基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的潛在靶點(diǎn)及核心靶點(diǎn)的驗(yàn)證*

馬澤冰，李汪洋，熊 輝

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南省中醫(yī)骨傷臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

桃紅四物湯出自清代吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒》，為“活血化瘀”的代表方劑。骨折早期骨斷筋傷、血溢脈外、氣血凝滯而致“血瘀證”。因此，骨折早期予桃紅四物湯最為相宜。研究[1-2]證實(shí)，骨折早期服用桃紅四物湯能明顯縮短骨折愈合時(shí)間，提高骨折修復(fù)效率。目前，關(guān)于桃紅四物湯促進(jìn)骨折愈合的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點(diǎn)不甚清楚。中藥復(fù)方具有多層次、多效應(yīng)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，從細(xì)胞和分子水平研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制存在一定困難[3]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可為中藥復(fù)方研究提供新的研究思路和解決辦法[4]。

中藥復(fù)方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過(guò)程包括5個(gè)步驟[5]：（1）識(shí)別中藥復(fù)方的有效活性成分；（2）識(shí)別中藥復(fù)方中活性成分的作用靶點(diǎn)；（3）識(shí)別中藥復(fù)方治療疾病的相關(guān)基因；（4）構(gòu)建可視化的“成分-基因-疾病”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)；（5）建立化合物與關(guān)鍵標(biāo)靶分子對(duì)接模型。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方研究的優(yōu)勢(shì)，本研究將通過(guò)此方法預(yù)測(cè)桃紅四物湯促進(jìn)骨折愈合的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點(diǎn)，并通過(guò)建立大鼠右側(cè)股骨干骨折模型，對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 桃紅四物湯活性化學(xué)成分篩選 桃紅四物湯由生地黃、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花6味中藥組成，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[6]（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分析平臺(tái)中分別輸入“生地黃”“當(dāng)歸”“赤芍”“川芎”“桃仁”“紅花”，檢索全部化學(xué)成分。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)特征，活性分子具有較好的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類(lèi)藥性（drug-likeness，DL），以O(shè)B≥30%和DL≥0.18篩選，獲得桃紅四物湯的活性化合物。

1.2 活性化合物靶基因的獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索桃紅四物湯活性化合物的靶基因。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[7]（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶基因標(biāo)準(zhǔn)化，獲得基因簡(jiǎn)稱（gene symbol）。

1.3 股骨干骨折疾病基因的篩選 在GeneCards[8]（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)輸入關(guān)鍵詞“femoral shaft fracture”，獲得股骨干骨折疾病基因，以相關(guān)系數(shù)（Score）≥4為過(guò)濾條件。

1.4 桃紅四物湯治療股骨干骨折潛在靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)Venny2.1軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)活性化合物靶基因和股骨干骨折疾病基因進(jìn)行映射，確定桃紅四物湯治療股骨干骨折的靶點(diǎn)。將靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)[9]（https://string-db.org），物種為“homo sapiens”，將“minimum required interaction score”設(shè)置為0.9，獲得蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用count.R軟件確定靶蛋白出現(xiàn)的頻次。

1.5 “藥物-成分-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 Cytoscape為構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)的生物信息分析軟件，其核網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）之間的連線（edge）代表分子間的相互作用[10]。把活性化合物、活性化合物靶基因、疾病基因?qū)隒ytoscape 3.6.0中，構(gòu)建“藥物-成分-基因-疾病”的網(wǎng)絡(luò)。

1.6 活性化合物與關(guān)鍵靶標(biāo)的分子對(duì)接 使用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行虛擬對(duì)接，研究桃紅四物湯的化合物活性成分與治療股骨干骨折的相關(guān)靶標(biāo)，說(shuō)明活性成分與靶標(biāo)蛋白作用機(jī)制的結(jié)合作用。采用Autodock 4.2.6進(jìn)行虛擬對(duì)接，運(yùn)行PyMOL 2.2.0、Discovery Studio Client v19.1.0軟件進(jìn)行可視化分析。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（120±10）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：430727221100472812。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，12 h晝12 h夜循環(huán)，滅菌飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查（LL20191010001）。

