親水作用色譜法測定達(dá)原飲中檳榔生物堿的含量

張 瑩，劉 冰，郭 華，張博雄，何宇飛，劉云琪

（襄陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 湖北 襄陽 441021）

達(dá)原飲又名“達(dá)原散”,首次出現(xiàn)在明代瘟疫學(xué)鼻祖吳又可所著的《溫疫論》中,用于治療瘟疫邪伏膜原證,［1］是治療瘟疫的著名方劑。該方劑在我國抗疫歷史中發(fā)揮了較好的治療作用,被國家衛(wèi)生健康委員會推薦為中醫(yī)治療處方,出現(xiàn)在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》第三版及第八版中。［2～6］《溫疫論》中記載達(dá)原飲藥方為：“檳榔二錢、厚樸一錢、草果仁五分、知母一錢、芍藥一錢、黃芩一錢、甘草五分。右用水二盅,煎八分,午后溫服?！逼渲?“榔能消能磨,除伏邪,為疏利之藥,又除嶺南瘴氣；厚樸破戾氣所結(jié)；草果辛烈氣雄；除伏邪蟠踞。三味協(xié)力,直達(dá)其巢穴。使邪氣潰散,速離募原,是以名為達(dá)原散也。”［7］該藥方中,檳榔為君藥,厚樸、草果仁為臣藥,知母、芍藥和黃芩為佐藥,甘草為使藥。對達(dá)原飲藥理研究發(fā)現(xiàn),其中檳榔、厚樸、草果、黃芩和白芍具有抗氧化的作用,通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制炎性因子產(chǎn)生,［8～10］達(dá)到治療新型冠狀病毒感染的作用。目前,臨床上,達(dá)原飲主要以湯劑的形式應(yīng)用。中藥湯劑的制備是一個多環(huán)節(jié)的系統(tǒng)工程,中藥飲片的產(chǎn)地、種植、采集、加工炮制、煎煮等因素均能影響湯劑的質(zhì)量,湯劑質(zhì)量對中醫(yī)臨床而言至關(guān)重要,直接影響臨床治療的效果。因此,確保中藥湯劑的質(zhì)量成為中醫(yī)臨床治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前,對達(dá)原飲有效成分質(zhì)量控制的研究較少,現(xiàn)有的研究也主要集中在臣藥和佐藥的有效成分厚樸酚、和厚樸酚、草果黃酮、芒果苷、芍藥苷和黃芩苷上。［11～13］達(dá)原飲藥方中的君藥有效成分檳榔生物堿具有良好的抗氧化作用,［8］由于其極性較強(qiáng),無法在普通C18色譜柱上保留而研究甚少。對于檳榔中檳榔生物堿的含量測定,《中國藥典》（2020版）和一些文獻(xiàn)報(bào)道［14～15］中采用強(qiáng)陽離子交換鍵合硅膠為填充劑（SCX-強(qiáng)陽離子交換樹脂柱）。這一檢測方法限制了達(dá)原飲中所有有效成分一次檢出,增加了質(zhì)量控制的成本和時間。本文采用親水作用色譜法（HILIC）檢測達(dá)原飲中檳榔生物堿的含量。該方法簡單快速,穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,為達(dá)原飲中有效成分的質(zhì)量控制提供了有效的理論支撐和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

中藥飲片：檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草均購于中藥房（襄陽普天獨(dú)活大藥房）；達(dá)原飲中的檳榔生物堿主要有四種：去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿,其中檳榔堿和去甲檳榔次堿對照品選擇其氫溴酸鹽和鹽酸鹽。對照品：去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿、去甲檳榔次堿鹽酸鹽和檳榔次堿,純度均大于98%,購于成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純,水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）,其他試劑純度均為分析純。

液相色譜儀：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）、中藥自動煎煮壺（九陽股份有限公司）、TGL-16M臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、BSA224S型分析天平（德國賽多利斯）。

（二）方法

1.供試品溶液的配制。查閱文獻(xiàn),明清時期的一錢相當(dāng)于3.73 g,［16］水一盅相當(dāng)于200 mL純水。根據(jù)《溫疫論》中的達(dá)原飲藥方,確定達(dá)原飲湯劑的煎煮工藝為：稱取檳榔7.46 g,厚樸3.73 g、草果仁1.87 g、知母3.73 g、芍藥3.73 g、黃芩3.73 g和甘草1.87 g置于自動煎藥壺中,量取300 mL純水浸泡60 min,進(jìn)行頭煎。先用武火煮沸,后以文火煎煮30 min,將藥汁倒出后進(jìn)行二煎,加入純水100 mL,先用武火煮沸,后以文火煎煮30 min,收集合并兩次煎煮藥液,用真空過濾器過濾、冷卻,定容至200 mL,過0.22 μm濾膜作為供試品溶液。

2. 對照品溶液的配制。分別精密稱取檳榔生物堿對照品：去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿、去甲檳榔次堿鹽酸鹽和檳榔次堿各5.00 mg,置于10 mL容量瓶中,用純甲醇定容至刻度,搖勻,過0.22 μm濾膜作為檳榔生物堿各單獨(dú)對照品溶液。再分別精密量取檳榔生物堿各單獨(dú)對照品溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,用純甲醇定容至刻度,搖勻,過0.22 μm濾膜作為檳榔生物堿混合對照品溶液。

