殺蟲(chóng)劑處理的梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及差異表達(dá)解毒酶基因篩選

劉曉慶 ，龐欽瑋 ，冀佳悅 ，楊 春 ，高玲玲 ，郭艷瓊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 果樹(shù)研究所，山西 太谷 030815；3.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織農(nóng)業(yè)與食品部，西澳 文布利 6913）

梨小食心蟲(chóng)（Grapholita molesta）屬鱗翅目卷蛾科，簡(jiǎn)稱“梨小”，廣泛分布于亞洲、歐洲和美洲，我國(guó)從南至北均有發(fā)生[1-2]，主要危害蘋果、梨、核桃和紅棗等仁果類和核果類果樹(shù)。目前，梨小食心蟲(chóng)的防治手段仍以化學(xué)防治為主。梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有鉆蛀性，難以完全接觸藥劑，因此，果園噴施農(nóng)藥通常是用于滅殺成蟲(chóng)，阿維菌素、高效氯氟氰菊酯是防治梨小食心蟲(chóng)的有效藥劑，吡蟲(chóng)啉作為果園防治害蟲(chóng)常用殺蟲(chóng)劑，對(duì)梨小食心蟲(chóng)也有一定的防治效果。

杜恩強(qiáng)等[3]試驗(yàn)表明，阿維菌素能殺滅梨小成蟲(chóng)、抑制成蟲(chóng)產(chǎn)卵；庾琴等[4]研究表明，阿維菌素、高效氯氟氰菊酯等殺蟲(chóng)劑對(duì)梨小初孵幼蟲(chóng)有一定的防治效果；陳靜等[5]研究表明，高效氯氟氰菊酯、阿維菌素對(duì)梨小具有一定的防治效果；田間藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4.5%高效氯氰菊酯EC 對(duì)梨小15 d 田間防效達(dá)98%[6]。然而，由于梨小的鉆蛀特性，使部分齡期難以完全接觸藥劑，且化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期不合理使用，使梨小對(duì)不少農(nóng)藥耐受性增加。害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生耐藥性的過(guò)程，與解毒酶的活性密切相關(guān)。解毒酶代謝活性增加在害蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性過(guò)程中起重要作用[7-9]。

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）、羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarEs）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GlutathioneS-transferases，GSTs）是昆蟲(chóng)三大解毒酶系。細(xì)胞色素P450 可廣泛地代謝外源和內(nèi)源化合物[10]，在解毒和激活方面具有雙重作用。近年來(lái)，對(duì)雙翅目、鱗翅目和鞘翅目等多種昆蟲(chóng)進(jìn)行了全基因組測(cè)序，與昆蟲(chóng)解毒代謝相關(guān)的P450基因大部分集中在CYP4、CYP6 和CYP9 家族中，通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞色素基因分屬于CYP2 簇、CYP3 簇、CYP4 簇和線粒體簇中[11]。CarEs 主要是通過(guò)將包含酯鍵的內(nèi)源性和外源性化合物分解為醇和酸[12]，達(dá)到解毒目的，其共有14 個(gè)進(jìn)化支（A-N），分為3 個(gè)功能組，即與代謝解毒相關(guān)的酶類（A-C）、與激素和信息素降解相關(guān)的酶類（D-G）和與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的酶類（H-N）。GSTs 通過(guò)催化谷胱甘肽與有毒的疏水親電物質(zhì)發(fā)生軛合反應(yīng)，使毒性降低，可溶性增強(qiáng)，進(jìn)而排出體外，達(dá)到解毒的目的[13]，GSTs 在昆蟲(chóng)中可分為七大類：sigma、zeta、omega、theta、microsomal、delta和epsilon[14]。這3 種解毒酶廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中[15]，可將進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿醵净驘o(wú)毒的形式[16]。

隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究的深入，高通量雙端RNA測(cè)序被廣泛應(yīng)用，它可以測(cè)得不同組織或不同條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[17]，例如，人、鼠、昆蟲(chóng)、微生物等的轉(zhuǎn)錄組[18-20]，此外，RNA 測(cè)序還能進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析[21]。CRAVA 等[22]對(duì)櫻桃果蠅Drosophila suzukii的轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出了OR 基因；TIAN等[23]對(duì)桃蛀果蛾Carposina sasakii轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出了化學(xué)感受蛋白基因；CHEN 等[24]對(duì)韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出4 個(gè)與吡蟲(chóng)啉代謝有關(guān)的P450 基因。

