白芍總苷調(diào)控Nrf-2/HO-1信號通路對支氣管哮喘小鼠氣道重塑的影響

尹珊珊 馬 紅 姜 琦 （青海紅十字醫(yī)院小兒內(nèi)科，西寧 810000）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種復(fù)雜的氣道疾病，臨床較為常見，其特征為慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑，具有較高的發(fā)病率及病死率，已嚴(yán)重威脅全球人民的健康和生活［1］。氣道重塑是哮喘氣道高反應(yīng)性和肺功能障礙的主要原因，TGF-β1是一種在哮喘患者氣道中增多的生長因子，其失調(diào)對于氣道重塑至關(guān)重要［2-3］。據(jù)報(bào)道，TGF-β1 水平升高可促進(jìn)哮喘中支氣管上皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖，參與哮喘患者氣道重塑［4-5］，故TGF-β1 為降低哮喘發(fā)病率和病死率的潛在治療靶點(diǎn)。此外，氧化應(yīng)激功能障礙是氣道重塑的另一個關(guān)鍵觸發(fā)因素。已有研究證實(shí)氧化應(yīng)激會增強(qiáng)TGF-β1 誘導(dǎo)的ASMCs 細(xì)胞活力，抗氧化調(diào)節(jié)已成為近年來哮喘研究的熱點(diǎn)［6］。作為一種有效的抗氧化因子，核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf-2）水平與哮喘進(jìn)展密切相關(guān)［7］；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）是Nrf-2 的重要靶基因，具有抗炎和抗氧化特性，Nrf-2/HO-1 通路的激活可減弱氣道重塑［8］。因此，靶向氧化應(yīng)激也是氣道重塑介導(dǎo)的哮喘的潛在治療策略。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）為白芍的有效部位，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)［9-10］。TGP 在中國已被廣泛應(yīng)用于治療自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性接觸性皮炎等，是一種有前景的抗炎和免疫藥物［9，11-12］。研究顯示，TGP可下調(diào)TGF-β1表達(dá)，抑制心肌重構(gòu)［13］；還可顯著提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，對抗氧化應(yīng)激，防止糖尿病相關(guān)的腎損傷［14］。然而TGP 是否能抑制哮喘小鼠的氣道重塑還未可知。因此，本研究采用卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)建立小鼠支氣管哮喘模型，探究TGP 對模型小鼠氣道重塑的影響及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購入SPF 級雄性BALB/c 小鼠50 只，6～7 周齡，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于恒溫室，動物房溫度保持在（24±3） ℃，相對濕度40%～60%，并在可控制的光照下保持12 h/12 h 明暗交替。該研究得到青海紅十字醫(yī)院動物護(hù)理和使用委員會的批準(zhǔn)（202109001），并按照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 白芍總苷膠囊（帕夫林，寧波立華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20055058，規(guī)格0.3 g）；OVA（Sigma-Aldrich，A21772）；Nrf-2 抑制劑ML385（北京百奧萊博科技有限公司，M00240）；HE 染色試劑（C0105）、RIPA 裂解液（P0013B）、BCA試劑盒（P0010）均購自碧云天生物科技公司；AB-PAS染色試劑盒（G1285）購自北京Solarbio 公司；小鼠半胱 氨 酰 白 三 烯1（cysteinyl leukotriene 1，CysLT1）（ml058762）、TGF-β1（ml002115）ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；小鼠半胱氨酰白三烯受 體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）ELISA 試劑盒（KT-34072）購自美國Kamiya Biomedical 公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）檢測試劑盒（比色法，A015-1-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（比色法，A005-1-2）、SOD（WST-1 法，A001-3-2）、CAT（A007-2-1）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol（9108-1）、PrimeScriptTMRT 試劑盒（RR037A）、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（RR820A）購自日本TaKaRa；TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）和金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）的引物購自上海GenePharma 公司；兔源一抗TGF-β1（ab215715）、Nrf-2（ab137550）、HO-1（ab189491）、Lamin B1（ab16048）、GAPDH（ab181602）和二抗羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）購自英國Abcam公司。

