ATP檸檬酸裂合酶在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

于華婧 魏路陽(yáng) 劉姍姍 張忠濤 管成劍

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（82103484、82200964）、北京市自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（7214218）、北京市博士后工作經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2022-ZZ-004）、北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃項(xiàng)目（KM202110025015）、北京市醫(yī)院管理中心青苗計(jì)劃（QMS20230116）和中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助（2023M732411）

摘要：目的? 探究ATP檸檬酸裂合酶（ACLY）在肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展中的作用及其對(duì)HCC免疫微環(huán)境的影響。方法? 采用美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站和腫瘤基因表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫(kù)在線檢索ACLY在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的不同腫瘤中的表達(dá)情況和預(yù)后改變，選取HCC為疾病模型，分析ACLY在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)HCC標(biāo)本中的表達(dá)情況，并采集HCC患者臨床標(biāo)本在mRNA、蛋白水平進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證；同時(shí)在細(xì)胞水平敲減ACLY，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析差異表達(dá)基因，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等功能驗(yàn)證；探討ACLY與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞及免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，以及與免疫新抗原、免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性。結(jié)果? ACLY基因在包括HCC在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中高表達(dá)（P均<0.05），且ACLY高表達(dá)與HCC的總體存活率具有顯著相關(guān)性（P=0.005）。ACLY的高表達(dá)可影響包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞的數(shù)量以及脂代謝基因的表達(dá)（P均<0.05）。結(jié)論? ACLY與HCC的發(fā)生發(fā)展及脂代謝異常密切相關(guān)，并對(duì)HCC的免疫微環(huán)境造成一定程度的影響。

關(guān)鍵詞：ATP檸檬酸裂合酶；肝細(xì)胞癌；腫瘤微環(huán)境；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；預(yù)后分析

中圖分類號(hào)： R735.7? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1000-503X（2023）05-0743-09

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15590

Expression and Clinical Significance of ATP Citrate Lyase in Hepatocellular Carcinoma

YU Huajing，WEI Luyang，LIU Shanshan，ZHANG Zhongtao，GUAN Chengjian

Department of General Surgery，National Clinical Research Center for Digestive Diseases，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Corresponding author：GUAN Chengjian? Tel：010-63138689，E-mail：guanchengjian@mail.ccmu.edu.cn

ABSTRACT：Objective? To investigate the role of ATP citrate lyase（ACLY）in the development of hepatocellular carcinoma（HCC）and the impact of this enzyme on the immune microenvironment of HCC.Methods? We utilized the University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal and the Gene Expression Profiling Interactive Analysis to identify the changes in ACLY expression and prognosis across different tumor types from The Cancer Genome Atlas.With HCC as the disease model，we analyzed the ACLY expression in HCC samples from the gene expression database.Furthermore，we collected the clinical specimens from HCC patients to verify the mRNA and protein levels of ACLY.In addition，we conducted transcriptome sequencing after knocking down the expression of ACLY to analyze the differentially expressed genes and investigated the impact of ACLY expression interference on cell proliferation and other functions.Finally，we explored the correlations of ACLY with immune cells and immune infiltration in the tumor microenvironment，new antigens，and immune checkpoint genes.Results? ACLY expression was significantly up-regulated in solid tumors including HCC（all P<0.05），and high ACLY expression was associated with overall survival rate in HCC（P=0.005）.Furthermore，high ACLY expression affected the presence of immune cells（e.g.，tumor-associated fibroblasts）and the expression of genes involved in lipid metabolism（all P<0.05）.Conclusions? ACLY is closely related to the occurrence and development of HCC and lipid metabolism abnormalities.Moreover，it has a specific impact on the immune microenvironment of HCC.

