連翹綠茶不同加工階段提取物的抑菌及抗氧化活性分析

馬海會，邢嘉倩，吳永娜，牛顏冰，王德富

（山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801）

連翹（Forsythia suspense（Thunb.） Vahl）為木犀科（Oleaceae）連翹屬（Forsythia）植物，在我國山西、陜西、河南、河北等地廣泛分布[1]，在韓國、日本和一些歐洲國家也有零星分布[2]。連翹果實在我國的開發(fā)利用較為廣泛，對風熱感冒、高熱煩渴、炎癥等有很好的治療效果。研究表明，連翹果實的主要生物活性成分有苯乙醇苷類、黃酮類和木脂素類等[3-5]，具有抗病毒、抗炎、抗癌、保肝、利尿等功能[6-7]。新型冠狀病毒肺炎嚴重威脅人類的生命健康，連翹作為雙黃連口服液和蓮花清瘟顆粒的主要活性成分，在預防治療新冠肺炎中發(fā)揮了重要作用[8-9]。

連翹葉是植物連翹的葉片，具有清熱解毒、消癰散結的功效[10]，連翹葉具有和連翹果實相同的功能成分，并且一些活性成分甚至高于連翹果實，如連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁等[11]，具有抗菌、抗炎、抗衰老等藥理作用[12-15]。2017 年國家正式批準連翹葉列入食品范疇，這對連翹葉資源在食品領域的綜合開發(fā)和利用具有重大意義。WANG 等[16]對綠茶加工過程中非揮發(fā)性和揮發(fā)性代謝物質的動態(tài)變化進行了分析，結果表明，代謝物在殺青過程中發(fā)生了顯著變化；原江鋒等[17]對連翹綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖的化學成分進行了比較分析，結果表明，連翹綠茶的茶多酚、氨基酸、總黃酮、總木脂素和總三萜酸含量均較高；李曦等[18]對連翹綠茶和連翹紅茶的營養(yǎng)成分進行了比較分析，結果表明，連翹綠茶的水浸出物、維生素C、總多酚、黃酮、連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁含量均顯著高于連翹紅茶；WANG 等[19]對連翹葉茶的化學成分及毒理進行了分析，發(fā)現連翹葉茶具有無毒性或低毒性。而截至目前，對連翹綠茶不同加工過程提取物的抑菌及抗氧化活性的研究鮮有報道。

本試驗以連翹葉不同加工過程所得產物的提取物為研究對象，以常見7 種食源性細菌為供試菌株進行抑菌試驗，并以不同樣品提取物對DPPH、ABTS+自由基的清除率及鐵離子還原（Ferric reducing ability of plasma，FRAP）能力來判斷其抗氧化活性，進而明確連翹綠茶的抑菌和抗氧化能力，為連翹綠茶加工工藝的進一步優(yōu)化提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試連翹葉采集于山西省澤州縣川底鄉(xiāng)山西澤翹科技股份有限公司連翹茶標準示范基地（東經112°44′54″，北緯35°30′51″）。

供試菌株：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）（CICC：10389）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）（CICC：21261）、腸沙門氏菌腸亞種（Salmonella entericasubsp.enterica）（CICC：21513）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）（CICC：21534）、阪崎氏年輕泰坦桿菌（Cronobacter sakazakii）（CICC：21544）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC：21600）和痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）（CICC：23829）均購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

試驗藥劑：DPPH、ABTS 和2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪（TPTZ）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取物的制備 連翹綠茶加工制備主要包括鮮葉攤放、殺青、捻揉及干燥4 個部分。首先將新鮮連翹葉均勻攤放12 h，厚度為2～3 cm，空氣濕度為55%，使用水分測定儀測定水分含量，含水量達到70%左右時停止攤放；然后將其放入殺青鍋中，200 ℃快速翻炒4 min，連翹葉變軟，顏色由鮮綠色變成暗綠色，得到殺青葉；把殺青葉放入捻揉機遵循“輕—重—輕”原則進行捻揉，殺青葉變成卷條狀，得到捻揉葉；最后將捻揉葉置于110 ℃環(huán)境下干燥，直至茶葉含水量降至10%左右停止，得到干燥茶葉。