本研究對(duì)3 種殺蟲(chóng)劑不同濃度處理的梨小轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，篩選可能與殺蟲(chóng)劑代謝相關(guān)的解毒酶基因，旨在為合理科學(xué)使用殺蟲(chóng)劑及深入開(kāi)展研究梨小解毒酶基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)初始種群于2012 年采自山西省太谷縣西山底村桃林（37°21′42″N，112°34′19″E），將其帶回實(shí)驗(yàn)室放置于溫度（26±1）℃、相對(duì)濕度70%±10%、光周期15L∶9D 的人工氣候培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。

RNAiso Plus，購(gòu)買自TaKaRa；cDNA 第1 鏈合成試劑盒PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser，購(gòu)買自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；殺蟲(chóng)劑為阿維菌素（avermectin）、吡蟲(chóng)啉（imidacloprid）、高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothrin），均購(gòu)買自SIGMA-ALDRICH 公司。PRX-450C 人工氣候箱（寧波海曙賽福儀器廠）；HS-840 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 3 種殺蟲(chóng)劑室內(nèi)毒力測(cè)定 用藥膜法[25]測(cè)定吡蟲(chóng)啉、阿維菌素和高效氯氟氰菊酯對(duì)梨小食心蟲(chóng)的室內(nèi)毒力。以丙酮為溶劑將原藥配制成母液，并用丙酮稀釋成一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試藥液。分別吸取1 mL 藥液加入到指形管（直徑16 mm，長(zhǎng)度80 mm）中；立即滾動(dòng)小瓶，使農(nóng)藥均勻地分布在內(nèi)表面，在丙酮揮發(fā)后用吸水棉蓋住。將7 只健康的梨小成蟲(chóng)接入帶有殺蟲(chóng)劑薄膜的指形管中，每組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，原飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)24 h 觀察死亡情況并記錄死亡率，輕觸蟲(chóng)體不動(dòng)為死亡。

1.2.2 樣品制備 根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，得到吡蟲(chóng)啉、阿維菌素和高效氯氟氰菊酯亞致死濃度（LC10、LC30）、致死中濃度（LC50），分別吸取3 種殺蟲(chóng)劑3 種濃度1 mL 藥液于指形管中，立即滾動(dòng)小瓶，使農(nóng)藥均勻地分布在內(nèi)表面，并將7 只健康成蟲(chóng)放入帶有殺蟲(chóng)劑薄膜的小瓶24 h，然后收集存活的成蟲(chóng)作為測(cè)序的一個(gè)樣本，每組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有的樣品立即在液氮中冷凍，然后儲(chǔ)存在-80 ℃用于提取RNA。

1.2.3 RNA 提取 按照說(shuō)明用Trizol RNA 提取試劑和Rnase 提取1.2.2 樣品中的總RNA，然后用Rnasy 離心柱純化。利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的質(zhì)量，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝 采用Illumine HiSeq 2000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，對(duì)獲得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭和含未知堿基N 比例超過(guò)5%的reads 以及低質(zhì)量測(cè)序序列，得到待分析數(shù)據(jù)（Clean reads）。使用Trinity 軟件對(duì)獲得的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，然后使用Tgicl 軟件進(jìn)行聚類去冗余，獲得Unigene。

1.2.5 功能注釋 為獲得全面的基因功能信息，將非重復(fù)序列基因通過(guò)BLAST 分別與NR、NT、SWISS-PROT、Pfam、GO、KOG、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的注釋信息。

1.2.6 差異表達(dá)基因分析 使用DESeq 軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)為誤報(bào)率（falsediscovery rate，F(xiàn)DR）小于0.05 且差異倍數(shù)大于2。通過(guò)MEGA 7.0 軟件使用P 距離模型1 000 次引導(dǎo)值的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析[26]。

第三、加快推進(jìn)社會(huì)體育改革，構(gòu)建社區(qū)體育發(fā)展機(jī)制。經(jīng)過(guò)十幾年體育改革發(fā)展，我國(guó)體育社會(huì)化進(jìn)度在加快，體育體制開(kāi)始分化，社會(huì)普及程度較高的足球、籃球、排球等項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)職業(yè)化發(fā)展。計(jì)劃經(jīng)濟(jì)體制下的“單位體育”逐漸向社區(qū)體育轉(zhuǎn)變，體育社團(tuán)、體育協(xié)會(huì)、體育俱樂(lè)部等體育社會(huì)組織的發(fā)展，推動(dòng)社區(qū)體育發(fā)展，社區(qū)體育成為全民健身運(yùn)動(dòng)發(fā)展基本載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種殺蟲(chóng)劑對(duì)梨小的毒力測(cè)定

