長鏈非編碼RNA NEAT1、miRNA-182-5p 與2 型糖尿病合并代謝性脂肪性肝病患者肝纖維化風險的相關性研究

賀佳，李永平，魏楓*，劉美嵐，吳亞玲，韶龍格

1.014010 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市，內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

2.014010 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市衛(wèi)生健康委員會綜合保障中心

2 型糖尿?。═2DM）是常見的慢性代謝性疾病，其發(fā)病機制復雜多樣，可歸結為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及胰島功能衰竭［1］，兩者共同影響糖尿病發(fā)展的全過程。流行病學調(diào)查研究顯示，預計到2030 年全球糖尿病患病人數(shù)將達到6.43 億（11.3%），2045 年將增至7.84 億（12.2%）［2］。T2DM 常合并代謝相關脂肪性肝?。∕AFLD），MAFLD 由非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）更名而來，2020 年22 個國際專家小組認為MAFLD 相較于NAFLD 更加適合描述與內(nèi)分泌代謝功能障礙相關的肝臟疾?。?］。約55.5%的T2DM 患者合并MAFLD，且發(fā)生肝纖維化的概率為17.0%［4］，兩者共存不僅增加了肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生，同時也增加了糖尿病腎病及心腦血管系統(tǒng)并發(fā)癥的風險，嚴重威脅人類健康。

T2DM 合并MAFLD 的發(fā)病機制錯綜復雜，近年來非編碼RNA 成為這一研究熱點。其中長鏈非編碼RNA核富集轉錄體1（long non-coding RNA-nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1）異常表達與胚胎發(fā)育、細胞增殖分化、脂肪變性、氧化應激、內(nèi)質網(wǎng)應激等生理病理進程密切相關［5］。有研究顯示，lncRNA NEAT1 可參與胰島素的合成、分泌及敏感性的調(diào)控［6］。

微小RNA（microRNA，miRNA）也是非編碼RNA的一種，其中miRNA-182-5p 目前已被證明在T2DM 及其并發(fā)癥的調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮作用，并可通過調(diào)控不同信號通路來調(diào)節(jié)IR［7］。目前l(fā)ncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 在T2DM 合并MAFLD 的研究中較少，本研究通過比較不同患者外周血中l(wèi)ncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 的表達情況，分析其與肝纖維化的相關性，為臨床早期診斷及防治疾病提供新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2021 年10 月—2022 年6 月在內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科就診并入組國家標準化代謝性疾病管理中心（MMC）的T2DM 患者236例為研究對象，同時納入在內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院體檢的49 名健康志愿者為健康對照組。納入標準：（1）T2DM 診斷符合《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［8-9］；（2）MAFLD 診斷符合《代謝功能障礙相關脂肪肝的新定義：國際專家共識聲明》［3］；（3）年齡18～80 周歲。排除標準：（1）其他類型糖尿病及糖尿病急性并發(fā)癥患者；（2）感染性疾病、免疫性疾病及腫瘤患者；（3）嚴重肝、腎功能不全患者；（4）近期服用影響肝功能藥物的患者。本研究已通過內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（審批號：2023011），入組患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集：記錄研究對象的年齡、性別、T2DM 病程，吸煙史（定義為吸煙≥1 支/d，連續(xù)吸煙＞1 年［10］）、飲酒史［定義為平均飲白酒（酒精含量＞50%）≥100 mL/d，持續(xù)1 年以上［10］］等指標。測量身高、體質量、頸圍（NC）、腰圍（WC），計算BMI。

1.2.2 實驗室指標檢測：研究對象均測定血小板計數(shù)（PLT）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、白蛋白（Alb）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血尿酸（SUA）、空腹C 肽，計算改良穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=1.5+FPG（mmol/L）×空腹C 肽（pmol/L）/2 800。

1.2.3 內(nèi)臟脂肪面積（VFA）、 皮下脂肪面積（SFA） 的測定： 采用生物電阻抗法（ 歐姆龍DUALSCANHDS-2000）測量VFA、SFA，單位以cm2表示。