將連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉及干燥茶葉置于恒溫箱50 ℃烘干，后用粉碎機粉碎。準確稱取植物樣品25 g，以70%乙醇溶液為溶劑按照1∶20（m/V）比例混合倒入500 mL 燒杯中，超聲提取3 h，真空泵結合布氏漏斗抽濾收集濾液，將濾液倒入旋蒸瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀（50 ℃、0.8 MPa）中蒸發(fā)得到深棕色膏狀物，用無菌蒸餾水將其溶解，配制成質量濃度為1.0 g/mL 的母液，密封置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測定

1.2.2.1 抑菌圈測定 利用二倍稀釋法[20]，對不同連翹樣品提取物進行稀釋，配制成質量濃度分別為1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/mL 的樣品提取液，陽性對照（CK1）為0.005 g/mL 的氯霉素，水為空白對照（CK2）。用打孔器將濾紙片打成直徑為6 mm 的小紙片，高壓蒸汽滅菌后烘干，備用。對供試菌株進行活化，使其在600 nm 波長處的吸光度達到0.60±0.02。稱取3.5 g牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基于100 mL 錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水進行滅菌。待滅菌后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時，加入1 mL 菌懸液混合均勻，倒入培養(yǎng)皿中，得到含菌培養(yǎng)基。用無菌鑷子夾取浸潤不同質量濃度的連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物濾紙片輕放于含菌培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。每個處理重復3 次。

1.2.2.2 最小抑菌濃度測定 最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）指藥物和一定濃度的菌液相互作用后，能抑制可見菌生長的最低濃度[21]。利用二倍稀釋法[20]對不同連翹樣品提取物進行倍比稀釋，然后加入等體積液體培養(yǎng)基，最后加入活化好的菌懸液100 μL 作為試驗組，以僅含菌懸液的液體培養(yǎng)基作為陽性對照組，不含菌懸液的液體培養(yǎng)基作為陰性對照組，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h 后觀察菌體生長情況。每個處理重復3 次。

1.2.2.3 最小殺菌濃度測定 最小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC）是在MIC 的基礎上，吸取100 μL 含連翹提取物的菌懸液涂布于固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察可見菌的數量≤5 個，即認為該濃度為MBC。每個處理重復3 次。

1.2.3 抗氧化活性的測定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除率 參考XU 等[22]的方法，在96 孔板中依次加入質量濃度為0.4 mg/mL的DPPH 工作液100 μL 和質量濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL 的樣品溶液100 μL，混勻，室溫靜置30 min，空白組用水代替樣品溶液，對照組用水代替DPPH 溶液，于517 nm 波長處測量吸光度，分別記為A樣、A空和A對，以維生素C 為陽性對照。每個處理重復3 組，取其平均值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除率 參考XU 等[22]的方法，將7 mmol/L 的ABTS 儲存液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等比例混合，置于黑暗中反應12～16 h，后用0.02 mol/L 的醋酸鹽緩沖液稀釋至734 nm 波長下吸光度為0.700±0.002，制成ABTS工作液，在96 孔板中依次加入200 μL ABTS 工作液和10 μL 質量濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL 的樣品溶液。對照組用水代替樣品溶液，30 ℃下反應20 min，室溫下測定734 nm 波長處的吸光度，分別記為A0和A1，以維生素C 為陽性對照。每個處理重復3 組，取其平均值。

