4 種石斛屬花朵揮發(fā)性成分GC-MS 分析

張鈺瑩 ，許 鳳 ，曹 樺 ，趙瑞晶 ，李 涵 ，李東徽

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205）

石斛屬（Dendrobium）為蘭科植物的第二大屬，與卡特蘭屬（Cattleya）、蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）和文心蘭屬（Oncidium）并稱為世界四大觀賞洋蘭［1]，在全世界約有1 500 個原生種［2]，我國有81 個種，云南省有58 個種，居全國第一［3]?；ㄏ阕鳛橐环N重要的觀賞性狀，不僅可以有效增強(qiáng)植物的觀賞特性，還可吸引昆蟲，保證繁殖的成功，其正在成為一種重要的觀賞性評價指標(biāo)［4]。

捕獲芳香化合物的方法不同獲得的揮發(fā)性物質(zhì)存在一定的差異性，目前獲取花朵中揮發(fā)性物質(zhì)的方法包括水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、同時蒸餾萃取法、固相微萃取法等［5]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，通過高溫和不同pH 條件萃取處理可能會改變花中原始揮發(fā)性成分［6]，固相微萃取作為一種有效的靜態(tài)頂空采樣方法，可富集和分離其他一些分析方法可能無法檢測到的低閾值香氣成分，能夠通過快速簡單和無溶劑的方式產(chǎn)生高濃度的提取物，減少植物化合物的分解，最大限度地降低了酶活性，減少成分的損失，已被廣泛用于檢測植物和食品中揮發(fā)性成分［7-8]。

植物花香成分及其生物合成過程極其復(fù)雜，不同品種石斛花揮發(fā)性成分存在顯著差異。FLATH等[9]和JULSRIGIVAL 等[10]從檀香石斛中鑒別出25 種揮發(fā)性成分，主要揮發(fā)性成分為甲基酮和2-烷基乙酸酯，麝香石斛花的主要芳香化合物為2-十五烷酮。李崇暉等［11]研究發(fā)現(xiàn)，鼓槌石斛與細(xì)葉石斛的主要香味物質(zhì)均為3-蒈烯，羅河石斛的主要香味組分為水楊酸甲酯，2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-雙環(huán)[5.2.0]壬烷被鑒定為密花石斛的主要揮發(fā)性成分。夏科等［12]研究發(fā)現(xiàn)，萜烯類為鼓槌石斛、細(xì)葉石斛、流蘇石斛、翅萼石斛、翅梗石斛和春石斛的主要賦香成分。王元成等［13-14]研究發(fā)現(xiàn)，腫節(jié)石斛、棒節(jié)石斛和翅梗石斛的主要香氣組分以烯類化合物為主，玫瑰石斛的主要香氣成分以烯類和烷類化合物為主，報春石斛揮發(fā)性成分以酯類為主，主要成分為醋酸辛酯，細(xì)葉石斛的特征香氣成分為羅勒烯、β-石竹烯和芳樟醇。仇碩等[15]研究發(fā)現(xiàn)，烯類物質(zhì)是影響細(xì)莖石斛花香的重要化合物，主要揮發(fā)性成分為(1R)-(+)-α 蒎烯。丁靈等[16]測定了秋石斛5 個具香氣的品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 種具香氣的秋石斛花朵所含揮發(fā)性成分絕大部分都是萜烯類，主要賦香成分為3-蒈烯、芳樟醇、α-可巴烯和α-法尼烯。

本研究選取云南石斛屬的4 種石斛，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù)（SPME-GCMS）進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，比較4 種石斛揮發(fā)性成分的共性和特異性，確定影響其氣味的主要揮發(fā)性成分，篩選有價值的香花型石斛資源，為香花型石斛育種提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試4 種帶香味的石斛屬盛花期花朵，包括報春石斛（Dendrobium primulinum）、美花石斛（Dendrobium loddigesii）、麝香石斛（Dendrobium parishii）和紅龍石斛（Dendrobium.Red Dragon）（圖1），均采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所澄江蘭花資源圃。

