中國茶漬屬地衣3個新記錄種

圖爾蓀阿依·排祖拉,熱衣木·馬木提

(新疆大學 生命科學與技術學院,烏魯木齊 830000)

柳茶漬組是狹義的茶漬屬中獨特的類群之一,由幾個形態(tài)密切相關的物種組成,包括Lecanoralbellula(Nyl.) Th. Fr.,L.subravidaNyl.,L.mughicolaNyl.,L.saligna(Schrad.) Zahlbr.,L.subintricata(Nyl.) Th. Fr.,L.sarcopidoides(A. Massal.) Hedl.,L.cf.subcinctulaNyl.,L.subsalignaM. Brand &van den Boom,L.coniferarumPrintzen,L.anoptaNyl.,L.quercicolaCoppins &P. James[3,10],所謂的狹義的茶漬屬指的是果托含有色素,皮層含有黑茶漬素(atranorin)或松羅酸(usnic acid)的一類地衣[11]。柳茶漬組主要的分類特征為:通常樹棲性和樹皮生,無粉芽,地衣體樹皮內(nèi)生或呈表面地衣體,子囊盤茶漬型,孢子呈橢圓形,單胞,具有桿狀和略微彎曲的分生孢子,主要的次生代謝產(chǎn)物是異松蘿酸或松蘿酸,多為生長在1 200 m以上的棲息地[3,10]。

鞏乃斯林場位于天山中部伊犁河谷東端,巴音郭楞蒙古自治州西北邊緣,東西長約55 km,南北寬約30 km,植被喬木樹種以天山云杉為主,年均氣溫1.27 ℃,年均降水量可達900 mm[12],具有約7.85 hm2天然林資源。該研究材料采自新疆河靜縣西北部的攻乃斯林場,發(fā)現(xiàn)3個中國新記錄種,即:亞異茶漬,櫟生茶漬,針葉茶漬,研究結果為我國地衣的生物多樣性提供科學性資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

采自于新疆天山西部鞏乃斯林場的20余份柳茶漬組地衣標本,其憑證標本現(xiàn)存于中國西北干旱區(qū)地衣研究中心標本室(XJU)。

1.2 方 法

對采自于中國新疆河靜縣西北部的攻乃斯林場的標本進行形態(tài)學-解剖學、化學次生代謝產(chǎn)物的研究和分子系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.1 形態(tài)-解剖觀察和次生代謝產(chǎn)物的測定

利用體視解剖鏡(SZM45)和標準光學顯微鏡(Nikon Eclipse Ni)進行形態(tài)學和解剖學研究。使用解剖鏡對地衣體和子囊盤各部位的特征進行觀察,如:是否具有前地衣體、地衣體顏色、地衣體形狀、子囊盤類型、大小、子囊盤粉霜的有無、分生孢子器的有無等,并做好描述和記錄。

通過光學顯微鏡觀察子囊盤特征,其對做好的切片分別用蒸餾水,KOH(K,10%的鉀溶液)[13]和HNO3(N,68%的硝酸溶液),觀察在子實層和皮層中的顆粒在K溶液和N溶液中的溶解程度和顏色變化。使用化學顯色反應法(color test)和薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)對地衣次生代謝產(chǎn)物進行觀察和檢測。顯色反應操作步驟如下:在解剖鏡下,將用KOH [10%的氫氧化鉀溶液](K)、次氯酸鈣 [次氯酸鈣的飽和水溶液](C)、KC [氫氧化鉀溶液與次氯酸鈣溶液的混合液逐一進行滴加,即先加氫氧化鉀溶液隨后添加次氯酸鈣溶液]、對苯二胺 [對苯二胺的無水乙醇飽和溶液](PD)等化學試劑用毛細管滴到地衣體和子囊盤等不同部位,在顯微鏡下觀察顏色變化(觀察顏色變化并記錄有無顏色變化情況,若產(chǎn)生顏色變化記錄“+顏色”,若無顏色變化記錄為“-”);薄層色譜法用標準溶劑系統(tǒng)C(甲苯∶乙酸=200 mL∶30 mL)[14]。根據(jù)顯色反應結果和薄層層析結果檢索資料對照,確定所含地衣酸的種類。