iMark680 多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad 公司）；NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific 公 司）；ABI 7500 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；IX71 熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 將50 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分為對照組（Control 組）、模型組（OVA 組）、TGP低劑量組（TGP-L，460 mg/kg）、TGP高劑量組（TGP-H，920 mg/kg）、TGP+ML385 組（TGP 920 mg/kg+ML385 30 mg/kg）［15］，每組10 只。除Control 組外，其余各組小鼠參考文獻(xiàn)［16］方法采用OVA 致敏建立哮喘模型：分別在實(shí)驗(yàn)第1 天、第7 天腹腔注射0.2 ml OVA致敏液（4 mg OVA+150 μl 氫氧化鋁），從第21 天開始將小鼠置于霧化箱內(nèi)使用10%OVA 激發(fā)液（20 g OVA+200 ml 生理鹽水）進(jìn)行霧化，每周3 次，每次30 min，連續(xù)8 周；Control 組給予等量生理鹽水霧化。TGP 各劑量組在每次霧化前1 h 給予相應(yīng)劑量的TGP 混懸液灌胃，TGP+ML385 組在每次霧化前1 h 給予30 mg/kg 的ML385 和920 mg/kg 的TGP 灌胃，Control 組和OVA 組給予等量生理鹽水；各組均連續(xù)給藥8 周，最后一次激發(fā)24 h 后進(jìn)行取材和指標(biāo)檢測。

藥物劑量的換算：給藥劑量按成人平均體質(zhì)量70 kg 體表面積換算，小鼠體質(zhì)量按20 g 計(jì)，對應(yīng)給藥劑量為成人的9.1 倍；TGP 成人每日給藥劑量為3.6 g，則小鼠每日給藥劑量為460 mg/kg，因此設(shè)置低、高劑量藥物劑量為460、920 mg/kg。

1.2.2 小鼠一般狀態(tài)觀察 觀察致敏和激發(fā)前后各組小鼠的行為學(xué)變化，是否有氣促、呼吸困難、打噴嚏、煩躁不安、喘息等典型的哮喘癥狀。

1.2.3 小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥相關(guān)因子的測定 處死小鼠，75%乙醇浸泡2 min 后，行氣管插管，結(jié)扎右肺，用1 ml預(yù)冷的PBS緩慢沖洗小鼠左肺3次，合并3次灌洗液，紗布過濾去除黏液后離心（4 ℃、2 000 r/min離心10 min），取上清。按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組小鼠BALF中TGF-β1、CysLT1、CysLTR1水平。

1.2.4 小鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定 將小鼠左側(cè)肺組織按照1∶9 的比例加入生理鹽水研磨，2 500 r/min 離心10 min 后，取勻漿上清液，按照試劑盒說明書檢測肺勻漿中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.2.5 小鼠肺組織病理學(xué)變化 取小鼠右肺上葉組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE 和AB-PAS 染色，觀察氣道周圍炎癥細(xì)胞的浸潤情況及杯狀細(xì)胞分泌黏液情況；并對各組肺組織進(jìn)行病理學(xué)分級評分；每只小鼠肺切片任取5 個獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行評分，取平均值。評分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 肺組織HE和AB-PAS染色評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Lung tissue HE and AB-PAS staining scoring standards

1.2.6 RT-qPCR 檢 測 肺 組 織TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表達(dá) 取小鼠右肺中葉組織，使用TRIzol 從各組織中提取總RNA，NanaDrop 分光光度計(jì)檢測總RNA 的濃度和純度；然后按照試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μl）：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12 μl，正反向 引 物 各0.5 μl，cDNA（200 ng/μl） 1 μl，ddH2O 11 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，進(jìn)行40 個循環(huán)。以GAPDH 作為對照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Tab.2 RT-qPCR primer sequences

1.2.7 Western blot檢測肺組織TGF-β1/Nrf-2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取小鼠右肺下葉組織，使用含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白（用于TGF-β1、HO-1 檢測），并采用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)（用于Nrf-2檢測），然后使用BCA 檢測試劑盒進(jìn)行定量。將樣品在98 ℃下加熱5 min 變性，取等量蛋白質(zhì)樣品（30 μg/孔）加至10%SDS-PAGE 凝膠上行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗（TGF-β1、Nrf-2、HO-1，1∶1 000；GAPDH、Lamin B1，1∶2 000）于4 ℃下孵育過夜，次日，將膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL 顯色。以GAPDH、Lamin B1 為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0、GraphPad Prism 8.0 和Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般狀態(tài) 致敏階段：各組小鼠表現(xiàn)均正常，各組間無差異。激發(fā)階段：OVA 組小鼠出現(xiàn)典型的哮喘癥狀，如打噴嚏、煩躁不安、喘息等，而TGP-L 組和TGP-H 組小鼠的哮喘癥狀較OVA組明顯減輕，且TGP-H 組小鼠哮喘癥狀的改善程度優(yōu)于TGP-L 組；TGP+ML385 組小鼠的哮喘癥狀較TGP-H組加重，Control組小鼠表現(xiàn)正常。