1.7.2 藥物與試劑 桃紅四物湯方藥組成：生地黃20 g，當(dāng)歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，桃仁20 g，紅花10 g。生地黃（產(chǎn)地：河南，批號(hào)：NY2001902）、當(dāng)歸（產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：NG19121701）、赤芍（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：NG19122401）、川芎（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：SL19112207）、桃仁（產(chǎn)地：新疆，批號(hào)：2019070204）、紅花（產(chǎn)地：新疆，批號(hào)：HY19121803）均購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并經(jīng)鑒定符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。按照成方比例稱取桃紅四物湯生藥材300 g，水煎兩次，定容，制備成生藥質(zhì)量濃度為2.4 g/mL的湯劑，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＬK木素染液（批號(hào)：G1004）購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；伊紅染液（批號(hào)：17372-87-1）購(gòu)于上海晶萊生物技術(shù)有限公司；中性樹(shù)膠（批號(hào)：G8590）購(gòu)于索萊寶生物技術(shù)有限公司；二甲苯（批號(hào)：1330-20-7）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸EDTA（批號(hào)：2015034）購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗體（批號(hào)：ab46154）、β-actin（批號(hào)：ab8227）、羊抗兔二抗（批號(hào)：ab6721）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；顯影液（批號(hào)：BW-61）購(gòu)于上海市佳信科技有限公司。

1.7.3 主要儀器 Multix Select DR型X-Ray（上海西門(mén)子醫(yī)療器械有限公司）；BA410T型顯微鏡（四川Motic公司）；BMJ-A型包埋機(jī)（常州中威電子儀器有限公司）；YD-315型切片機(jī)（浙江金華益迪公司）；DYY-6C型恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；RV-211M型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海恒一精密儀器有限公司）；TS-92型搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）；YT-CJ-2NB型超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）；Donatello型脫水機(jī)（意大利DIAPATH公司）。

1.7.4 分組與造模 將24只大鼠隨機(jī)分為模型組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯高劑量組，每組6只。所有大鼠均采用右側(cè)股骨干骨折造模法[11]制備模型大鼠，即大鼠麻醉后仰臥于無(wú)菌臺(tái)，右側(cè)大腿外側(cè)做2 cm縱向切口，可見(jiàn)大腿外側(cè)白色股骨前側(cè)肌群與后側(cè)肌群深筋膜聯(lián)合線；沿此處分離肌肉后拉鉤充分暴露視野，顯露股骨干后，使用迷你電摩機(jī)予股骨干中段橫向截?cái)?；以股骨干大小合適克氏針逆行于斷端處插入，并向近端推穿至股骨大轉(zhuǎn)子頂部。復(fù)位骨折后，克氏針遠(yuǎn)端推至股骨髁間處，并折斷多余克氏針，斷端埋于皮下，后75%乙醇消毒后縫合皮膚。（見(jiàn)圖1）

圖1 模型制備過(guò)程圖

1.7.5 實(shí)驗(yàn)藥物 大鼠的給藥劑量（D/g），由人與動(dòng)物體表面積（A/m2）換算公式[12]，D大鼠=D人×A大鼠/A人。根據(jù)Meeh-Rubner公式，A=K×（W2/3）/10.000，W大鼠=120 g，W人=70.000 g，K為系數(shù)（大鼠=9.1；人=10.6），D人=100 g，A大鼠/A人=0.012 29，D大鼠=100×0.012 29≈1.2 g。將成人臨床等效劑量1.2 g（生藥材）定為本實(shí)驗(yàn)的中劑量，以2倍濃度梯度分別增設(shè)低劑量和高劑量，各濃度劑量為：低劑量=5 g/kg；中劑量=10 g/kg；高劑量=20 g/kg。桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予5、10、20 g/（kg·d）桃紅四物湯，模型組大鼠灌胃給予等量蒸餾水。術(shù)后第1天開(kāi)始灌胃，2次/d，連續(xù)5 d。

1.7.6 觀察指標(biāo)

1.7.6.1 大鼠股骨干組織病理學(xué)觀察 第21天，分別采集4組大鼠右側(cè)股骨干骨折標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，將骨標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫鈣。以骨折端為中心，取長(zhǎng)約5 mm骨痂石蠟包埋、制作成厚度約4 μm切片。行HE染色和Masson 染色后，在顯微鏡下觀察，拍照。

