結(jié)合的納米結(jié)構(gòu)體系(HApt-AuNS)。HApt-AuNS首先與質(zhì)膜上的HER2相互作用,形成HER2-HApt-AuNS復(fù)合物,并通過內(nèi)吞作用內(nèi)化。隨后,HER2-HApt-AuNS復(fù)合物從核內(nèi)體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w,在溶酶體中HER2被降解并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。另外,溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境為pH值響應(yīng)型DNA納米材料的應(yīng)用提供了天然的有利條件。Liu等人設(shè)計(jì)了一種基于矩形DNA折紙的納米機(jī)器,在預(yù)定位置延伸三個(gè)不同的捕獲鏈。通過DNA雜交,將抗原(多肽)、toll樣受體(TLR)激動劑、雙鏈RNA(dsRNA)和CpG DNA精確地排列在DNA納米裝置上。為了保護(hù)抗原/佐劑免受細(xì)胞外核糖核酸的干擾,在矩形的邊緣添加一條DNA鏈來鎖定它,后者只在特定的pH值范圍內(nèi)解鎖。當(dāng)DNA納米細(xì)胞進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞時(shí),它們會優(yōu)先進(jìn)入溶酶體。在溶酶體的酸性環(huán)境中,打開矩形兩側(cè)的鎖,暴露佐劑和抗原多肽,激活了很強(qiáng)的免疫力,有效消除小鼠的腫瘤[10]。Dong等人利用i-motif設(shè)計(jì)了一個(gè)質(zhì)子驅(qū)動的DNA框架。在溶酶體的酸性環(huán)境下,DNA框架動態(tài)地組裝成聚集體并保留在溶酶體中。同時(shí),質(zhì)子化作用導(dǎo)致了溶酶體酸度和水解酶活性的降低,阻礙了核酸藥物在溶酶體中的降解,提高了基因沉默的效率。這種溶酶體干擾方法可能在保護(hù)核酸藥物方面發(fā)揮突出的重要作用[11]。

然而,溶酶體中存在約60種水解酶,能夠降解多種生物大分子,這對靶向溶酶體的DNA納米材料穩(wěn)定性提出挑戰(zhàn)。Cui等人將半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64錨定在一個(gè)DNA納米裝置上,并通過尾靜脈將該納米裝置注射到小鼠體內(nèi)。DNA納米裝置優(yōu)先內(nèi)化,通過清除受體介導(dǎo)的途徑定位于溶酶體,之后釋放半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64,有效抑制溶酶體中半胱氨酸蛋白酶的活性,提高腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)的抗原呈遞能力。隨后,將DNA納米裝置與抗癌藥物環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合使用,在治療三陰性乳腺癌小鼠中顯示出良好的效果[12]。

總之,基于DNA納米結(jié)構(gòu)易被細(xì)胞內(nèi)吞并定位于溶酶體的特性,實(shí)現(xiàn)了對溶酶體的功能干預(yù)。通過溶酶體中酸性環(huán)境設(shè)計(jì)pH值響應(yīng)性DNA納米器件,實(shí)現(xiàn)了抗腫瘤藥物的控釋釋放,并證明了其強(qiáng)大的腫瘤治療效果。

3 靶向線粒體

線粒體作為細(xì)胞的“動力源”,在三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)中起重要作用。與其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相比,線粒體具有特殊的結(jié)構(gòu)特征。它由線粒體外膜(OMM)、線粒體內(nèi)膜(IMM)、膜間空間(IMS)和基質(zhì)組成。因此,將藥物送入線粒體的最大挑戰(zhàn)之一是如何通過大多數(shù)分子不滲透的雙層線粒體膜[13]。由于線粒體進(jìn)行氧化呼吸過程中存在質(zhì)子泵,在線粒體基質(zhì)中富集大量的負(fù)電荷,親脂性陽離子進(jìn)入細(xì)胞后,它們可以利用線粒體的高膜電位主動靶向線粒體,因此,大多數(shù)被線粒體靶向的DNA納米器件都是通過修飾親脂性陽離子配體來實(shí)現(xiàn)的。如三苯基膦(TPP)含有三個(gè)帶有正電荷的親脂性苯基,DNA納米結(jié)構(gòu)經(jīng)TPP修飾后可選擇性地定位于線粒體。Li等人在DNA四面體的一個(gè)頂點(diǎn)上修飾TPP,并設(shè)計(jì)了一個(gè)富含鳥嘌呤的DNA序列在其他頂點(diǎn)。在細(xì)胞質(zhì)的高濃度鉀離子的觸發(fā)下,多個(gè)四面體框架形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu),允許DNA四面體聚集在線粒體表面,形成一個(gè)陰離子屏障。這種納米裝置顯著抑制了線粒體的有氧呼吸和糖酵解,減少了細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生,抑制了癌細(xì)胞的遷移[14]。