Key words：ATP citrate lyase；hepatocellular carcinoma；tumor microenvironment；transcriptome sequencing；prognosis

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：743-751

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，晚期HCC患者的5年總體生存率僅為10%，全球范圍內(nèi)每年有超過(guò)70萬(wàn)人因HCC死亡，并且近年來(lái)發(fā)病率有上升趨勢(shì)［1］。HCC的發(fā)病率和死亡率存在顯著地區(qū)差異，基于人種特異性的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明［2］。近年來(lái)，隨著代謝組學(xué)以及免疫治療的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明代謝調(diào)控在包括HCC在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展和免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。然而HCC發(fā)生發(fā)展背后的代謝調(diào)控和免疫機(jī)制十分復(fù)雜，仍然需要研究者們進(jìn)一步的探究［3-5］。ATP檸檬酸裂合酶（ATP citrate lyase，ACLY）是人體肝臟中脂肪酸和膽固醇代謝通路的核心調(diào)控酶。最新研究發(fā)現(xiàn)，ACLY在生物體內(nèi)以不同構(gòu)象的形式發(fā)揮介導(dǎo)乙酰輔酶A生成的關(guān)鍵作用，以維持細(xì)胞正常的能量代謝［6-10］。ACLY在包括HCC在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)異常，造成代謝重編程，然而ACLY引起HCC細(xì)胞代謝重編程的調(diào)控機(jī)制以及是否與腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)還不完全清楚［11］。本研究采用生物信息學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的手段，探討ACLY在HCC臨床病理、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫微環(huán)境中的作用，旨在為臨床診治HCC開(kāi)拓新的方向。

資料和方法

ACLY差異表達(dá)分析? 采用美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析（the University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal，UALCAN）網(wǎng)站（https：//ualcan.path.uab.edu/）［12-13］和腫瘤基因表達(dá)譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線檢索ACLY在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cancergenome.nih.gov/）［14-15］收錄的33種不同腫瘤中的表達(dá)情況，并找到ACLY顯著差異表達(dá)的癌癥種類。選取HCC為疾病模型，研究ACLY的表達(dá)與功能。采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和R語(yǔ)言程序，分析ACLY對(duì)HCC預(yù)后的影響情況。同時(shí)，采用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收錄的GSE124535及GSE144269數(shù)據(jù)子集，使用R軟件分析ACLY在HCC進(jìn)展中的差異表達(dá)情況，結(jié)果以箱形圖呈現(xiàn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR? 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)HCC組織中ACLY mRNA表達(dá)水平。利用RNA抽提試劑Trizol（美國(guó)ThermoFisher公司）分別提取20對(duì)HCC患者的癌和癌旁組織的總RNA，采用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶（日本Takara公司）及SYBRTM Green PCR擴(kuò)增酶（美國(guó)ThermoFisher公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。所用引物由吉瑪基因（蘇州）股份有限公司合成，引物序列：ACLY上游引物：5-GGTCTCGTTGGGGTCAACC-3，下游引物5-GAA GGGCTCGATCAGAAAGTTC-3；β-actin上游引物5-TTTTGGCTATACCCTACTGGCA-3，下游引物5-CTGCACAGTCGTCAGCATATC-3。

Western blot檢測(cè)? 收集6對(duì)HCC患者癌和癌旁組織樣本，分別采用組織勻漿的方法提取每個(gè)樣本的總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白樣品，低溫下轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入1∶1000 ACLY單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）封入雜交袋，4 ℃孵育過(guò)夜，等滲緩沖鹽溶液洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，采用化學(xué)發(fā)光法顯影。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)? 將轉(zhuǎn)染小干擾ACLY-1（small interfering ACLY-1，siACLY-1）、siACLY-2及陰性對(duì)照的人肝癌HepG2細(xì)胞以1×103個(gè)／孔的密度接種于96孔板中，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，每孔加入100 μl CCK-8試劑稀釋液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，采用分光光度計(jì)檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。siACLY由利科麗（北京）生物科技有限公司合成，siACLY-1上游序列5-CGAGAAAGCUGA UCAAGAATT-3，下游序列5-UUCUUGAUCAGCUUUCUCGTT-3；siACLY-2上游序列5-GAGUGAAGU CGAUAAACAATT-3，下游序列5-UUGUUUAUCGA CUUCACUCTT-3。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序? 將轉(zhuǎn)染siACLY-1、siACLY-2及陰性對(duì)照的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到clean data用于后續(xù)分析。采用FPKM值定量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平。采用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性。采用R軟件中的edgeR包對(duì)樣品組間差異表達(dá)進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）集，表達(dá)量差異比以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示。校正差異顯著性P值并計(jì)算錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR），將FC≥2且FDR<0.05設(shè)為篩選有意義的差異基因的閾值。采用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genome.jp/kegg/）富集siACLY相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)通路，采用超幾何檢驗(yàn)分析通路富集的顯著性。