圖1 4 種石斛盛花期花部特征Fig.1 Floral characteristics diagram of four Dendrobium species in full flowering stage

1.2 儀器

手動固相微萃取進(jìn)樣器（美國Supelco 公司），65 μm PDMS/DVB 萃取頭（美國Supelco 公司），7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜儀GC-MS（美國Agilent 公司），BG25 干式恒溫器（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS檢測 將SPME萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃老化處理52 min，選擇生長和開花正常的植株作為采集對象，盛花期花朵大花采2 朵，小花采3 朵，稱質(zhì)量，整朵放入50 mL 廣口錐形瓶底部，重復(fù)3 次，加入2 μL 0.1%（4.325 μg/μL）癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，將萃取頭插入錐形瓶中下部，瓶口用封口膜密封，35 ℃恒溫萃取30 min。萃取完成后，取出萃取頭，插入GC-MS 進(jìn)樣口，解析30 s 后，進(jìn)樣分析。

色譜條件：色譜柱為HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為40 ℃，接著再以3 ℃/min 升溫至80 ℃，繼續(xù)以5 ℃/min 升溫至250 ℃，最后再以250 ℃維持5 min。載氣為99.99%的高純度氦氣，隔墊吹掃流量為3.00 mL/min；總流量為9.00 mL/min；柱前壓50 kPa，分流比10∶1；3 min 溶劑延遲 。

質(zhì)譜條件：采用EI 離子源，MS 離子源溫度230 ℃，MS 四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，電子能量70 eV ，數(shù)據(jù)采集模式：標(biāo)準(zhǔn)掃描，質(zhì)量掃描范圍為m/z35～450；柱壓50 kPa。

1.3.2 花香成分定性與定量分析 按照GC-MS總離子流色譜圖，分析各個峰所對應(yīng)的質(zhì)譜圖，將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用MSD ChemStation Data Analysis F.01.03 版本軟件，與NIST14.L 所給出的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖庫進(jìn)行比對，得出揮發(fā)性化合物組分種類，根據(jù)離子流峰面積歸一化法，計算總揮發(fā)物中各組分的相對含量。

以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)揮發(fā)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積對比，計算組分含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用GraphPad 軟件繪制4 種石斛成分差異分析柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同石斛盛花期花朵揮發(fā)性成分比較

由圖2 可知，采用GC-MS 方法，對4 種香花石斛盛花期花朵的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析測定，得到揮發(fā)性物質(zhì)的離子流峰圖，共鑒定出72 種化合物，分別占各總揮發(fā)性成分的98.14%（報春石斛）、99.47%（美花石斛）、99.02%（麝香石斛）、99.70%（紅龍石斛）。

圖2 4 種石斛盛花期花朵揮發(fā)性成分的GC-MS 總離子流Fig.2 GC-MS total ion flow diagram of volatile components in flowers of four Dendrobium species in full flowering stage

從表1 可以看出，石斛的種類不同，其揮發(fā)性成分亦不相同，其揮發(fā)性成分總含量從大到小依次為美花石斛＞麝香石斛＞紅龍石斛＞報春石斛，美花石斛相對總含量高達(dá)136.07 μg/g，是麝香石斛的2.5 倍、紅龍石斛的7.6 倍、報春石斛的11.4 倍。

表1 4 種石斛屬植物花朵的主要揮發(fā)性成分及其含量變化Tab.1 Main volatile components and content changes of flowers of four of Dendrobium species

從表1 可以看出，報春石斛中共鑒定出40 種化合物，其中，正丙基環(huán)戊烷的相對含量最高（7.65 μg/g），占總含量的64.23%，其次為乙酸芐酯（1.68 μg/g），占總含量的14.11%，其余主要成分包括乙酸葉醇酯、水楊酸異辛酯、乙酸正己酯、苯乙酮等。美花石斛中共鑒定出20 種化合物，其中，環(huán)辛烷的相對含量最高（124.52 μg/g），占總含量的91.51%，其余主要成分包括（+）-3-蒈烯，乙酸癸酯等。麝香石斛共鑒定出8 種化合物，其中，2-十五烷酮的相對含量最高（51.47 μg/g），占總含量的94.89%，其余主要成分包括2-十三烷酮、十七烷酮等。紅龍石斛中共鑒定出20 種化合物，其中，2-十五烷酮的相對含量最高（11.77 μg/g），占總含量的65.98%，其余主要成分包括2-十三烷酮、1,7-十二碳二烯、油醇等。