1.2.4 lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 的測定：采集研究對象外周血2 mL，首先用人淋巴細胞分離液提取單核細胞，后采用Trizol 法提取總RNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 相對表達量，lncRNA NEAT1 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，依照試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：FP402-02）說明書進行檢測，miRNA-182-5p 以U6 作為內(nèi)參，依照試劑盒（諾唯贊，貨號：MQ101-02）說明書進行檢測。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 分組：將T2DM 患者依據(jù)《代謝功能障礙相關脂肪肝的新定義：國際專家共識聲明》［3］分為T2DM 合并非MAFLD組（n=82）與T2DM合并MAFLD組（n=154）。進一步根據(jù)肝纖維化指數(shù)（FIB-4）：FIB-4=（年齡×AST）/（PLT×ALT1/2）［11］，將T2DM 合并MAFLD 組分為肝纖維化低危亞組（FIB-4＜1.30 或年齡≥65 歲、FIB-4＜2.00，n=55），肝纖維化中危亞組（1.30 ≤FIB-4 ≤2.67或年齡≥65 歲、2.00 ≤FIB-4 ≤2.67，n=69），肝纖維化高危亞組（FIB-4＞2.67，n=30）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman 秩相關分析探究肝纖維化高危亞組lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 表達水平的相關性，采用多因素有序Logistic 回歸分析探究T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化風險的影響因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T2DM合并非MAFLD組、T2DM合并MAFLD組、健康對照組一般資料及實驗室檢測指標比較

3 組研究對象年齡、BMI、NC、WC、VFA、SFA、FPG、HbA1c、HOMA-IR、PLT、ALT、AST、Alb、TG、TC、SUA、lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組間比較結果顯示，健康對照組年齡、NC、FPG、HbA1c低于T2DM 合并MAFLD 組、T2DM 合并非MAFLD 組，Alb 高于T2DM合并MAFLD 組、T2DM 合并非MAFLD 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；T2DM 合并MAFLD 組BMI、WC、VFA、SFA、HOMA-IR、TG、SUA、lncRNA NEAT1 高于健康對照組、T2DM 合并非MAFLD 組，PLT 低于健康對照組、T2DM 合并非MAFLD 組，TC 低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；T2DM 合并非MAFLD 組HOMA-IR、lncRNA NEAT1 高于健康對照組，miRNA-182-5p 高于健康對照組、T2DM 合并MAFLD組，ALT、AST 低于健康對照組、T2DM 合并MAFLD組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3 組研究對象性別、T2DM 病程、吸煙史、飲酒史比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2 肝纖維化低危亞組、肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組一般資料及實驗室檢測指標比較

3 組研究對象性別、BMI、NC、WC、VFA、SFA、PLT、AST、TC、lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較結果顯示，肝纖維化低危亞組VFA、SFA、AST、lncRNA NEAT1低于肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組，PLT、miRNA-182-5p 高于肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組，BMI、WC、NC 低于肝纖維化高危亞組，TC 高于肝纖維化高危亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肝纖維化中危亞組PLT、miRNA-182-5p 高于肝纖維化高危亞組，AST、lncRNA NEAT1 低于肝纖維化高危亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3 組患者年齡、T2DM病程、吸煙史、飲酒史、FPG、HbA1c、HOMA-IR、ALT、Alb、TG、SUA 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 肝纖維化低危亞組、肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組一般資料及實驗室檢測指標比較Table 3 Comparison of general information and laboratory indicators among the low-risk subgroup，medium-risk subgroup and high-risk subgroup of liver fibrosis

2.3 肝纖維化高危亞組患者lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 的相關性分析

Spearman 秩相關分析結果顯示，肝纖維化高危亞組患者lncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 呈負相關（rs=-0.438，P＜0.05）。

2.4 肝纖維化發(fā)生風險影響因素的多因素有序Logistic回歸分析

以T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化危險程度為因變量（賦值：肝纖維化低危亞組=1，肝纖維化中危亞組=2，肝纖維化高危亞組=3），以性別（賦值：男=1，女=2）、lncRNA NEAT1、miR-182-5p、BMI、NC、WC、VFA、SFA、AST、PLT、TC（賦值均為實測值）為自變量進行多因素有序Logistic 回歸分析，結果顯示lncRNA NEAT1、VFA、miRNA-182-5p、PLT、AST 是T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化發(fā)生風險的影響因素（P＜0.05），見表4。

表4 肝纖維化風險影響因素的多因素有序Logistic 回歸分析結果Table 4 Multilevel ordinal Logistic regression analysis of risk factors for liver fibrosis