ACLY對(duì)HCC組織免疫微環(huán)境的影響? 通過(guò)Sangerbox在線分析平臺(tái)（http：//sangerbox.com）使用ESTMATE算法分析ACLY表達(dá)與不同腫瘤免疫浸潤(rùn)的關(guān)系；通過(guò)計(jì)算每個(gè)腫瘤樣本的新抗原數(shù)量［16］，探討ACLY表達(dá)與抗原數(shù)量的關(guān)系。P<0.05和R>0.2為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

ACLY在多種腫瘤中的表達(dá)情況及預(yù)后分析? 采用R軟件forestplot包對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中食管癌、胰腺癌、胃癌、直腸腺癌、結(jié)腸癌、HCC、膽管癌7種常見(jiàn)消化道腫瘤患者標(biāo)本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和相關(guān)的臨床信息進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ACLY與HCC的總體存活率（overall survival，OS）具有顯著的相關(guān)性（OR=1.63，95%CI=1.15～2.31，P=0.005）。采用R軟件ggplot2包對(duì)ACLY在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)不同癌和癌旁組織中mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ACLY在HCC等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)（P均<0.05）（圖1）。

ACLY在HCC中的表達(dá)情況及驗(yàn)證? 采用UALCAN工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)371份HCC組織和匹配的50份癌旁組織中ACLY的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ACLY在HCC中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.001），且與組織病理學(xué)分級(jí)相關(guān)，Ⅲ期ACLY mRNA水平增高最為顯著（P<0.001）。采用R軟件ggplot2包對(duì)GEO的GSE124535和GSE144269數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ACLY在HCC中異常高表達(dá)（P均<0.001）（圖2）。

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果? 20對(duì)HCC及癌旁組織qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ACLY mRNA在HCC中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.001）（圖3A）；6對(duì)HCC及癌旁組織Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ACLY蛋白在HCC中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.001）（圖3B）。

ACLY敲減在HCC轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能分析? siACLY-1、siACLY-2和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，ACLY敲減引起HepG2細(xì)胞氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)的異常，導(dǎo)致HCC細(xì)胞的能量代謝障礙（圖4）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siACLY-1和siACLY-2組HepG2細(xì)胞的增殖能力明顯降低（1.406±0.015比1.685±0.005；t=29.99，P<0.001和1.101±0.007比1.685±0.005；t=110.67，P<0.001）。

ACLY表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性? 生存分析曲線結(jié)果顯示，ACLY高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后呈顯著正相關(guān)（HR=1.60，P=0.011）。

ACLY表達(dá)與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性? Sangerbox在線分析平臺(tái)分析結(jié)果顯示，ACLY表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)（P均<0.05），且在HCC中ACLY表達(dá)與成纖維細(xì)胞（R=0.19，P<0.001）、CD4+T細(xì)胞（R=0.11，P=0.031）、巨噬細(xì)胞（R=-0.48，P<0.001）和其他細(xì)胞（R=0.45，P<0.001）呈正相關(guān)（圖5）。

ACLY表達(dá)與免疫新抗原和免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性? 提取常見(jiàn)的免疫新抗原和免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因，分別計(jì)算其與ACLY的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示ACLY表達(dá)與HCC等多種不同類型腫瘤的免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平（P均＜0.05）和新抗原數(shù)量（P均＜0.05）呈正相關(guān)（圖6）。