除TPP外,線粒體靶向信號肽(MTS)也是一種常用的線粒體靶向配件。如D-(KLAKLAK)2(KLA)是一種帶正電荷的特異性線粒體靶向序列,它可以破壞線粒體膜并啟動細(xì)胞凋亡。Li的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種KLA功能化的四面體DNA納米結(jié)構(gòu),將蒽環(huán)類抗癌藥物(Dox)送入線粒體。首先,KLA通過疊氮化物和炔基的“點(diǎn)擊化學(xué)”偶聯(lián)到DNA的5’端,形成大小約為15 nm、具有高生物穩(wěn)定性的KLA-TDN偶聯(lián)物。然后,將能夠殺死癌細(xì)胞的阿霉素分子插入TDN中,達(dá)到77%的加載效率。利用KLA偶聯(lián)的TDN,將抗癌藥物轉(zhuǎn)移到乳腺癌細(xì)胞中,并在線粒體中積累,激活線粒體介導(dǎo)的程序性凋亡途徑,并在體外實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的抗癌作用[15]。

4 靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體

靶向蛋白降解已經(jīng)成為治療疾病的重要手段。靶向嵌合體的蛋白水解(PROTACs),利用泛素蛋白酶復(fù)合體系統(tǒng)(UPS)降解蛋白,利用自噬靶向嵌合體(AUTAC)和通過自噬途徑消除選擇性蛋白已作為靶向細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜蛋白的方法[16-17]。然而,在特定膜結(jié)合細(xì)胞器(MBOs)中的過表達(dá)蛋白的降解可能不適用于這些降解工具。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為重要的膜結(jié)合細(xì)胞器,在蛋白質(zhì)的生物合成及修飾環(huán)節(jié)起關(guān)鍵作用。靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行蛋白降解有望從源頭控制疾病發(fā)展,加速疾病治療進(jìn)程。Qian等人開發(fā)了一種DNA納米裝置,利用具有特定配體功能化的DNA納米結(jié)構(gòu)選擇性地捕獲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白,然后將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解。通過該技術(shù),可實(shí)現(xiàn)外源性ERsostird蛋白(ER-eGFP)和內(nèi)源性過表達(dá)分子伴侶(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78)在癌細(xì)胞中高效降解[18]。You等人開發(fā)了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向多肽體(pardaxin,PAR)修飾的陽離子脂質(zhì)體(PAR-Lipo),以提高基因傳遞效率。結(jié)果表明,PAR-Lipos可以通過細(xì)胞內(nèi)的非溶酶體途徑積累到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),誘導(dǎo)DNA有效載荷滯留在細(xì)胞核,促進(jìn)它們進(jìn)入細(xì)胞核依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜之間間隙,提供了在細(xì)胞中有效傳遞基因的替代方法[17]。

高爾基體由許多扁平的囊泡組成,主要負(fù)責(zé)生物合成、分泌和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來的研究表明,高爾基體在細(xì)胞骨架、鈣穩(wěn)態(tài)和有絲分裂的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[19]。Jani等人設(shè)計(jì)了一種名為NOckout的DNA納米裝置,將NO敏感熒光團(tuán)、內(nèi)參考熒光團(tuán)和反式高爾基網(wǎng)絡(luò)(TGN)進(jìn)行組合,利用適配體MUC1的靶向性,NOckout可特異性標(biāo)記TGN管腔[20]。為探尋高爾基體在調(diào)節(jié)心臟功能、傷口愈合或癌癥進(jìn)展等方面的重要作用提供基礎(chǔ)。

綜上所述,當(dāng)DNA納米器件用于靶向其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí),還需要修改相應(yīng)的靶向模塊。然而,目前關(guān)于用于靶向吞噬小體和高爾基體的DNA納米裝置的研究較少。這可能是因?yàn)檫@些細(xì)胞器的定位機(jī)制尚不清楚。另一方面,將現(xiàn)有的靶向基團(tuán)與DNA納米器件結(jié)合起來也可能存在技術(shù)上的困難。進(jìn)一步豐富各種細(xì)胞器靶向的DNA納米器件,將為亞細(xì)胞水平的基礎(chǔ)研究和臨床診斷提供強(qiáng)有力的工具。

5 展望

鑒于DNA納米結(jié)構(gòu)在干細(xì)胞、生物傳感器和抗腫瘤治療領(lǐng)域的許多令人興奮的應(yīng)用,它們有望成為未來的關(guān)鍵納米材料。但其廣泛的應(yīng)用仍存在一些問題,對亞細(xì)胞水平的DNA納米器件的研究主要集中在溶酶體、線粒體和細(xì)胞核上。對其他負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成和加工的核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的研究仍然不夠。此外,目前還沒有針對特定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的給藥系統(tǒng)達(dá)到臨床試驗(yàn)階段。未來對于DNA納米材料的修飾、改造,應(yīng)將使其能夠更有效地靶向高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等其他細(xì)胞器,進(jìn)而促進(jìn)新的靶向配體于藥物傳遞策略的發(fā)展。