3.色譜條件。色譜柱：Agela Venusil HILIC 丙基酰胺鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm,5μm,天津博納艾杰爾科技有限公司）；流動相：乙腈：0.1%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）=70：30；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL?min-1。

二、結(jié)果與討論

（一）專屬性考察

檳榔生物堿混合對照品（a）及達(dá)原飲供試品色譜圖（b）詳見圖1。由圖可見,4種檳榔生物堿分別有與其對照品保留時間一致的特征色譜峰,各對照品之間完全基線分離,分離度良好,峰型對稱,并且供試品中目標(biāo)成分與雜質(zhì)峰之間的分離度良好,峰型對稱。結(jié)果表明,供試品中其它組分對檳榔生物堿的測定無干擾,本方法專屬性良好。

圖1 檳榔生物堿混合對照品（a）和達(dá)原飲供試品溶液（b）的HPLC圖譜

（二）分析方法學(xué)考察

1. 線性關(guān)系考察。分別精密量取前述“對照品溶液的配制”制備的檳榔生物堿混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL置于六個10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列檳榔生物堿混合對照品溶液,按照前述“色譜條件”進(jìn)樣,以各檳榔生物堿的濃度為X,峰面積為Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各檳榔生物堿的回歸方程和相關(guān)系數(shù),詳見表1。在濃度范圍內(nèi),4種檳榔生物堿的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均在0.999 5以上。

表1 檳榔生物堿的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2. 檢出限與定量限考察。將前述“對照品溶液的配制”制備的檳榔生物堿混合對照品母液用純甲醇逐級稀釋,按照前述“色譜條件”進(jìn)樣檢測,記錄峰面積,根據(jù)上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。當(dāng)信噪比（S/N）為3：1時,此條件下混合對照品的濃度為本方法的檢出限；當(dāng)信噪比（S/N）為10：1時,此條件下混合對照品的濃度為本方法的定量限。4種檳榔生物堿的檢出限和定量限見表1。

3.精密度考察。取檳榔生物堿混合對照品溶液,按照前述“色譜條件”連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄每次各生物堿的峰面積,對其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值進(jìn)行計(jì)算,經(jīng)過計(jì)算得到去甲檳榔堿RSD值為1.52%,檳榔堿RSD值為1.62%,去甲檳榔次堿RSD值為1.59%,檳榔次堿RSD值為1.53%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。

4. 重復(fù)性考察。取同一批中藥飲片,按照前述“供試品溶液的配制”分別制備6批供試品溶液,按照前述“色譜條件”分別進(jìn)樣檢測,記錄各檳榔生物堿的峰面積和保留時間,分別計(jì)算峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值,去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的峰面積及保留時間的RSD 值分別為1.01%/0.78%、0.99%/0.89%、0.98%/0.98%和1.03%/0.76%。結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好。

5.穩(wěn)定性考察。取前述“供試品溶液的配制”制備的供試品一份,在室溫分別下放置0,4,8,12,16,20,24 h,按照前述“色譜條件”分別進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖,計(jì)算各檳榔生物堿的峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值,通過計(jì)算去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的峰面積及保留時間的RSD 值分別為1.12%/0.89%、1.21%/0.87%、1.15%/0.86%和1.04%/0.98%。結(jié)果表明,該方法穩(wěn)定性良好。

6. 加標(biāo)回收率試驗(yàn)。精密量取前述“供試品溶液的配制”制備的達(dá)原飲藥液供試品5 mL,共36份。每9份為一組,每組按照檳榔生物堿含量的80%、100%、120%分別加入低、中、高3個水平的各檳榔生物堿單獨(dú)對照品,每個水平3份平行樣品。按照前述“色譜條件”分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,各檳榔生物堿的加標(biāo)回收率結(jié)果詳見表2。去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的平均回收率分別為102.05%（RSD=1.39%）、100.80%（RSD=1.39%）、102.87%（RSD=1.39%）和98.77%（RSD=1.39%）,結(jié)果表明本方法加標(biāo)回收率良好。

表2 達(dá)原飲中4種檳榔生物堿的加標(biāo)回收率（n=9）

7. 樣品含量測定。取前述“供試品溶液的配制”制備的達(dá)原飲藥液,按照前述“色譜條件”進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖,根據(jù)前述“線性關(guān)系考察”所做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算達(dá)原飲中各檳榔生物堿的含量。通過檢測計(jì)算,達(dá)原飲藥液中去甲檳榔堿含量為0.0209 mg?mL-1,檳榔堿含量為0.0679 mg?mL-1,去甲檳榔次堿含量為0.0545 mg?mL-1,檳榔次堿含量為0.0269 mg?mL-1。

三、結(jié)論

經(jīng)典抗疫名方達(dá)原飲由檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩和甘草7味藥材組成,其中檳榔為君藥,其主要活性為檳榔生物堿。由于檳榔生物堿為小分子生物堿,極性較大,在傳統(tǒng)C18色譜柱上無法保留,因而多采用強(qiáng)陽離子交換柱SCX進(jìn)行檢測。這就限制了達(dá)原飲中所有活性成分同時檢出,增加了達(dá)原飲藥液質(zhì)量控制的成本。本文首次建立了親水作用色譜法測定達(dá)原飲中檳榔生物堿含量。結(jié)果表明,其專屬性較好,在24.63～300.60μg?mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,穩(wěn)定性和重復(fù)性良好,準(zhǔn)確度較高。該方法為達(dá)原飲藥液的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為達(dá)原飲中有效成分的一次性測定提供了新思路。