1.2.3.3 FRAP 法測定總抗氧化能力 參考BENZIE 等[23]的方法，將50 mL 0.3 mol/L 的醋酸鹽緩沖液、5 mL 10 mmol/L TPTZ 工作液和5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液混合搖勻，制成FRAP 工作液，避光保存?zhèn)溆?。?6 孔板中依次加入20 μL 質量濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL 的樣品溶液與180 μL FRAP 工作液混合作為樣品組，加入20 μL 水與180 μL FRAP 工作液混合均勻作為空白對照組，于37 ℃靜置10 min 后，在593 nm波長處測定其吸光度，分別記為Am和An。每個處理重復3 組，結果取平均值。

1.3 數據分析

利用Excel 軟件對數據進行記錄并進行平均值和標準差分析，利用SPSS 21.0 對數據進行方差分析檢驗數據差異顯著性（P＜0.05），利用GraphPad Prism 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同連翹樣品提取物的抑菌活性分析

連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物對7 種供試細菌的抑制活性如圖1 所示。

由圖1 可知，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物均對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈較為敏感，對大腸埃希氏菌、腸沙門氏菌腸亞種、福氏志賀氏菌、阪崎氏年輕泰坦桿菌和痢疾志賀氏菌則不敏感，這說明連翹綠茶不同加工過程提取物對革蘭氏陽性菌的抑制效果強于革蘭氏陰性菌。

2.2 不同連翹樣品提取物對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性分析

通過對抑菌圈直徑進行測量分析不同提取物的抑菌效果，結果如表1 所示，連翹鮮葉、殺青葉和干燥茶葉提取物對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果隨著質量濃度的升高而不斷增強。干燥茶葉的抑菌效果最明顯，當質量濃度為0.031 25 g/mL 時已表現出抑菌效果；當質量濃度升高到0.125 g/mL 時，干燥茶葉的抑菌圈直徑為8.3 mm，除干燥茶葉外，鮮葉和殺青葉提取物也表現出抑菌效果，抑菌圈直徑分別為7.3、6.9 mm，但干燥茶葉提取物的抑菌效果明顯高于鮮葉和殺青葉提取物（P＜0.05）；當提取物質量濃度升到1.0 g/mL 時，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物的抑菌圈直徑分別為11.1、10.5、9.0、11.2 mm，鮮葉和干燥茶葉提取物的抑菌效果明顯較高（P＜0.05）。

2.3 不同連翹樣品提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性分析

由表2 可知，連翹鮮葉和干燥茶葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著質量濃度的升高而不斷變大。干燥茶葉的抑菌效果最強，當質量濃度為0.031 25 g/mL 時就表現出抑制效果，抑菌圈直徑為6.9 mm；當質量濃度升到0.25 g/mL 時，鮮葉提取物也表現出抑制效果，抑菌圈直徑為8.6 mm，干燥茶葉的抑菌圈直徑為8.7 mm，二者的抑制效果無明顯差異；當質量濃度增加到1.0 g/mL 時，鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉均表現出抑菌效果，抑菌圈直徑分別為10.3、9.3、9.4、11.3 mm，干燥茶葉的抑菌效果最強（P＜0.05）。

表2 不同樣品提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑比較Tab.2 Comparison of bacterial inhibition zone diameter of different sample extracts against Staphylococcus aureus

表3 不同樣品提取物對不同細菌抑制活性的方差分析Tab.3 Analysis of variance of inhibitory activity of different sample extracts against different bacteria

連翹綠茶不同加工過程提取物在質量濃度為1.0 g/mL 時，對供試細菌抑制活性的方差分析如表3 所示，不同樣品提取物對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性具有明顯差異（P＜0.05）。

2.4 不同連翹樣品提取物MIC 和MBC 的確定

在不同連翹樣品提取物對7 種供試細菌抑菌活性分析的基礎上，測定提取物對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 和MBC，結果如表4 所示。

表4 不同樣品提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度結果Tab.4 Results of MIC and MBC of different sample extracts

