CD4+T細(xì)胞在心力衰竭小鼠模型中的變化及細(xì)胞因子釋放的研究①

賈玉玲 張君彩 吳麗俠 高 靜 趙海彬 蔣玉柱

（石家莊市第四醫(yī)院（河北醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院），石家莊 050011）

心力衰竭（heart failure，HF）是60 歲以上住院老年人最常見的心血管疾病，但針對(duì)急性失代償型和射血分?jǐn)?shù)保留型HF 的治療策略，目前均未被證實(shí)可提高患者生存率［1-2］。心室重構(gòu)是慢性HF 發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，包括間質(zhì)纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞壞死和糖原貯積等，是影響HF病程進(jìn)展和死亡率的決定因素［3］。

T 輔助（T helper，Th）細(xì)胞，也稱為CD4+細(xì)胞或CD4 陽性細(xì)胞，是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)細(xì)胞之一［4］。當(dāng)心肌細(xì)胞受到各種不良刺激時(shí)，會(huì)釋放細(xì)胞因子招募血液及局部的Th 細(xì)胞至損傷處，Th 細(xì)胞進(jìn)一步激活可促使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而引起并加重間質(zhì)纖維化誘發(fā)HF［5］。淋巴細(xì)胞可根據(jù)表型不同分為多個(gè)亞群，如Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）等［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞可通過分泌不同的細(xì)胞因子在HF 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮“雙刃劍”作用［7］。目前針對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞與心室重構(gòu)關(guān)系的研究仍處于初級(jí)階段，尚不明確不同階段CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群改變與HF的關(guān)系。因此，本研究使用HF 小鼠模型，觀察不同時(shí)間點(diǎn)CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群的變化，以期為改善心肌重構(gòu)、治療HF提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠30 只，體質(zhì)量（25±2） g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0001。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，12 h晝夜周期交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器 Ⅰ型膠原蛋白ab270993）、CD4+T細(xì)胞（ab183685）、T-bet（ab53174）、GATA-3（ab8933）、FoxP3（ab215206）特異性一抗購自英國Abcam；特異性二抗（批號(hào)：20201108）購自南京金斯瑞生物科技有限公司；IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒（批號(hào)：200824、200715、200514、201206、201109）購自深圳市達(dá)科為生物工程有限公 司；Visual Sonics Vevo 2100 system （Visualsonics Inc.，加拿大）超聲機(jī)；BX45顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 方法

1.2.1 慢性HF 小鼠的建模及分組 采用心臟外周負(fù)荷法制備小鼠心衰模型［7］。使用戊巴比妥鈉（30 mg/kg 體重）對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)麻醉，備皮消毒后于第二肋肋間隙做縱向切口打開胸腔，暴露主動(dòng)脈胸段；最后，在主動(dòng)脈的頭臂干與左頸總動(dòng)脈間下方穿入7-0 細(xì)線，把26 G 細(xì)針與主動(dòng)脈弓共同結(jié)扎，結(jié)扎后取出細(xì)針。然后隨機(jī)分為手術(shù)造模后2周（n=10）、4 周（n=10）組，另外10 只小鼠設(shè)為假手術(shù)組，假手術(shù)組僅打開胸腔暴露主動(dòng)脈但不進(jìn)行結(jié)扎。

1.2.2 心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察 小鼠麻醉后前胸脫毛，采用Visual Sonics Vevo 2100 system 超聲機(jī)（頻率17 MHz）取小鼠左心室長軸切面后進(jìn)行M 超聲檢測(cè)，測(cè)量左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左 室 射 血 分 數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室收縮末期大?。╨eft ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期大?。╨eft ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），所有數(shù)據(jù)檢測(cè)3 個(gè)心動(dòng)周期并計(jì)算測(cè)量的平均值。

1.2.3 心臟病理學(xué)檢查 小鼠處死后剪開心包，剔除附屬物，生理鹽水反復(fù)沖洗心臟至溶液變清亮，用濾紙將多余水分吸干后浸入4%中性甲醛溶液。經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后，置于切片機(jī)中連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、二甲苯透明后，Masson 染色檢測(cè)心臟纖維化；免疫組化染色檢測(cè)Ⅰ型膠原和CD4+T 細(xì)胞表達(dá)。BX45顯微鏡40倍觀察拍照，每張玻片選3個(gè)視野，Image J軟件分析。

1.2.4 血清炎癥因子檢測(cè) ELISA 檢測(cè)小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6 和IL-10 水平。取小鼠腹主動(dòng)脈血，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min（半徑12.6 cm），取血清分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)相應(yīng)試劑盒說明書步驟進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.5 Western blot 取適量大鼠心臟組織，加入RIPA 裂解液制成蛋白提取液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。加入4×SDS 蛋白上樣緩沖液煮沸后備用。將樣品分別加入不同泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%BSA 封閉。加入T-bet（1∶1 000）、GATA-3，（1∶1 000）、FoxP3（1∶1 000）特異性一抗，于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入特異性二抗（1∶2 000）孵育1 h。TBST 洗膜3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，Image J圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組比較使用單因素方差分析（One Way ANOVA），兩兩比較采用t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)和方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左室功能的評(píng)價(jià) 與假手術(shù)組比較，造模2周、4 周后小鼠心臟擴(kuò)大且收縮功能下降，表現(xiàn)為LVESD 和LVEDD 顯著增大，而LVFS、LVEF 顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與造模2 周比較，造模4 周后LVFS、LVEF 顯著降低（P＜0.05），但LVESD 和LVEDD 并沒有進(jìn)一步增高（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of heart function indexes of rats in each group （±s，n=10）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of heart function indexes of rats in each group （±s，n=10）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with 2 weeks after modeling， 2）P＜0.05.