3 討論

目前MAFLD 已經(jīng)取代慢性肝炎成為全球最常見的慢性肝臟疾?。?2］，最被人們接受并承認的發(fā)病機制是多重打擊學說，即不良的飲食習慣、不佳的生活方式以及環(huán)境和遺傳等因素導致了IR、肥胖、代謝紊亂、氧化應激、線粒體功能障礙，其共同作用導致了肝細胞損傷和纖維化，甚至可以進展為肝硬化。所以早期監(jiān)測、識別肝纖維化危險程度對患者預后具有重要意義。目前肝纖維化的診斷金標準仍然是肝穿刺，但因其為有創(chuàng)檢查，故國際上多采用FIB-4 評估肝臟纖維化程度［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)T2DM 合并MAFLD 組患者BMI、WC、VFA、SFA、TG 顯著升高，提示T2DM 合并MAFLD 組患者的脂肪蓄積、代謝異常更為嚴重，認為體質量增加及腹型肥胖可能增加單純T2DM 人群患MAFLD 的風險。在T2DM 合并MAFLD 中發(fā)現(xiàn)與肝纖維化低危亞組相比，肝纖維化高危亞組患者AST、VFA、SFA、BMI、NC、WC 顯著升高，同時多因素有序Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，VFA 是T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化風險的影響因素，VFA 水平越高，發(fā)生肝纖維化的風險越高。YU 等［12］發(fā)現(xiàn)VFA 的增加與NAFLD 及肝纖維化獨立相關，提示VFA 可能是MAFLD 患者生活方式改變的中心目標。內(nèi)臟脂肪組織（VAT）導致病理變化的可能機制是：VFA與其獨特的生理位置以及酯酶活性增強有關，從而使血液中游離脂肪酸（FFA）顯著升高，并通過門脈系統(tǒng)直接進入肝臟，高濃度的FFA 儲存在肝臟脂肪細胞，最終導致IR 和糖脂代謝紊亂的加重，其次VAT 蓄積導致肝臟脂肪變性，并可能通過脂質重配、線粒體失調(diào)、產(chǎn)生活性氧、脂質過氧化、內(nèi)質網(wǎng)應激等病理生理機制引發(fā)炎癥，最終由NAFLD 進展為肝纖維化［13-14］。另外一項國外的隊列研究發(fā)現(xiàn)，NC 與血糖異常和代謝綜合征標志物相關，且NC 可以在識別糖尿病前期或糖尿病患者中發(fā)揮作用，可預測MAFLD 的發(fā)生風險［15］，但本研究結果不支持NC 與肝纖維化之間的關聯(lián)。本研究多因素有序Logistic 回歸分析結果表明，NC 不是T2DM合并肝纖維化風險的影響因素，與既往研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)PLT 下降是T2DM 合并發(fā)生肝纖維化的獨立危險因素，韓孟冉等［16］研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化患者PLT/白細胞計數(shù)顯著下降，并且PLT/白細胞計數(shù)是預測肝纖維化的獨立危險因素，本研究結果與之一致。LIU 等［17］認為，肝臟可以產(chǎn)生血小板生成素（TPO），在MAFLD 病理過程中，線粒體功能發(fā)生損害，可以影響TPO 合成，從而導致PLT 降低。此外，國外學者認為IR 本身不引起PLT 降低，但是當MAFLD 存在時，IR 可能會引發(fā)PLT 降低，同時發(fā)現(xiàn)PLT 的降低程度與肝組織的脂肪浸潤程度有關［18］，本研究結果與之一致。

研究顯示lncRNA NEAT1 在脂肪代謝中起著重要調(diào)控作用［19］。lncRNA NEAT1 在MAFLD 大鼠肝臟組織中呈高度表達，且lncRNA NEAT1 下調(diào)后可以通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR 及其下游調(diào)控蛋白核糖體S6 蛋白激酶（s6k1）信號通路來調(diào)節(jié)脂質合成緩解MAFLD［20］。還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-140 和lncRNA NEAT1 相互作用可增強lncRNA NEAT1 的表達以及穩(wěn)定性，SUN 等［21］發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1 可以與miRNA-140競爭性結合，并通過調(diào)節(jié)腺苷酸激活蛋白激酶/固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（AMPK/SREBP-1）信號通路影響MAFLD 的進展，同時lncRNA NEAT1 也可以通過靶向調(diào)控Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）的miRNA-146a-5p 并進一步影響AMPK/SREBP 通路，最終增加脂肪變性，加重MAFLD 的進展［22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 合并MAFLD 患者外周血中l(wèi)ncRNA NEAT1 的表達顯著升高，且相較于肝纖維化低危亞組與中危亞組患者，肝纖維化高危亞組lncRNA NEAT1 表達明顯升高，多因素有序Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1 是T2DM 合并MAFLD 患者發(fā)生肝纖維化的危險因素。有學者通過體外實驗證實lncRNA NEAT1 可通過與miRNA-506 競爭性結合膠質瘤相關腫瘤基因同源3（GLI3）來調(diào)節(jié)肝纖維化、炎癥反應及脂質代謝［23］。故本研究認為外周血中l(wèi)ncRNA NEAT1 的相對表達量與進展肝纖維化有一定關系。