1.2.2 DNA提取,擴增和測序

為了得到高純度的DNA利用Ezup柱真菌基因組DNA純化試劑盒,并按照操作指南進行DNA提取步驟。擴增的目的基因片段選取為rDNA-ITS和mtSSU,采用了引物ITS1F[15]5-CTTGTTCATTTAGAGGAAGTAA-3和ITS4[16]5-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3,mrSSU1[17]5-AGCAGTGA-GGAATATTGGTC-3和mrSSUR3[17]5-ATGTGGCACGTCTATAGCCC-3。PCR反應體系為25 μL:2 μL模板DNA、上下引物(10 μmol/L)各0.5 μL、12.5 μL Taq PCR master mix和9.5 μL雙蒸餾水。ITS位點PCR擴增反應程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,5個循環(huán),94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個循環(huán),72 ℃延伸5 min。mtSSU位點PCR擴增反應程序:94 ℃預變性10 min,95 ℃變性45 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,34個循環(huán),72 ℃延伸 10 min。觀察電泳結果,條帶是否明亮清晰,是否單條,最后將合格的PCR產(chǎn)物由上海生工公司完成測序工作。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育構建

構建柳茶漬組與相關類群的系統(tǒng)發(fā)育樹。其構建步驟:測序成功的序列的剪切和拼接使用了SeqManII (DNASTAR)軟件[4],序列對比使用了NCBI中的Blast進一步確定測序結果是否屬于茶漬屬,使用Muscle v5.0.1.102進行序列比對[18],通過Gbolocks (PhyloSuite_v1.2.2)進行序列不對齊和模糊區(qū)域剪切[19]。在PhyloSuite v1.2.2中,先把每個物種對應的ITS和SSU序列進行拼接,通過貝葉斯推理(BI)方法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。BI分析在MrBayes v 3.2.7中進行,并且根據(jù)Akaike信息標準(AIC)在ModleFinder中選擇了最佳模型,其模型為ITS:GTR+F+G4,SSU:GTR+F+I+G4,運行105代數(shù),最后對各分支進行后驗概率分析(posterior probability,PP)[20],舍棄樹總數(shù)的25%,選出最優(yōu)系統(tǒng)發(fā)育樹,并其使用Itol(https://itol.embl.de/)在線編輯軟件進行可視化和編輯,使用AI和Photoshop(PS,2020)進行進一步的美化。參與分析的序列包括自測序列和GenBank中下載的序列(表1)。

表1 地衣的物種、國家、引證標本和基因庫號以及新序列以粗體顯示

2 結果與分析

2.1 分類單元

本研究共鑒定出3個柳茶漬組地衣物種,分別為:亞異茶漬,櫟生茶漬,針葉茶漬。所獲得的物種形態(tài)-解剖特征描述如下:

2.1.1 亞異茶漬

亞異茶漬LecanorasubravidaNyl.,Flora, Regensburg 55: 250 (1872),見圖1。地衣體發(fā)育良好,通常是細顆粒殼狀,黃色,灰黃色,黃褐色或完全是灰色,無粉霜,有時地衣體不明顯;未發(fā)現(xiàn)下地衣體;子囊盤茶漬型,數(shù)量眾多,圓至不規(guī)則,單生或聚生(2～3個子囊盤),無柄,直徑0.4～1.0 (-1.2) mm;盤面呈黃色,黃綠色至橙色,褐色,極少黑色,具輕微的粉霜或無粉霜;盤緣存在,光滑、全緣至略微波狀,無粉霜,與地衣體同色或稍微蒼白;果殼存在,皮層與藻胞層界限明顯,藻胞層呈連續(xù);皮層具有顆粒(偏振光可見)且完全溶解于K溶液,向?qū)挾葹?0～35 μm,縱向高度為45～65 μm,含有絲狀的菌絲;子實上層呈褐色至黑棕色,含有明顯至不明顯的顆粒且完全溶解于K溶液;子實層透明,厚度可達50～75 μm;子實下層透明,厚度可達25～45 μm;囊層基明顯,無色,含有眾多的菌絲(加K溶液更加明顯);側絲單一,基部稍微分支,不著色;子囊棍棒狀,具茶漬型頂器,孢子8孢,單胞,橢圓形,大小在(5～11) μm×(4.5～7.5) μm之間;未發(fā)現(xiàn)分生孢子器。

顯色反應:地衣體和子囊盤邊緣K-或+黃色,C-,KC-,P+黃色;盤面K-, C-, KC-, PD-。

次生代謝產(chǎn)物:松羅酸(usnic acid),茶痂衣酸(psoromic acid)。

生長基物:樹皮上。

標本印證:新疆巴音郭楞自治州河靜縣貢乃斯林場,2016-07-07,2 660 m,43°11′78″N,84°20′14″E,熱衣木·馬木提,20161915,20138156,2016723,20169889,20163276;新疆巴音郭楞自治州河靜縣貢乃斯林場,2013-07-06,2 660 m,43°17′58″N,84°11′14″E,熱衣木·馬木提,20132604,20138159,20138120,20138104,20137322,20137285,20132604,20132646,20132615,20132623,20132636。