LVEDD/mm 7.07±2.62 11.74±3.311）11.89±4.261）Groups Sham 2 weeks 4 weeks LVFS/%74.23±4.98 43.56±5.771）36.09±7.121）2）LVEF/%56.25±6.74 32.29±5.511）22.18±4.781）2）LVESD/mm 4.36±2.09 8.25±3.611）8.07±4.361）

2.2 小鼠HF 病理進(jìn)程中左室病理組織學(xué)改變對(duì)三組小鼠進(jìn)行心臟病理切片分析（圖1、2）。低倍鏡下顯示假手術(shù)組小鼠心臟形態(tài)正常，造模2 周和4 周后心肌增厚、心腔減小。Masson 染色及免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織纖維化及膠原沉積程度，結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，造模2 周、4 周后小鼠心肌組織纖維化和Ⅰ型膠原陽性面積顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與造模后2 周相比，造模后4 周心肌組織纖維化和Ⅰ型膠原陽性面積顯著增加（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠心臟纖維化面積百分比比較Fig.1 Comparison of percentage of cardiac fibrosis area of mice in each group

圖2 各組小鼠心臟膠原蛋白沉積程度比較（×20）Fig.2 Comparison of collagen deposition in hearts of mice in each group （×20）

2.3 大鼠心臟CD4+T 淋巴細(xì)胞變化 對(duì)三組小鼠進(jìn)行心臟病理切片分析（圖3），結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，造模2 周、4 周后小鼠心肌組織中的CD4+T淋巴細(xì)胞顯著增多（P＜0.05）；與造模后2周相比，造模后4周CD4+T淋巴細(xì)胞顯著增多（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠心臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量比較（×20）Fig.3 Comparison of the number of mice heart CD4+T cells in each group （×20）

2.4 各組大鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平 對(duì)假手術(shù)組、2 周、4 周組小鼠心肌組織炎癥因子進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。與假手術(shù)組相比，造模后2 周、4 周小鼠心肌組織炎癥因子IFN-γ、IL-2 水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-6、IL-10 水平顯著降低；與造模后2 周相比，造模后4 周小鼠心肌組織炎癥因子IFN-γ、IL-2 水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-6、IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組小鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.2 Expression levels of inflammatory factors in myocardial tissue of mice in each group （±s，n=10）

表2 各組小鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.2 Expression levels of inflammatory factors in myocardial tissue of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with 2 weeks after modeling， 2）P＜0.05.

IL-10/（pg·ml-1）741.98± 15.00 534.82± 27.541）311.86± 19.401）2）Groups Sham 2 weeks 4 weeks IFN-γ/（pg·ml-1）102.32±13.76 267.99±32.161）461.44±30.711）2）IL-2/（ng·ml-1）34.88±6.24 109.07±18.311）277.65±28.341）2）IL-4/（pg·ml-1）903.84±15.31 597.42±20.451）286.90±19.471）2）IL-6/（ng·ml-1）895.11±17.66 762.09± 14.391）470.21±20.751）2）

2.5 各組小鼠心肌組織T-bet、GATA-3、FoxP3 蛋白表達(dá)量比較 Western blot檢測(cè)小鼠心肌組織T-bet、GATA-3、FoxP3 蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖4。與假手術(shù)組相比，造模后2周、4周小鼠心肌組織T-bet水平顯著升高，GATA-3、FoxP3 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與造模后2 周相比，造模后4 周小鼠心肌組織T-bet 水平顯著升高，GATA-3、FoxP3 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 小鼠心肌組織T-bet、GATA-3、FoxP3蛋白表達(dá)量比較Fig.4 Comparison of protein levels of T-bet， GATA-3 and FoxP3 in mice myocardial tissue