2.2 各組小鼠BALF 中TGF-β1、CysLT1、CysLTR1水平 與Control 組相比，OVA 組小鼠BALF 中TGFβ1、CysLT1、CysLTR1 水平顯著升高（P＜0.05）；與OVA 組相比，TGP-L 組和TGP-H 組小鼠BALF 中上述指標(biāo)水平顯著降低（P＜0.05），與TGP-H 組相比，TGP-L 組和TGP+ML385 組上述指標(biāo)水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠BALF中炎癥相關(guān)因子水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of inflammatory-related factors in BALF of mice in each group （±s，n=10）

表3 各組小鼠BALF中炎癥相關(guān)因子水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of inflammatory-related factors in BALF of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

CysLTR1/（ng·ml-1）11.36±2.15 34.74±4.011）23.53±3.291）2）3）17.58±2.301）2）29.86±3.471）2）3）Groups TGF-β1/（pg·ml-1）Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 171.29±24.04 336.50±37.591）292.31±31.251）2）3）247.76±30.451）2）328.14±35.131）3）CysLT1/（ng·ml-1）16.53±2.86 45.61±4.471）33.42±5.181）2）3）22.70±3.521）2）40.39±4.201）3）

2.3 各組小鼠肺勻漿中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性 與Control 組相比，OVA 組小鼠肺勻漿中TAOC、SOD、GSH-Px、CAT 活性顯著降低（P＜0.05）；與OVA 組相比，TGP-L 組和TGP-H 組小鼠肺勻漿中上述指標(biāo)的活性均顯著升高（P＜0.05）；與TGP-H 組相比，TGP-L 組和TGP+ML385 組小鼠肺勻漿中上述指標(biāo)的活性顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肺勻漿中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性（±s，n=10，U/mg prot）Tab.4 Activities of T-AOC， SOD， GSH-Px and CAT in lung homogenate of mice in each group （±s，n=10，U/mg prot）

表4 各組小鼠肺勻漿中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性（±s，n=10，U/mg prot）Tab.4 Activities of T-AOC， SOD， GSH-Px and CAT in lung homogenate of mice in each group （±s，n=10，U/mg prot）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

CAT 6.53±0.73 2.27±0.381）3.30±0.511）2）3）5.27±0.601）2）3.41±0.421）2）3）Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 T-AOC 2.29±0.25 1.10±0.191）1.60±0.211）2）3）2.38±0.272）1.73±0.221）2）3）SOD 114.26±13.71 48.31±7.421）69.52±8.271）2）3）120.67±14.122）75.44±10.651）2）3）GSH-Px 41.30±5.42 15.74±3.051）25.49±3.201）2）3）39.08±4.242）27.26±3.181）2）3）

2.4 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化 HE 和AB-PAS染色結(jié)果顯示，Control 組支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁無增厚，支氣管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，未見杯狀細(xì)胞增生；與Control 組相比，OVA 組小鼠肺組織支氣管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生明顯，黏液分泌增加，肺組織炎癥和黏液分泌評分顯著升高（P＜0.05）；與OVA 組相比，TGP-L組和TGP-H 組小鼠肺組織氣道炎癥明顯減輕，黏液分泌減少，炎癥和黏液分泌評分顯著降低（P＜0.05）；與TGP-H 組相比，TGP-L 組和TGP+ML385 組小鼠肺組織氣道炎癥和黏液分泌評分均顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表5。

表5 各組小鼠肺組織病理評分（±s，n=10）Tab.5 Histopathological scores of lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