討論

近10年來(lái)，盡管Ⅲ期臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)科學(xué)研究不斷深入，但HCC患者5年總體生存率仍然低于15%，并沒(méi)有顯著改善［1-3］。由于HCC進(jìn)展快速且隱匿，確診時(shí)多數(shù)患者伴有嚴(yán)重的肝硬化和肝功能損害［17-18］。此外，因受包括慢性乙型及丙型肝炎病毒感染、酒精攝入以及先天性代謝性疾病在內(nèi)等致病因素的影響，目前HCC的治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)［19-21］。多項(xiàng)研究表明代謝和免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)及生物活性的調(diào)節(jié)直接影響著HCC的發(fā)生發(fā)展，深入解析HCC相關(guān)蛋白質(zhì)功能以及其調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的分子機(jī)制已成為分子腫瘤學(xué)領(lǐng)域的重要科學(xué)問(wèn)題［22］。本研究發(fā)現(xiàn)ACLY在HCC中異常高表達(dá)，且能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞代謝過(guò)程和免疫微環(huán)境影響HCC的進(jìn)展，是一個(gè)潛在的HCC治療靶點(diǎn)。

代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，腫瘤細(xì)胞因需要滿足自身快速增殖的需要而發(fā)生代謝紊亂，了解腫瘤細(xì)胞代謝重編程的機(jī)制對(duì)于癌癥治療具有重要意義。ACLY作為脂代謝的重要代謝酶，能夠?qū)⑷人嵫h(huán)產(chǎn)生的檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)中的乙酰輔酶A和草酰乙酸鹽，是一種連接葡萄糖分解代謝和脂肪酸生成的關(guān)鍵生化酶［23-24］。乙酰輔酶A也是組蛋白乙?；揎椀墓w，提示ACLY可能是連接細(xì)胞代謝與表觀遺傳的重要靶點(diǎn)。但ACLY在調(diào)控肝癌代謝重編程中的作用、分子機(jī)制研究仍然較少。本研究經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和免疫微環(huán)境分析發(fā)現(xiàn)，ACLY通過(guò)引起HepG2細(xì)胞中氧化磷酸化代謝、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)異常，參與肝癌細(xì)胞免疫浸潤(rùn)過(guò)程，提示ACLY在HCC免疫微環(huán)境中可能發(fā)揮潛在的代謝調(diào)控作用，這可能是ACLY在HCC高表達(dá)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖能力的分子機(jī)制，然而ACLY如何將代謝小分子與免疫應(yīng)答相連接進(jìn)而參與HCC的發(fā)生發(fā)展還有待未來(lái)進(jìn)一步探討。

本研究探討了ACLY在HCC等多種腫瘤中的表達(dá)差異，并聚焦ACLY在HCC發(fā)生發(fā)展中的臨床意義，通過(guò)檢測(cè)臨床組織標(biāo)本中ACLY mRNA和蛋白水平變化，證實(shí)了其在HCC中顯著增加。并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了敲減ACLY可以引起肝細(xì)胞脂代謝基因的表達(dá)異常，抑制細(xì)胞的增殖能力。此外，從免疫微環(huán)境的角度闡述了ACLY與成纖維細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，揭示了其可能在免疫調(diào)控中發(fā)揮潛在作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，ACLY通過(guò)調(diào)控細(xì)胞代謝和免疫微環(huán)境參與HCC的發(fā)生發(fā)展，為HCC的代謝調(diào)控和免疫治療領(lǐng)域提供新的研究靶標(biāo)和理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-03-22）

勘? 誤

2023年第45卷第1期22～27頁(yè)《頸動(dòng)脈支架植入術(shù)后發(fā)生血流動(dòng)力學(xué)抑制的臨床預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建》一文，作者及單位更改如下：

范衛(wèi)東1，2，劉? 坤2，喬? 彤1

1南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院血管外科，南京 210008

2南京醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷第一人民醫(yī)院血管外科，江蘇宿遷 223800

FAN Weidong1，2，LIU Kun2，QIAO Tong1

1Department of Vascular Surgery， Drum Tower Clinical College of Nanjing Medical University， Nanjing 210008， China

2Department of Vascular Surgery， The Affiliated Suqian First People's Hospital of Nanjing Medical University， Suqian， Jiangsu 223800， China