1.7.6.2 Western blotting法檢測(cè)大鼠股骨干VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量 第5天采集右側(cè)股骨干骨折標(biāo)本，以骨折端為中心，取長(zhǎng)約5 mm骨痂，液氮下研磨成粉末狀，稱重后移入1.5 mL的EP管中，分別加入蛋白裂解液PIPA（7 μL/mg）和蛋白酶抑制劑PMSF（10 μL/mL），冰浴30 min，震蕩均勻，15 000 r/min（離心半徑為8.5 cm）離心5 min。取上清液0.5 mL移入EP管中，BCA法計(jì)算蛋白濃度。上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電壓160 V，60 min；硝酸纖維素膜（0.45 μm）轉(zhuǎn)膜，電流300 mA，60 min；室溫封閉40 min，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）兔抗體（1∶5 000）4 ℃孵育過(guò)夜，β-actin為內(nèi)參（1∶200）；次日，抗兔二抗（1∶3 000）室溫孵育60 min后，顯色并檢測(cè)VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。若各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布及方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析，采用LSD分析進(jìn)行多重比較；若方差不齊，采用Dunnett's T3分析。不符合正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 桃紅四物湯活性化合物成分篩選 經(jīng)檢索共得到764個(gè)化合物，其中生地黃76個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)，赤芍119個(gè)，川芎189個(gè)，桃仁66個(gè)，紅花189個(gè)。滿足OB≥30%，共有367個(gè)活性化合物，同時(shí)滿足OB≥30%和DL≥0.18，共有85個(gè)活性化合物。（見(jiàn)表1）

表1 桃紅四物湯中活性化合物的分布

2.2 桃紅四物湯標(biāo)靶基因篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索桃紅四物湯中活性化合物的靶基因，刪除無(wú)標(biāo)靶基因的活性化合物，共獲得44個(gè)活性化合物，對(duì)應(yīng)111個(gè)基因。（見(jiàn)表2）

2.3 股骨干骨折疾病基因靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到897個(gè)與股骨干骨折相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。按照相關(guān)系數(shù)≥4，得到394個(gè)疾病靶基因。使用Venny2.1繪制韋恩圖，將這394個(gè)疾病靶基因與桃紅四物湯的靶基因做交集。最終得到的28個(gè)共同靶基因可能為桃紅四物湯治療股骨干骨折的潛在作用靶點(diǎn)。（見(jiàn)圖2）

圖2 桃紅四物湯靶點(diǎn)與股骨干骨折靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “藥物-成分-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 28個(gè)靶基因?qū)?yīng)14個(gè)活性化合物，即川芎哚、β-谷甾醇、黃芩苷、鞣花酸、兒茶酸、花旗松素、芍藥苷、楊梅酮、葉酸、檞皮素、β-胡蘿卜素、山柰酚、赤霉素87、自由酸。（見(jiàn)表3）將桃紅四物湯中活性化合物與股骨干骨折靶基因?qū)隒ytoscape 3.6.0，構(gòu)建“桃紅四物湯-成分-基因-股骨干骨折”可視化網(wǎng)絡(luò)。（見(jiàn)圖3）

表3 桃紅四物湯中活性化合物與對(duì)應(yīng)靶基因

2.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及獲取關(guān)鍵靶標(biāo) 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)建立靶標(biāo)蛋白之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，將“minimum required interaction score”設(shè)置為0.9構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。（見(jiàn)圖4）共得到28個(gè)節(jié)點(diǎn)，118條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)為8.43，平均局部聚集指數(shù)為0.675。以所有靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)“degree”為參考，“degree”越大說(shuō)明該靶蛋白越重要，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）節(jié)點(diǎn)度值最高。（見(jiàn)表4）此外，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)VEGF與其他18個(gè)蛋白有作用關(guān)系。據(jù)此，推測(cè)VEGF可能為桃紅四物湯治療股骨干骨折的關(guān)鍵靶點(diǎn)。（見(jiàn)表5）