從表4 可以看出，連翹鮮葉和干燥茶葉提取物對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 最小，均為125 mg/mL；鮮葉和干燥茶葉提取物對蠟樣芽孢桿菌殺菌效果一致，MBC 均為250 mg/mL，鮮葉和干燥茶葉提取物對金黃色葡萄球菌殺菌效果也一致，MBC 均為500 mg/mL，而殺青葉和捻揉葉提取物在500 mg/mL 的質量濃度范圍內對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都不具有殺菌作用。

2.5 不同連翹樣品提取物對DPPH 自由基清除能力的影響

以維生素C 為陽性對照，不同連翹樣品提取物對DPPH 自由基的清除率結果如圖2 所示，在0.312 5 ～5.0 mg/mL 的質量濃度范圍內，連翹樣品提取物對DPPH 自由基都有不同程度的清除效果，并且高質量濃度的清除效果要大于低質量濃度。當質量濃度為2.5 mg/mL 時，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉對DPPH 自由基的清除能力分別為97.3%、98.2%、97.7%和94.8%，清除率從大到小排序為：殺青葉＞捻揉葉＞鮮葉＞干燥茶葉，鮮葉、殺青葉和捻揉葉的DPPH 自由基清除率甚至高于維生素C。

圖2 不同樣品提取物對DPPH 自由基清除率的影響Fig.2 Effects of different sample extracts on DPPH free radical scavenging rate

2.6 不同連翹樣品提取物對ABTS+自由基清除率的測定

不同連翹樣品提取物對ABTS+自由基清除率的測定結果如圖3 所示，隨著質量濃度的上升，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉對ABTS+自由基的清除能力也逐漸增大。當質量濃度為0.312 5 ～2.5 mg/mL 時，提取物的清除率呈對數增長；當質量濃度達到2.5 mg/mL 后，清除率增長變得緩慢；當提取物質量濃度達到5.0 mg/mL時，連翹樣品提取物的清除率與維生素C 相當。當質量濃度為2.5 mg/mL時，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物對ABTS+自由基的清除率分別為81.1%、90.3%、87.8%和85.1%，清除率大小為：殺青葉＞捻揉葉＞干燥茶葉＞鮮葉，殺青葉對ABTS+自由基的清除活性最強。

圖3 不同樣品提取物對ABTS+自由基清除率的影響Fig.3 Effects of different sample extracts on ABTS+free radical scavenging rate

2.7 不同連翹樣品提取物總抗氧化能力分析

從圖4 可以看出，在本試驗的質量濃度范圍內，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉的總抗氧化能力隨質量濃度的升高而不斷增強，且在不同質量濃度下，4 種樣品提取物的總抗氧化能力不同。當提取物的質量濃度為0.312 5～2.5 mg/mL 時，樣品提取物的總抗氧化能力呈明顯的量效關系；當質量濃度達到2.5 mg/mL 后，總抗氧化能力的增長緩慢；當質量濃度達到5.0 mg/mL 時，總抗氧化能力基本一致。當質量濃度為2.5 mg/mL 時，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物的總抗氧化能力分別為91.3%、92.5%、92.2%和91.3%，總抗氧化能力大小為：殺青葉＞捻揉葉＞干燥茶葉=鮮葉，殺青葉的總抗氧化能力最高。

圖4 不同樣品提取物總抗氧化能力比較Fig.4 Compasion of total antioxidant capacity of different sample extracts

連翹樣品不同加工過程提取物在質量濃度為2.5 mg/mL 時，抗氧化活性的方差分析如表5 所示，連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉的DPPH、ABTS+自由基清除率和總抗氧化能力具有明顯差異（P＜0.05）。

表5 不同樣品提取物抗氧化活性的方差分析Tab.5 Analysis of variance of antioxidant activity of different sample extracts