近年來有學者認為miRNA 在糖脂代謝疾病中起重要作用，其中miRNA-182-5p 已被證實可以影響IR 及脂質代謝［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 合并非MAFLD 組患者miRNA-182-5p 顯著高于T2DM 合并MAFLD 組，這與WEALE 等［25］的研究一致，該研究納入了1 270例受試者，發(fā)現(xiàn)T2DM 及糖尿病前期患者中miRNA-182-5p 顯著升高。而KAROLINA 等［26］發(fā)現(xiàn)miRNA-182-5p 在T2DM 中表達下調(diào)，在FPG 受損的受試者中表達輕微上調(diào)，認為miRNA-182-5p 通過靶向調(diào)控叉頭盒蛋白O1（FOXO1）來促進葡萄糖生成，在介導肝臟IR 信號傳導效應中發(fā)揮關鍵作用。本研究通過分析肝纖維化低危亞組、中危亞組、高危亞組miRNA-182-5p 的表達情況，發(fā)現(xiàn)肝纖維化高危亞組miRNA-182-5p 顯著下降。有學者發(fā)現(xiàn)miRNA-182-5p 在肥胖大鼠和人類VAT 中顯著降低，認為其是脂肪形成的新型負調(diào)節(jié)劑［27］。日本血吸蟲誘導的肝纖維化的相關研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-182 呈高表達，F(xiàn)OXO1 低表達，兩者可促進肝纖維化細胞的增殖和抑制細胞凋亡［28-29］。但miRNA-182 與T2DM 合并MAFLD 患者發(fā)生肝纖維化風險的關系仍需進一步探究。

研究發(fā)現(xiàn)，用脂多糖（LPS）誘導急性肺損傷小鼠和細胞模型中l(wèi)ncRNA NEAT1 水平升高，且lncRNA NEAT1 可以通過與miRNA-182-5p 結合調(diào)控WNT1 誘導信號通路蛋白1（WISP1）的表達，lncRNA NEAT1過表達，可以通過miRNA-182-5p/WISP1 軸抑制LPS暴露的肺泡巨噬細胞的活力，進而促進細胞凋亡和炎癥［30］，而lncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 在肝纖維化中的關系尚不清楚。本研究Spearman 秩相關分析結果發(fā)現(xiàn)在肝纖維化高危亞組患者中l(wèi)ncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 呈負相關，因未進行動物細胞實驗，故初步認為lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 在T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起一定作用，但具體機制仍需進一步驗證。

本研究存在以下局限性：許多降糖藥對MAFLD 及肝纖維化有一定作用，影響復雜，分析較為困難，故本研究未分析降糖藥物對疾病的影響；此外，本研究采用FIB-4 評估研究對象的肝纖維化情況，未經(jīng)病理驗證，故可能存在誤差。

綜上所述，lncRNA NEAT1 及miRNA-182-5p 可能在T2DM 合并MAFLD 患者及肝纖維化患者中起重要作用，提示高lncRNA NEAT1、高VFA、低miRNA-182-5p、低PLT 可能是患者肝纖維化風險的獨立危險因素。本研究為進一步明確外周血中l(wèi)ncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 對肝纖維化的作用機制提供了新的思路，同時為T2DM 合并MAFLD 患者發(fā)生肝纖維化的預防提供了新的方向。

作者貢獻：賀佳、魏楓負責研究的構思及設計；賀佳、李永平負責研究的實施，論文的撰寫及修訂；劉美嵐、吳亞玲、韶龍格負責數(shù)據(jù)的收集及整理；賀佳、劉美嵐負責統(tǒng)計學處理及繪制圖表；魏楓負責文章的質量控制，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。