采用藥膜法進(jìn)行吡蟲(chóng)啉、阿維菌素和高效氯氟氰菊酯對(duì)梨小的室內(nèi)毒性測(cè)定，計(jì)算出3 種殺蟲(chóng)劑的毒力回歸方程以及LC10、LC30、LC50濃度（表1）。

表1 3 種殺蟲(chóng)劑的室內(nèi)毒力測(cè)定Tab.1 Indoor toxicity determination of three insecticidesμg/mL

2.2 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝結(jié)果

梨小轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中，Q20 堿基和Q30 堿基的比值分別＞96%和＞87%，說(shuō)明RNA-Seq 數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠（表2）。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Sequencing data statistics

經(jīng)過(guò)組裝后產(chǎn)生了101 873 條Unigenes，總長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度以及覆蓋50%所有核苷酸的最大序列重疊群長(zhǎng)度（N50）分別為202 980 197、1 992、3 037 bp，GC 含量為40.64%（表3）。Unigenes 其不同長(zhǎng)度的具體分布如圖1 所示，可看出＞3 kb 的Unigenes 最多，有22 913 條，說(shuō)明組裝結(jié)果較好。

圖1 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組拼接后的Unigenes 長(zhǎng)度分布Fig.1 Length distribution of the assembled Unigenes in the G. molesta transcriptome

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.3 Summary of assembly results

2.3 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋

將梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝后的Unigenes序列與NR、NT、KEGG、KOG、SWISS-PROT、Pfam和GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)獲得的101 873條Unigenes進(jìn)行功能注釋，其中通過(guò)NR、NT、SWISSPROT、Pfam、KEGG、KOG、GO 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得注釋的Unigenes 分別有57 209、39 186、43 749、46 168、46 678、42 247、27 486 條，共有66 658 條Unigenes 成功得到注釋，占總Unigenes 的65.43%（表4）。根據(jù)NR 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，序列同源性最高的物種是大蠟螟Galleria mellonella（9.35%），其次是粉紋夜蛾Trichoplusia ni（9.32%）、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera（9.28%）、海波斯莫科馬屬蛾Hyposmocoma kahamanoa（9.16%）和臍橙螟蛾Amyelois transitella（8.13%）（圖2）。

圖2 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigenes 在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分布Fig.2 Species distribution of Unigenes in the G. molesta transcriptome in NR database

表4 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigene 的功能注釋信息Tab.4 Functional annotation information of G. molesta transcriptome

使用基因本體（GO）方法，將注釋基因分為3 類（共24 個(gè)功能組）：生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能。在生物過(guò)程中，細(xì)胞過(guò)程包含了最多的Unigenes；在細(xì)胞組分中，膜部分占主導(dǎo)地位；在分子功能分類中，注釋基因數(shù)最多的是結(jié)合和催化活性（圖3）。與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得注釋的46 678 條Unigene主要涉及6 大類功能，包括細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝和生物系統(tǒng)。最具代表性的途徑是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及運(yùn)輸和分解代謝（圖4）。

圖3 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigenes GO 功能分類Fig.3 GO functional classification of Unigenes in the G. molesta transcriptome

圖4 梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigenes KEGG 功能分類Fig.4 KEGG functional classification of Unigenes in the G. molesta transcriptome

2.4 梨小食心蟲(chóng)差異表達(dá)基因及功能注釋

采用生物信息學(xué)方法分別篩選3 種農(nóng)藥處理的梨小食心蟲(chóng)差異表達(dá)基因，阿維菌素處理梨小后篩選出825 個(gè)差異表達(dá)基因，其中639 個(gè)上調(diào)基因和186 個(gè)下調(diào)基因（圖5-A），并對(duì)其功能進(jìn)行注釋，注釋到結(jié)合（binding）的Unigenes 最多（圖5-B）。

圖5 差異表達(dá)量倍數(shù)變化及功能注釋Fig.5 Differential expression fold change and functional annotation

吡蟲(chóng)啉處理后篩選出641 個(gè)差異表達(dá)基因，包括333 個(gè)上調(diào)基因和308 個(gè)下調(diào)基因（圖5-C），功能注釋到結(jié)合（binding）的Unigenes 最多（圖5-D）。

高效氯氟氰菊酯處理后篩選出1 391 個(gè)差異表達(dá)基因，包括538 個(gè)上調(diào)基因和853 個(gè)下調(diào)基因（圖5-E），并對(duì)其功能進(jìn)行注釋，注釋到結(jié)合與催化活性（binding and catalytic activity）的Unigenes 最多（圖5-F）。