4 種石斛的主要賦香成分存在明顯的差異，如圖3 所示，報春石斛的主要賦香物質(zhì)為乙酸芐酯、乙酸葉醇酯等；美花石斛的主要賦香成分為（+）-3-蒈烯、苯甲酸辛酯等；麝香石斛和紅龍石斛的主要賦香成分大致相同，均含有2-十五烷酮和2-十三烷酮。

圖3 4 種石斛主要賦香成分Fig.3 Main fragrance-contributing components of four Dendrobium species

2.2 4 種石斛差異成分分析

4 種石斛盛花期花朵中未見共有的揮發(fā)性成分，其中，苯甲酸辛酯、水楊酸異辛酯除在紅龍石斛中未發(fā)現(xiàn)外，在其余3 種石斛中均有少量存在；僅2-十五烷酮、2-十三烷酮、六甲基環(huán)三硅氧烷、（+）-3-蒈烯、乙酸癸酯等少量物質(zhì)存在于2 種石斛中，其中，2-十五烷酮、2-十三烷酮為麝香石斛和紅龍石斛的主要及次要揮發(fā)性成分，麝香石斛中2-十五烷酮的相對含量為紅龍石斛的4.4 倍，2-十三烷酮在2 種石斛中的相對含量大致相同，分別是麝香石斛1.69 μg/g，紅龍石斛1.79 μg/g（圖4）。

圖4 4 種石斛差異成分分析Fig.4 Analysis of differential components of four Dendrobium species

在4 種石斛中，僅在報春石斛含有的揮發(fā)性成分有30 種，其中只有正丙基環(huán)戊烷和乙酸芐酯的相對含量在1 μg/g 以上；僅在美花石斛含有的揮發(fā)性成分有11 種，其中只有環(huán)辛烷、丁酸辛酯、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯的相對含量在1 μg/g以上；僅在麝香石斛含有的揮發(fā)性成分只有1 種，相對含量在1 μg/g 以下；僅在紅龍石斛含有的揮發(fā)性成分有16 種，其中只有1，7-十二碳二烯相對含量達(dá)到1 μg/g 以上（圖4）。

2.3 4 種石斛盛花期花朵揮發(fā)性成分分析

4 種石斛盛花期花朵共鑒定出72 種化合物，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為9 種類型（圖5）。其中在報春石斛和美花石斛中含量最高的均為烷類物質(zhì)，分別占總化合物成分的67.51%和91.51%，其次為酯類化合物，分別占化合物總量的23.51%和4.70%；麝香石斛和紅龍石斛中含量最高的均為酮類化合物，分別占化合物總量的99.48%和80.38%。酚類物質(zhì)僅丁香酚、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚2 種，酸類物質(zhì)僅香葉酸1 種，均為美花石斛特有物質(zhì)，3 種物質(zhì)的總含量占美花石斛揮發(fā)物總含量的0.31%。醛類物質(zhì)僅存在于報春石斛和紅龍石斛中，含量均較低。其他類物質(zhì)只在報春石斛和麝香石斛中發(fā)現(xiàn)，其含量均低于0.1 μg/g。