表4 桃紅四物湯與股骨干骨折共同靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值

表5 VEGF 與其他靶點(diǎn)之間的相互作用

圖4 桃紅四物湯治療股骨干骨折潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6 活性化合物-關(guān)鍵靶基因分子對(duì)接 通過(guò)上述分析得出VEGF為桃紅四物湯治療股骨干骨折的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中β-胡蘿卜素、黃芩苷與VEGF具有結(jié)合活性，同時(shí)β-胡蘿卜素與黃芩苷為桃紅四物湯治療股骨干骨折的核心活性化合物。因此采用Autodock 4.2.6將化合物β-胡蘿卜素、黃芩苷與VEGF關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行虛擬對(duì)接，對(duì)接過(guò)程中只改變配體的構(gòu)象，而保持蛋白構(gòu)象不變，其余所有參數(shù)均采用默認(rèn)值。對(duì)接結(jié)果通過(guò)PyMOL 2.2.0，Discovery Studio Client v19.1.0軟件進(jìn)行可視化分析。結(jié)果顯示，VEGF與β-胡蘿卜素對(duì)接后可與HIS20、ILE22、LEU25、PRO33形成氫鍵作用力，且形成氫鍵作用力越多結(jié)合越穩(wěn)定。（見(jiàn)圖5a）VEGF與黃芩苷對(duì)接后可與TYR38、GLY81形成氫鍵作用力。（見(jiàn)圖5b）

圖5 VEGF 與β-胡蘿卜素、黃芩苷分子對(duì)接可視化分析

圖6 骨折21 d 后各組大鼠股骨干病理切片圖

2.7 各組大鼠股骨干病理學(xué)改變情況 100倍鏡下觀察顯示：模型組大鼠骨標(biāo)本可見(jiàn)骨痂內(nèi)軟骨面積（M）較大，類(lèi)骨質(zhì)無(wú)明顯增加。與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠骨痂內(nèi)軟骨面積（M）明顯縮小，且呈劑量依賴性，類(lèi)骨質(zhì)增加。400倍鏡下觀察顯示：模型組大鼠骨痂內(nèi)以軟骨細(xì)胞為主，呈不同凋亡狀態(tài)，可見(jiàn)散在的成軟骨細(xì)胞及周?chē)浌腔|(zhì)；桃紅四物湯低劑量組大鼠骨痂內(nèi)以軟骨細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量的成骨細(xì)胞；桃紅四物湯中劑量組大鼠骨痂內(nèi)以成骨細(xì)胞為主，未見(jiàn)軟骨細(xì)胞，可見(jiàn)少許的骨細(xì)胞；桃紅四物湯高劑量組大鼠骨痂內(nèi)可見(jiàn)大量成骨細(xì)胞，在骨痂周邊的成骨細(xì)胞被基質(zhì)包埋形成骨陷窩，轉(zhuǎn)化為靜止期的骨細(xì)胞。桃紅四物湯干預(yù)后，肥大的軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，軟骨細(xì)胞凋亡加快，膠原纖維分泌增加，骨痂骨化進(jìn)程明顯加快，以桃紅四物湯高劑量組最明顯。

2.8 各組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與模型組比較，桃紅四物湯中、高劑量組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），其中高劑量桃紅四物湯作用最為顯著；桃紅四物湯低劑量組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表6、圖7）

表6 各組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表6 各組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 n VEGF/β-actin模型組 6 0.566±0.050桃紅四物湯低劑量組 6 0.686±0.080桃紅四物湯中劑量組 6 0.973±0.140a桃紅四物湯高劑量組 6 1.087±0.111a F 18.210 P 0.002