3 結論與討論

連翹作為山西道地中藥材，以其干燥果實入藥。據《中華本草》記載，“連翹莖葉，性寒，主治心肺積熱”[24]，在我國山西、陜西、河北等地，人們常把連翹葉曬干自制成連翹茶飲用。2020 年3 月，為貫徹落實《國務院關于促進鄉(xiāng)村產業(yè)振興的指導意見》，加快山西省農村振興進程，山西省政府提出飲料水果產業(yè)以中藥材和水果為主要資源優(yōu)勢，重點布局和打造藥茶和果汁，大力發(fā)展連翹茶、沙棘葉茶等藥茶[25]。連翹茶葉因其風味醇厚，香味純正，成為廣受大眾歡迎的純天然茶飲料。

食源性致病菌指可以引起食物腐敗變質，并導致食源性疾病的一類微生物[26]。在各種食品安全事故中，由食源性致病菌導致中毒的比例占比最高，其中細菌引起的疾病占比2/3[26]。ZHOU 等[27]研究發(fā)現，連翹葉提取物可抑制大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的活性。李歐等[28]研究表明，連翹葉提取物對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用。本研究通過對連翹綠茶不同加工過程提取物進行抑菌分析，發(fā)現連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥葉對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，而對大腸埃希氏菌、腸沙門氏菌腸亞種、福氏志賀氏菌、阪崎氏年輕泰坦桿菌和痢疾志賀氏菌無明顯抑制效果，說明連翹綠茶不同加工過程提取物對革蘭氏陽性菌的抑制作用較好，與ZHOU 等[27]、李歐等[28]的研究結果略有不同，其原因可能是提取方法不同、生長環(huán)境不同等因素所造成。此外，當不同樣品提取物的質量濃度為1.0 g/mL 時，鮮葉和干燥茶葉對蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為11.1、11.2 mm，抑菌圈直徑顯著高于殺青葉和捻揉葉（P＜0.05）；干燥茶葉對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強，抑菌圈直徑為11.3 mm。鮮葉和干燥茶葉提取物對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 均為125 mg/mL；鮮葉和干燥茶葉提取物對蠟樣芽孢桿菌的MBC 均為250 mg/mL，鮮葉和干燥茶葉提取物對金黃色葡萄球菌的MBC均為500 mg/mL。本試驗研究對象均為連翹葉粗提物，關于不同連翹樣品提取物是通過何種活性成分進行抑菌還需要進一步研究。

很多研究表明，連翹葉具有較強的抗氧化能力。原江鋒等[17]研究表明，連翹葉綠茶具有較強的DPPH 自由基清除能力，且高于信陽毛尖和桑葉茶。李歐等[28]研究發(fā)現，連翹葉提取物對DPPH·、OH·和ABTS+·清除能力一致，均具有較好的抗氧化活性。本試驗利用連翹鮮葉、殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物對DPPH、ABTS+自由基清除率及總抗氧化能力進行測定，發(fā)現不同加工過程提取物的抗氧化活性隨著質量濃度的增大而升高，當樣品提取物的質量濃度為2.5 mg/mL 時，殺青葉對DPPH、ABTS+自由基清除率及總抗氧化能力最高，分別為98.2%、90.3%和92.5%。另外據報道，連翹葉中的連翹苷類物質和綠茶中的酚類物質都具有抗氧化活性[29-30]，而連翹葉在加工成綠茶的過程中，經過高溫處理后的殺青葉、捻揉葉和干燥茶葉提取物的抗氧化活性有所降低，推測干燥過程中高溫對連翹葉綠茶中的抗氧化活性成分造成了部分降解或轉化為不具有抗氧化能力或抗氧化活性較低的化合物，具體是哪類物質發(fā)生了轉變還需要通過代謝組學進行分析。

綜上，連翹綠茶不同加工過程提取物對革蘭氏陽性菌具有明顯抑菌效果，其中干燥茶葉和鮮葉的抑菌效果最強，殺青葉的抗氧化活性最高。研究結果可為連翹綠茶加工工藝優(yōu)化及其進一步開發(fā)利用提供理論依據。