2.5 梨小食心蟲(chóng)差異表達(dá)解毒酶基因篩選

經(jīng)阿維菌素3 種濃度處理梨小后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，差異表達(dá)基因主要為P450s 和GSTs，其中有5 個(gè)P450，4 個(gè)上調(diào)，1 個(gè)下調(diào)；2 個(gè)GST 基因，1 個(gè)上調(diào)，1 個(gè)下調(diào)；其中P450 基因Unigene16556_All在LC10和LC50濃度下均顯著上調(diào)；GST 基因CL996.Contig4_All 在LC10和LC50濃度下均顯著下調(diào)（表5）。

表5 阿維菌素處理下差異表達(dá)的解毒基因Tab.5 Detoxification genes differentially expressed under avermectin treatment

表6 吡蟲(chóng)啉處理下差異表達(dá)的解毒基因Tab.6 Detoxification genes differentially expressed under imidacloprid treatment

高效氯氟氰菊酯3 種濃度處理梨小后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，3 種解毒酶基因均有差異表達(dá)，其中有6 個(gè)P450 基因，4 個(gè)上調(diào)，2 個(gè)下調(diào)；2 個(gè)GST 基因均上調(diào)；3 個(gè)CarE 基因均上調(diào)（表7）。

將3 種殺蟲(chóng)劑處理梨小后的差異表達(dá)基因進(jìn)行匯總，共篩選到解毒代謝相關(guān)基因20 個(gè)，包括11 個(gè)P450 基因、5 個(gè)GST 基因、4 個(gè)CarE 基因，20 個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量熱圖聚類分析如圖6所示。分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)P450基因（Unigene12076_All、Unigene18672_All）在阿維菌素、吡蟲(chóng)啉處理下均顯著上調(diào)；P450 基因CL4554.Contig2_All 在吡蟲(chóng)啉、高效氯氟氰菊酯處理下顯著下調(diào)；P450 基因Unigene15542_All、GST 基因CL2631.Contig4_All在吡蟲(chóng)啉、高效氯氟氰菊酯處理下顯著上調(diào)；P450基因Unigene19792_All 在吡蟲(chóng)啉處理下顯著下調(diào)，在高效氯氟氰菊酯處理下顯著上調(diào)；P450 基因Unigene16556_All 在3 種農(nóng)藥處理下均顯著上調(diào)。

圖6 差異表達(dá)基因表達(dá)量聚類熱圖Fig.6 Clustering heat map of differentially expressed gene expression

將11 條P450 基因序列與已知鱗翅目昆蟲(chóng)的CYP 蛋白序列比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其中有7 個(gè)基因?qū)儆贑YP6 家族，2 個(gè)基因?qū)儆贑YP4 家族，2 個(gè)基因?qū)儆贑YP12 家族（圖7）。將5 條GST 基因序列與已知鱗翅目昆蟲(chóng)的GST 蛋白序列比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，均屬于sigma 家族（圖8），將4 條CarE基因序列與已知鱗翅目昆蟲(chóng)的CarE 蛋白序列比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其中3 個(gè)聚在A 簇，另一個(gè)聚在C 簇（圖9）。

圖7 梨小食心蟲(chóng)細(xì)胞色素P450 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.7 Phylogenetic analysis of cytochrome P450 in G. molesta

圖8 梨小食心蟲(chóng)GST 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.8 Phylogenetic analysis of GST in G. molesta

圖9 梨小食心蟲(chóng)4 個(gè)CarEs 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.9 Phylogenetic analysis of four CarEs in G. molesta

3 結(jié)論與討論

梨小食心蟲(chóng)是世界范圍內(nèi)重要的果樹(shù)害蟲(chóng)之一，幼蟲(chóng)蛀食梨、蘋果和桃等的果實(shí)以及嫩梢，給林果產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了威脅。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)梨小食心蟲(chóng)進(jìn)行了深入研究，但針對(duì)殺蟲(chóng)劑亞致死劑量下梨小體內(nèi)差異表達(dá)解毒酶基因鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)Illumina Hiseq 2000 測(cè)序儀對(duì)阿維菌素、高效氯氟氰菊酯、吡蟲(chóng)啉3 種殺蟲(chóng)劑處理后梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和差異表達(dá)分析，得到解毒代謝相關(guān)基因，為下一步的分子研究奠定基礎(chǔ)。本次研究共獲得101 873 條Unigene，N50 為3 037 bp，Q20堿基和Q30 堿基的比值分別＞96%和＞87%。研究表明，Q30 在80%以上就認(rèn)為測(cè)序質(zhì)量可靠[27]。因此，本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量和長(zhǎng)度滿足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求。