世界分布:歐洲、伊朗[3,10]。

討論:亞異茶漬是樹皮上最常見的附生地衣之一。初次于1872年被Nylander報道并進行了簡要描述,但未對其命名[15],2001年Printzen[9]認為該種是異茶漬的亞種:L.varia(Hoffm.) Ach. var.subravida(Nyl) Nyl。

該物種由于地衣體和子囊盤顏色變異性較大為特征使其容易被誤認為與它密切其他物種,通常與異茶漬組的物種密切相關,它們經(jīng)常生長在相同的棲息地。因此,在野外觀察時,這些物種也經(jīng)常混淆。亞異茶漬與異茶漬的外部形態(tài)密切相關,其亞異茶漬的子囊盤中通常有輕微的粉霜,但后者的子囊盤多為赭色至深棕色或黑色,通常是具厚重的粉霜[21]。它們也可以通過孢子形狀區(qū)分開來,前者為寬橢圓形,后者多為長橢圓形[21]。該物種由于顯色反應和所包含的地衣酸(茶痂衣酸)等特征也常與其他柳茶漬組的其他物種容易區(qū)分。

2.1.2 櫟生茶漬

櫟生茶漬LecanoraquercicolaCoppins &P.James,見圖2。地衣體不明顯,發(fā)育不良或僅在子囊盤基部;子囊盤茶漬型,數(shù)量較多,單生,幾乎不聚生,貼生,直徑0.2～0.5 mm;盤面呈棕色,紅棕色或污棕色,具輕微粉霜,幼小時盤面完全不明顯,成熟時變扁平;邊緣存在,全緣,有時呈不明顯的波狀,無粉霜,與盤面平齊,黃色或與盤面同色;果殼存在,皮層與藻胞層分層不太明顯,藻胞層呈連續(xù);皮層較薄,具有在偏振光下可見的黃色顆粒物種,顆粒溶于K溶液不溶于N溶液;子實上層呈褐色至橄欖色,具有明顯至不明顯的黃色顆粒,有時可蔓延到子實層部分;子實層透明,厚度可達35～50 μm;子實下層無色,高約達15～35 μm;囊層基無色,厚度可達15～40 μm,含有不規(guī)則排列的菌絲;側絲單一,不分枝或底部稍微分支,頂端稍微平大,頂部不明顯著色;子囊8孢,寬棒狀至棒狀,具茶漬型頂器;孢子單胞,橢圓形,無暈圈,含有2～3個油滴,大小在(4～6.5) μm×(3.5～4) μm之間;未發(fā)現(xiàn)分生孢子器。

顯色反應:子囊盤盤邊緣K+, C-, KC-, PD-; 盤面 K-, C-, KC-, PD-。

次生代謝產(chǎn)物:松羅酸(usnic acid)。

生長基物:朽木上。

標本印證:新疆巴音郭楞自治州河靜縣貢乃斯林場,2013-07-30,2 660 m,43°11′58″N,84°20′14″E,熱衣木·馬木提,20217014,20138112。

世界分布:歐洲[10]。

討論:櫟生茶漬與LecanoraalbellulaNyl.形態(tài)解剖十分形似,二者的細微特征差異在于櫟生茶漬的子囊盤較小(可達0.5 mm),子囊盤邊緣和皮層結構較薄,子囊和子囊孢子相當小,子囊孢子大小為(4～6.5) μm×(3.5～4) μm之間,而且通常子囊孢子含有2～3個油滴,然而后者物種具有通常具有疣狀地衣體和明顯凸起且具輕微粉霜的子囊盤,此外L.albellula主要的次生代謝產(chǎn)物是異松蘿酸(isousnic acid)[10]。