表5 各組小鼠肺組織病理評分（±s，n=10）Tab.5 Histopathological scores of lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 Inflammation score（HE）0 Mucus secretion score（AB-PAS）0 2.34±0.281）1.92±0.261）2）3）1.21±0.171）2）1.86±0.251）2）3）3.26±0.351）2.45±0.281）2）3）1.51±0.171）2）2.37±0.261）2）3）

2.5 各組小鼠肺組織TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表達(dá) 與Control 組相比，OVA 組小鼠肺組織TGF-β1、MMP-9 mRNA 表 達(dá) 顯 著 升 高，TIMP-1 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與OVA 組相比，TGP-L 組和TGP-H 組小鼠肺組織TGF-β1、MMP-9 mRNA 表達(dá)顯著降低，TIMP-1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與TGP-H 組 相 比，TGP-L 組 和TGP+ML385組小鼠肺組織TGF-β1、MMP-9 mRNA 表達(dá)顯著升高，TIMP-1 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表6。

表6 各 組 小 鼠 肺 組 織TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA表達(dá)（±s，n=10）Tab.6 mRNA expressions of TGF-β1， MMP-9 and TIMP-1 in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

表6 各 組 小 鼠 肺 組 織TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA表達(dá)（±s，n=10）Tab.6 mRNA expressions of TGF-β1， MMP-9 and TIMP-1 in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

TIMP-1 mRNA 1.00±0.00 0.37±0.051）0.50±0.061）2）3）0.74±0.101）2）0.54±0.071）2）3）Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 TGF-β1 mRNA 1.00±0.00 2.74±0.301）2.16±0.251）2）3）1.43±0.181）2）2.07±0.241）3）MMP-9 mRNA 1.00±0.00 3.85±0.471）2.72±0.321）2）3）1.81±0.251）2）2.66±0.331）2）3）

2.6 各組小鼠肺組織TGF-β1/Nrf-2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與Control 組相比，OVA 組小鼠肺組織TGF-β1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Nrf-2 和HO-1蛋白表達(dá)有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與OVA 組相比，TGP-L 組和TGP-H 組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著降低，Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與TGP-H 組相比，TGP-L 組和TGP+ML385 組小鼠肺組織Nrf-2、HO-1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），TGF-β1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見圖2、表7。

圖2 各組小鼠肺組織TGF-β1/Nrf-2/HO-1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of TGF-β1/Nrf-2/HO-1 pathway-related proteins in lung tissues of mice in each group

表7 各組小鼠肺組織TGF-β1、Nrf-2、HO-1 蛋白的表達(dá)（±s，n=10）Tab.7 Expressions of TGF-β1， Nrf-2 and HO-1 proteins in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

表7 各組小鼠肺組織TGF-β1、Nrf-2、HO-1 蛋白的表達(dá)（±s，n=10）Tab.7 Expressions of TGF-β1， Nrf-2 and HO-1 proteins in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

HO-1/GAPDH 0.21±0.04 0.23±0.04 0.55±0.071）2）3）0.80±0.091）2）0.53±0.061）2）3）Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 TGF-β1/GAPDH 0.13±0.02 0.64±0.071）0.41±0.051）2）3）0.29±0.041）2）0.43±0.061）2）3）Nrf-2/Lamin B1 0.15±0.03 0.20±0.04 0.37±0.051）2）3）0.48±0.071）2）0.34±0.051）2）3）

3 討論

氣道重塑是哮喘的主要病理特征之一，目前的臨床藥物（包括長效β2-激動劑、支氣管擴(kuò)張劑和吸入性皮質(zhì)類固醇）對氣道重塑影響不大［17］。因此，探索對氣道重塑有效的藥物對哮喘的臨床治療具有重要意義。本研究表明，TGP 通過影響氧化應(yīng)激減弱OVA 致敏小鼠的氣道重塑，這可能為治療哮喘提供了有力證據(jù)。