3 討論

HF是各種器質(zhì)性心臟病發(fā)展的終末階段，臨床表現(xiàn)為呼吸困難和乏力（活動(dòng)耐量受限），以及液體潴留（肺淤血和外周水腫）［8］。HF 根據(jù)左心室射血分?jǐn)?shù)可分為射血分?jǐn)?shù)降低型（左心室射血分?jǐn)?shù)＜40%）、射血分?jǐn)?shù)保留型（左室射血分?jǐn)?shù)值≥50%）和射血分?jǐn)?shù)中間值的心衰（左室射血分?jǐn)?shù)為40%～49%）［9］。射血分?jǐn)?shù)降低型HF 患者經(jīng)過臨床治療后雖然可以在很大程度上改善臨床癥狀、延長患者壽命、提高患者生活質(zhì)量，但HF 是一種慢性、自發(fā)進(jìn)展性疾病，無法根治；且射血分?jǐn)?shù)保留型HF 目前尚缺乏能夠降低患者病死率的治療手段［10］。左心室的病理性重構(gòu)是HF 發(fā)病的主要機(jī)制之一［11］。心室重構(gòu)是由于各種不良刺激對(duì)心肌細(xì)胞造成持續(xù)性損害，或機(jī)械負(fù)荷過重等導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子過度表達(dá)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常激活，從而使心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生不可逆的病理改變，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞增粗增長、間質(zhì)成分增多、心肌纖維化、細(xì)胞壞死和糖原貯積等［12-13］。

本研究通過增加心臟外周負(fù)荷法制備小鼠HF模型，結(jié)果表明手術(shù)2 周及4 周后小鼠出現(xiàn)左心射血分?jǐn)?shù)下降、心室增大等HF 表現(xiàn)；進(jìn)一步病理染色結(jié)果表明，HF小鼠心肌組織纖維化及膠原沉積呈進(jìn)行性加重；以上數(shù)據(jù)均表明HF 小鼠出現(xiàn)了明顯的心室重構(gòu)，且心臟的功能和結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的增長逐漸惡化。新近研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T 淋巴細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵細(xì)胞亞型，在HF 的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用［14-15］。本研究結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，CD4+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量在心肌組織中逐漸增多，提示其可能通過釋放IL-2、IFN-γ和TNF-α等因子促進(jìn)HF 的發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑制T細(xì)胞功能能夠緩解HF的病理改變，如KALLIKOURDIS 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，使用abatacept 可在抑制T 細(xì)胞激活的同時(shí)提高IL-10 水平，緩解壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的HF。此外，CD4+T 淋巴細(xì)胞可根據(jù)其功能和細(xì)胞表面表達(dá)的分子分為不同亞群，如Th1 細(xì)胞主要表達(dá)IFN-γ、IL-2；Th2 細(xì)胞主要表達(dá)IL-4、IL-6；Treg 主要表達(dá)IL-10 等，且不同亞群在HF 的進(jìn)展中發(fā)揮不同作用［17］。通過檢測(cè)不同亞群CD4+T細(xì)胞分泌的炎癥因子，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著病程增長，IFN-γ 和IL-2表達(dá)逐漸升高，而IL-4、IL-6 和IL-10 表達(dá)逐漸降低，可能是由Th1 細(xì)胞增多而Th2、Treg 數(shù)量減少導(dǎo)致。既往數(shù)據(jù)表明Th1 細(xì)胞在非缺血性HF 患者心臟中大量浸潤，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Th1 可通過細(xì)胞整合素α4與心成纖維細(xì)胞結(jié)合誘導(dǎo)TGF-β表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的沉積［18］。相反，Treg 可通過抑制炎癥反應(yīng)緩解HF的病理進(jìn)展，如CHEN等［19］研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)可使Treg 亞群比例相對(duì)上調(diào)，從而改善HF 大鼠的癥狀；此外Treg 與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的積累，從而阻礙心臟纖維化的發(fā)生［20］。為進(jìn)一步探究CD4+T淋巴細(xì)胞亞群變化的調(diào)控機(jī)制，本研究檢測(cè)了心臟組織中Tbet、GATA-3 及FoxP3 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示隨著時(shí)間延長，T-bet 蛋白水平逐漸增高，而GATA-3 和FoxP3 蛋白水平逐漸降低。其中，T-bet 蛋白是前體Th0 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而GATA-3 則調(diào)控了Th0 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化［21］。此外，Th1 和Th2 可以相互調(diào)節(jié)，Th1 細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ 可促進(jìn)其自身成熟，抑制Th2 細(xì)胞分化；而Th2 細(xì)胞可通過分泌IL-4、IL-6 等因子抑制Th1 細(xì)胞分化成熟，二者共同影響免疫應(yīng)答的格局［22］。FoxP3 是Treg 發(fā)育和維持過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受、維持機(jī)體自穩(wěn)態(tài)中起重要作用［23］。以上結(jié)果表明CD4+T淋巴細(xì)胞亞群失衡可能是HF 發(fā)病的關(guān)鍵。本研究僅關(guān)注了淋巴細(xì)胞亞群的作用，但心肌重構(gòu)與其他免疫細(xì)胞相關(guān)，未來研究可針對(duì)其他細(xì)胞類型進(jìn)行深入研究。

綜上所述，隨著HF 的發(fā)生發(fā)展，CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量增加并發(fā)生比例失衡，導(dǎo)致炎癥因子水平改變，從而引起心室重構(gòu)加重HF 的病理表現(xiàn)。本研究為心衰中CD4+T淋巴細(xì)胞在基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。