2.1.3 針葉茶漬

針葉茶漬LecanoraconiferarumPrintzen, Bryologist 104(3): 393 (2001),見圖3。地衣體明顯,殼狀,發(fā)育良好,顆粒至疣狀,表面呈灰色,黃灰色或灰白色或黃綠色,無粉霜,厚度可達0.1～0.2 mm;未發(fā)現(xiàn)下地衣體;子囊盤茶漬型,眾多,單生至聚生,無柄,圓形至不規(guī)則,直徑0.4～1.2 (1～5) mm;盤面呈黃棕色,棕色至紅棕色,具輕微灰白色至白色粉霜或裸露,幼小時呈杯狀,成熟時變扁平;邊緣明顯,全緣,有時呈波狀,黃白色或與地衣體同色或稍微蒼白,幾乎無粉霜;果殼存在,皮層和藻胞層界限明顯,藻細胞密集分布于藻胞層,連續(xù);皮層分層明顯,較薄,基部具有疏絲狀排列的菌絲,具有黃色顆粒(偏振光下可見)且溶于K溶液和不溶于N溶液,向?qū)挾葹?5～25 μm,縱向高度為35～60 μm;子實上層呈褐色至橄欖色或深棕色,顆粒物種可見或不明顯,完全溶于K溶液且不溶于N溶液;子實層透明,厚度可達40～100 μm;子實下層透明,較薄但界限明顯,厚度可達20～45 μm;囊層基無色,具有明顯可見的菌絲,厚度可達20～75 μm;側絲基部嚴重分支,不含色素,頂端無膨大;子囊8孢,棍棒狀,具茶漬型頂器;孢子單胞,透明,橢圓形,無暈圈,大小在(7～12) μm×(4.5～7.5) μm之間;未發(fā)現(xiàn)分生孢子器。

A-B. 地衣體和子囊盤的外部形態(tài)結構;C. 子囊盤縱切解剖結構;D. 子囊盤縱切解剖偏振光下;E.子囊盤縱切解剖KOH溶液處理;F. 子囊;G. 子囊孢子。

顯色反應:地衣體與子囊盤盤邊緣K+黃色,C-,KC-,PD-;盤面K-或+黃色,C-,KC-,PD-。

次生代謝產(chǎn)物:松羅酸(usnic acid)。

生長基物:朽木上。

標本印證:新疆巴音郭楞自治州河靜縣貢乃斯林場,2013-07-30,2 660 m,43°11′58″N,84°20′14″E,熱衣木·馬木提,20138154,T2022925,20138159。

世界分布:北美洲[9]。

討論:該物種以它的外部形態(tài)特征很容易跟異茶漬組的物種和其他柳茶漬組的其他物種混淆。本種主要特征是具有發(fā)育良好的顆粒至疣狀的地衣體,皮層和藻胞層界限非常明顯,且皮層局部含有溶于K溶液不溶于N溶液的黃色顆粒。針葉茶漬十分相似與LecanoraconizaeoidesCrombie,但主要區(qū)別在于后者子囊盤無粉霜,裸露且具有加厚的盤緣,在地衣體上局部或整個表面上具有黃色或綠色的粉芽,且變成粉末狀。此外,子實上層的顆粒物種緩慢溶解于N溶液。針葉茶漬在化學物質(zhì)上也不同于L.conizaeoides,L.conizaeoide含有富馬酸,并與P+反應成紅色至橙色[21]。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定和分析該研究中的3個物種在茶漬屬中的進化位置選擇了2個基因位點(ITS和mtSSU)構建柳茶漬組和類似物種的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的27個ITS,21個SSU序列和自測的2個ITS序列,3個SSU序列進行分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析?；谇叭说南到y(tǒng)發(fā)育研究[3],原類梅屬[石墻原類梅P.muralis(Schreb.) M. Choisy]物種被選為外群。從貝葉斯推理(BI)進化樹可見異茶漬組(Lecanoravariagroup)以良好的支持率與柳茶漬組形成了姊妹分支。

從系統(tǒng)發(fā)育樹結果可知,亞異茶漬標本序列與Genbank中的亞異茶漬標本序列聚為一支,其支持率為PP=1。櫟生茶漬與亞異茶漬的標本序列形成小分支,說明這2個物種親緣關系比較接近,支持率為PP=0.75。圖4顯示,針葉茶漬地衣序列與LecanoramughicolaNyl.的序列聚在1個小分支,由于針葉茶漬地衣的ITS序列缺失,本文中采用了該物種的SSU序列,支持率為PP=0.56,表型特征與柳茶漬組地衣的特征的完全符合性,進一步確認了本種在柳茶漬組的系統(tǒng)發(fā)育位置。所得支持率展示在于樹枝對應的分支內(nèi),本研究鑒定的物種名序列以加黑形式呈現(xiàn)。

圖4 基于貝葉斯推理(BI)并從粗體中的分支推斷出的柳茶漬組及其相關物種的系統(tǒng)發(fā)育樹,收到最大似然引導圖和貝葉斯后驗概率(PP值在分支上方)