本研究共計(jì)有66 658 條Unigenes 被NR、NT、SWISS-PROT 瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（包括Pfam）、GO、KOG、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，但仍有35 215 條序列沒(méi)有成功比對(duì)，這可能與拼接的序列片段過(guò)短、缺乏注釋信息有關(guān)[28]，也可能本身是非編碼序列或者是新的某種基因[29]。在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中，梨小注釋到大蠟螟的序列信息最多，可能與2 種昆蟲(chóng)均屬鱗翅目，親緣關(guān)系相對(duì)較近有關(guān)。梨小轉(zhuǎn)錄組Unigenes 在 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)得到27 486 條功能注釋，其中參與催化活性與結(jié)合活性的基因功能注釋較多，這與其他昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致[30]。在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到46 678 條功能注釋，其中注釋到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及運(yùn)輸和分解代謝通路的基因較多，反映出梨小成蟲(chóng)有較強(qiáng)的代謝活力，為深入挖掘、鑒定解毒代謝基因提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院郭艷瓊教授課題組前期對(duì)未做任何處理的梨小成蟲(chóng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到77 條CYP 基因、46 條CarEs 基因、28 條GSTs 基因[31]，為進(jìn)一步研究梨小食心蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的代謝作用提供了寶貴信息?；诖?，進(jìn)行3 種殺蟲(chóng)劑處理的梨小轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及差異表達(dá)解毒酶基因篩選，得到11 條CYP 基因、4 條 CarEs 基因、5 條GSTs 基因。研究表明，外源性和內(nèi)源性化合物可以在一些昆蟲(chóng)物種中誘導(dǎo)一些解毒酶基因的表達(dá)[32]，如黑腹果蠅[33]、小菜蛾[34]、埃及伊蚊[35]等。與未經(jīng)氯菊酯處理的家蠅相比，暴露于氯菊酯的家蠅多個(gè)P450 基因上調(diào)[36]。噻蟲(chóng)嗪誘導(dǎo)Q 型煙粉虱GST14的過(guò)表達(dá)[37]。家蠅CarEs 在氯菊酯處理后可進(jìn)一步升高[38]。有研究認(rèn)為，P450s 在昆蟲(chóng)體內(nèi)的誘導(dǎo)參與了昆蟲(chóng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的形成[39]。CYP6A1基因的過(guò)度表達(dá)使褐飛虱其對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性水平提高[40]。吡蟲(chóng)啉誘導(dǎo)后，麥二叉蚜中有6 個(gè)屬于CYP3 家族的P450 基因表達(dá)量升高[41]。阿維菌素作用后，小菜蛾CYP340W1 基因表達(dá)量升高，RNA 技術(shù)證明此基因參與阿維菌素的代謝[42]。高效氯氟氰菊酯誘導(dǎo)后，斜紋夜蛾CYP301A1、CYP301B1、CYP367A18和CYP304F1可能參與了對(duì)高效氯氟氰菊酯的解毒代謝過(guò)程[43]。GST 的過(guò)表達(dá)也增強(qiáng)了殺蟲(chóng)劑的代謝，柑橘全爪螨Panonychus citri中的一個(gè)GST 基因（PcGSTm5）在阿維菌素處理下高表達(dá)，參與阿維菌素的解毒[44]。殺蟲(chóng)劑對(duì)CarE 基因的誘導(dǎo)使岡比亞按蚊[45]、埃及伊蚊[46]、朱砂葉螨[47]等昆蟲(chóng)代謝解毒能力增強(qiáng)。本研究經(jīng)阿維菌素處理梨小后，有4 個(gè)上調(diào)的P450 基因、1 個(gè)上調(diào)的GST 基因；經(jīng)吡蟲(chóng)啉處理梨小后，有5 個(gè)上調(diào)的P450 基因、1 個(gè)上調(diào)的GST 基因；經(jīng)高效氯氟氰菊酯處理梨小后，有4 個(gè)上調(diào)的P450 基因、2 個(gè)上調(diào)的GST 基因、3 個(gè)上調(diào)的CarEs基因。由此推測(cè)，篩選得到的解毒酶基因可能使昆蟲(chóng)解毒能力增強(qiáng)，從而參與對(duì)3 種殺蟲(chóng)劑的代謝。

本研究通過(guò)對(duì)阿維菌素、吡蟲(chóng)啉、高效氯氟氰菊酯3 種殺蟲(chóng)劑不同亞致死劑量處理的梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析以及差異表達(dá)基因的篩選，獲得與3 種殺蟲(chóng)劑解毒代謝相關(guān)基因的信息，為相關(guān)基因的克隆、表達(dá)、功能研究及進(jìn)一步研究梨小食心蟲(chóng)解毒代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。