氣道重塑是指氣道結(jié)構(gòu)改變，包括上皮下纖維化、ASMCs 和杯狀細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過多，這些是肺功能下降的主要原因［18］。氣道重塑包含多種病理因素，包括過敏原、生長因子、ROS 和促炎因子［19］。如CysLT1 通過與其受體CysLTR1 結(jié)合在哮喘中發(fā)揮促炎作用［20］；且CysLT1 和TGF-β1 可通過促進(jìn)ASMCs 的增殖和遷移促進(jìn)氣道重塑，加速氣道壁增厚［21-22］。有研究表明，ASMCs 增生或TGF-β1 的調(diào)節(jié)是消除氣道重塑的潛在治療靶點(diǎn)［2-3］。本研究發(fā)現(xiàn)TGP 減少了OVA 小鼠的肺泡炎癥浸潤和氣道重塑，同時(shí)抑制了TGF-β1、CysLT1 和CysLTR1。然而，其他CysLTs 也在哮喘的炎癥反應(yīng)和氣道重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，TGP 介導(dǎo)氣道重塑和炎癥反應(yīng)的改善是否與其他CysLTs 有關(guān)仍需進(jìn)一步研究［23］。此外，氧化應(yīng)激引起的氣道重塑也引起了研究人員的廣泛關(guān)注。氧化應(yīng)激可通過激活NF-κB 的免疫反應(yīng)性促進(jìn)肺炎癥因子表達(dá)［24］；且氧化應(yīng)激介導(dǎo)TGF-β1 的激活導(dǎo)致AMSCs 的高反應(yīng)性和上皮損傷［25-26］。ECM 也是氧化應(yīng)激誘發(fā)的氣道重塑過程中的標(biāo)志之一，氧化應(yīng)激激活介導(dǎo)了基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，也促進(jìn)了肺纖維化、ECM 和組織結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致氣道重塑［27］。本研究結(jié)果顯示，TGP 降低了哮喘小鼠肺中TGF-β1和MMP-9 表達(dá)，并提高了TIMP-1 及抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)。表明TGP 提高了抗氧化防御，并降低了下游MMP-9表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)TGP 介導(dǎo)了哮喘中氧化應(yīng)激過程的抑制。

Nrf-2 參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肺損傷過程，一旦受到氧化應(yīng)激的刺激，Nrf-2 就會進(jìn)入細(xì)胞核并激活HO-1 表達(dá)，從而緩解氧化應(yīng)激［28］。Nrf-2/HO-1 通路是對抗氧化損傷的主要防御機(jī)制，激活的Nrf-2位于細(xì)胞核中，可使HO-1、SOD、CAT 和GSH-Px 激活［29］。在哮喘中，Nrf-2/HO-1 通路激活可降低MMP-9 表達(dá)［30］?；贜rf-2激活對氧化應(yīng)激的抑制作用，課題組假設(shè)Nrf-2 和HO-1 的表達(dá)水平可能會因OVA 的反應(yīng)而降低，但結(jié)果表明二者并未發(fā)生顯著變化，相反，在OVA 的刺激下，Nrf-2、HO-1 表達(dá)有所增加。課題組認(rèn)為模型小鼠核Nrf-2和HO-1的增加可能是肺在巨大氧化壓力和炎癥條件下的代償作用，是小鼠的適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制，與PAN 等［31］的研究結(jié)果一致，即在OVA 的刺激下，Nrf-2 被釋放并在肺組織的細(xì)胞核中適度積累。通過給予TGP 干預(yù)后，Nrf-2的核表達(dá)和隨后HO-1 的表達(dá)顯著增加；說明TGP 可擴(kuò)大Nrf-2的核表達(dá)。而在哮喘小鼠中，當(dāng)使用Nrf2抑制劑ML385 阻斷Nrf-2/HO-1 通路的激活后，TGP對哮喘小鼠肺組織氧化應(yīng)激和氣道重塑的抑制被明顯減弱，這些數(shù)據(jù)表明TGP 可降低TGF-β1 表達(dá)，并可通過激活Nrf-2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步激活抗氧化防御機(jī)制。

綜上所述，TGP 可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥誘發(fā)的支氣管哮喘小鼠的氣道重塑，其作用機(jī)制可能與降低TGF-β1表達(dá)，激活Nrf-2/HO-1通路有關(guān)。本研究僅從氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的角度初步探討了TGP對支氣管哮喘小鼠氣道重塑的保護(hù)機(jī)制，在未來的研究中，課題組將采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)深入分析其作用機(jī)制；此外，由于氣道重塑與免疫細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子有關(guān)，以及TGP 具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，其發(fā)揮作用的具體機(jī)制是否與機(jī)體免疫有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。