3 討論

3.1 不同石斛盛花期花朵揮發(fā)性成分及含量分析

有研究發(fā)現(xiàn)，不同的品種、培養(yǎng)方式、產(chǎn)地、季節(jié)變化、環(huán)境等因素均會對植物的揮發(fā)性成分產(chǎn)生影響[17-21]。顏沛沛等[22]采用靜態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測得報春石斛花含量最多的為酯類，主要香味成分為醋酸辛酯，其次為乙酸乙酯。王元成等[13]采用固相微萃取技術(shù)從新鮮完整的報春石斛盛花期花朵中共測得61 種香味成分，以酯類和醇類化合物為主，其中對其香味影響最大的物質(zhì)為醋酸辛酯和正辛醇。袁明焱等[23]采用頂空固相微萃取法從美花石斛中檢測出21 種香氣成分，發(fā)現(xiàn)乙酸-2-乙基己酯的相對含量最高，為主要香味物質(zhì)，其次要成分1，3，6-辛三烯對花的香氣有一定的影響。曹樺等[24]采用固相微萃取法從美花石斛中測得20 種香氣成分，以酯類化合物為主，主要揮發(fā)性成分為乙酸異辛酯。本研究采用頂空固相微萃取和GC-MS 技術(shù)測出報春石斛以正丙基環(huán)戊烷為主要揮發(fā)性成分，美花石斛以環(huán)辛烷為主要揮發(fā)性成分，麝香石斛和紅龍石斛的主要及次要揮發(fā)性成分均為2-十五烷酮和2-十三烷酮，與前人研究存在差異，可能與4 種石斛生長環(huán)境不同有關(guān)。

3.2 不同石斛盛花期花朵賦香成分分析

不同石斛品種揮發(fā)性成分存在一定的差異性，花朵的香味除了受其揮發(fā)物含量的影響外，還取決于其香氣成分的閾值[25]。根據(jù)相關(guān)報道，醛類物質(zhì)由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生，一般閾值較低，對氣味的影響較大，通常表現(xiàn)為果香、青香或脂香；醇類物質(zhì)香味閾值一般較高，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)很小，但存在一些不飽和醇類的香味閾值會較低，對風(fēng)味影響較大，主要表現(xiàn)為酒香、清香或者類似于金屬的氣味；酯類和萜烯類的閾值都比較低[26]。本研究中報春石斛氣味清香，美花石斛花香淡雅，麝香石斛和紅龍石斛香氣濃郁。正丙基環(huán)戊烷為報春石斛的主要揮發(fā)性成分，但烷類物質(zhì)一般無氣味或氣味微弱，所以，一般可忽略其香味，乙酸芐酯作為其次要成分有蜂蜜般的甜味并稍帶花香和果香[27]，可以認(rèn)為是報春石斛的主要賦香成分，此外，乙酸葉醇酯具有明顯的青草、青葉和強(qiáng)烈的香蕉氣息[28]，對報春石斛的花香有一定的貢獻(xiàn)。環(huán)辛烷作為美花石斛的主要揮發(fā)性成分，有一定的樟腦氣味，（+）-3-蒈烯具有香甜的氣味[29]，對美花石斛的花香貢獻(xiàn)最大，另外，乙酸癸酯具有橙子和玫瑰香味以及菠蘿的甜味[30]，乙酸辛酯水果香型對美花石斛的花香有一定的貢獻(xiàn)。2-十五烷酮為麝香石斛和紅龍石斛花朵的主要賦香成分，同時也是重唇石斛的主要揮發(fā)性成分[31]，2-十三烷酮作為二者的次要揮發(fā)性成分，具有椰子香，對花香有一定的貢獻(xiàn)。本研究對云南省4 種石斛花朵的香味物質(zhì)進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，不同石斛屬植物花朵的揮發(fā)性成分存在著明顯的差異，可為香花型石斛蘭育種提供一定的參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，4 種石斛盛花期花朵共鑒定獲得72 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要分為烷類、酮類、酯類、烯類、醇類、醛類、酚類、酸類和其他類等。報春石斛的賦香成分主要包括乙酸芐酯、乙酸葉醇酯；美花石斛的賦香成分主要包括（+）-3-蒈烯、苯甲酸辛酯、丁酸辛酯、乙酸癸酯；麝香石斛的賦香成分主要包括2-十五烷酮、2-十三烷酮、十七烷酮；紅龍石斛的賦香成分主要包括2-十五烷酮、2-十三烷酮、1，7-十二碳二烯。