圖7 各組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

3 討 論

桃紅四物湯以桃仁、紅花為主藥，突出其活血化瘀之旨；輔以血中之血藥的生地黃、赤芍，以及血中之氣藥的當(dāng)歸、川芎，調(diào)暢氣血，以助活血化瘀之功。本方活血不傷正，為“活血化瘀”之平劑，主治“血瘀證”。骨折早期，骨斷筋傷，絡(luò)脈受損，血溢脈外，離經(jīng)之血瘀滯于肌膚腠理而致血瘀證。桃紅四物湯活血化瘀最為相宜。后世歷代傷科專(zhuān)著所載眾多治傷名方，多隨此方加減化裁，為活血化瘀法治療骨折的代表方劑。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興分支學(xué)科，可系統(tǒng)地對(duì)中藥復(fù)方中的活性化合物及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究篩選桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的14個(gè)活性化合物，包括β-谷甾醇、黃芩苷、鞣花酸、兒茶素、川芎哚、山柰酚、楊梅酮、芍藥苷、葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、自由酸、赤霉素87、花旗松素。這些化合物靶向VEGF、IL6、TP53、JUN、CTNNB1、TNF、TGFB1、ALB、CASP3、ESR1、MMP9、PPARG、FOS、AR、CAV1、IGF2、MMP2、HIF1、AF3、CAT、F2、NOS2、BCL2、ESR2、GJA1、CA2、CDKN1B、IFG2R等28個(gè)基因。本研究對(duì)這些靶基因進(jìn)行蛋白交互作用分析發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與其他18個(gè)蛋白存在相互作用，處于整個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)的核心，為桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的關(guān)鍵靶點(diǎn)?；谥兴帞?shù)據(jù)庫(kù)分析，黃芩苷和β-胡蘿卜素可直接靶向VEGF。有研究表明，β-胡蘿卜素能增加VEGF的水平[13]，并促進(jìn)血管新生[14]。大量臨床循證研究報(bào)道，β-胡蘿卜素能保護(hù)中老年人髖部骨折[15]，增加血清β-胡蘿卜素，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)[16]。此外，黃芩苷可通過(guò)增加microRNA-217的表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[17]，并調(diào)節(jié)雌激素受體信號(hào)通路的表達(dá)和血管新生[18]。因此，黃芩苷和β-胡蘿卜素可能是桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的關(guān)鍵活性化合物。

骨折早期的炎癥反應(yīng)是啟動(dòng)骨折愈合的首要因素。骨組織受到損傷后，局部缺血和缺氧造成血管通透性增加，釋放大量細(xì)胞因子，刺激細(xì)胞從骨髓或外周組織動(dòng)員并遷移至損傷區(qū)域，啟動(dòng)骨折的修復(fù)過(guò)程[19]。前期研究通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組已證明桃紅四物湯早期干預(yù)可以促進(jìn)骨折愈合[20-21]，且本研究為探究桃紅四物湯促進(jìn)骨折的作用機(jī)制，故未再次設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組。本研究建立右側(cè)股骨干骨折大鼠模型，以桃紅四物湯在早期連續(xù)干預(yù)骨折大鼠5 d后，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯中、高劑量組大鼠早期骨痂內(nèi)VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，具有劑量依賴性。從組織學(xué)上觀察，桃紅四物湯能促進(jìn)骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞大量凋亡，使成骨細(xì)胞增多，骨基質(zhì)分泌增加，且藥物劑量越高其作用越顯著。因此，骨痂內(nèi)VEGF可能是桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的核心靶點(diǎn)。

骨折愈合是骨形成與血管生成相互作用的過(guò)程。VEGF是血管形成的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，能在骨折早期促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)已有血管的再生（血管新生）和新血管的生長(zhǎng)（血管發(fā)生）[22]。VEGF還能擴(kuò)張骨髓內(nèi)竇狀毛細(xì)血管[24]和增加黏著斑和應(yīng)力纖維的數(shù)目[23]，促進(jìn)炎癥期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至骨痂處參與骨再生。此外，新生的血管通過(guò)分泌骨形成因子誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[24]，而間充質(zhì)干細(xì)胞及分化后的成骨細(xì)胞可通過(guò)分泌VEGF促進(jìn)血管新生，使得VEGF在骨折早期修復(fù)過(guò)程中啟動(dòng)血管生成并調(diào)控骨形成，將血管新生和成骨耦聯(lián)[25-26]。因此，VEGF可能為加速股骨干骨折愈合的核心靶點(diǎn)[27]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)和右側(cè)股骨干骨折大鼠模型的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的14個(gè)潛在靶點(diǎn)并驗(yàn)證了VEGF為促進(jìn)股骨干骨折愈合的關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時(shí)，黃芩苷和β-胡蘿卜素可直接靶向VEGF，可能為桃紅四物湯促進(jìn)股骨干骨折愈合的關(guān)鍵活性成分。