甘露聚糖結(jié)合凝集素對脂多糖誘導(dǎo)的3T3-L1 脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制①

李志欣 任智宏 雷一鳴 穆永慧 于莉莉 王明永 （新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003）

肥胖是全世界最流行的疾病之一，近年來出現(xiàn)快速增長的趨勢，嚴(yán)重影響人類的健康水平［1］。防治肥胖已成為人類保衛(wèi)健康的首要目標(biāo)。肥胖作為一種慢性炎癥疾病得到了科學(xué)界的公認(rèn)［2］。在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織功能障礙可導(dǎo)致血清游離脂肪酸水平（free fatty acids，F(xiàn)FAs）異常升高，過量的游離脂肪酸通過干擾胰島素信號產(chǎn)生胰島素抵抗，是2 型糖尿病的主要特征［3］。另一方面過度的脂肪堆積引起脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤，通過激活NF-κB通路釋放IL-6、TNF-α 等炎癥因子，導(dǎo)致肥胖炎癥進(jìn)一步增強(qiáng)［4］。因此，有效調(diào)控炎癥和胰島素抵抗是控制肥胖進(jìn)程的潛在手段。

近年來免疫代謝學(xué)的飛速發(fā)展為肥胖及相關(guān)疾病的防治提供了新思路和新手段［5］。被稱為天然免疫中關(guān)鍵模式識別受體的甘露聚糖結(jié)合凝集素（manna-binding lectin，MBL）是由肝細(xì)胞分泌的急性期蛋白，在天然免疫防御中發(fā)揮重要作用［6］。近年來新的研究發(fā)現(xiàn)MBL 對機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用［7-9］。還有研究表明MBL 與糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展也存在一定的聯(lián)系［10-11］。前期研究發(fā)現(xiàn)：在3T3-L1 脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化不同階段，MBL 均發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，且這種調(diào)節(jié)作用與自噬密切相關(guān)［12-13］。提示MBL對肥胖的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用，但機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

本研究中，以3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞為體外研究模型，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為細(xì)胞刺激劑，研究表明，肥胖人群的LPS血清水平有一定程度的升高，在肥胖誘導(dǎo)慢性炎癥和胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用［14］。系統(tǒng)探討MBL 對LPS 誘導(dǎo)的3T3-L1 脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的影響，旨在進(jìn)一步探究MBL對肥胖的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞株（普諾賽科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；胰島素、DMSO、油紅O 染液、PBS 粉末（索萊寶科技有限公司）； IBMX、地塞米松、LPS（Sigma）；MBL 蛋白（近岸蛋白質(zhì)科技有限公司）；IL-6 ELISA 試 劑 盒、TNF-α ELISA 試 劑 盒（Thermo）；CCK-8 試劑（AbMole BioScience）；核質(zhì)蛋白提取試劑盒（Thermo）；細(xì)胞組織快速裂解液（Abcam）；磷酸酶及蛋白酶抑制劑（羅氏）；GAPDH（康為CW0100 M）；IL-6、TNF-α、NF-κB p65、IκBα、P-IκBα ser32/36、P-IKK ser176/180、IKK、Akt、P-Akt、LaminB 1（Cell Signaling Technology， #12912、#11948、#8284、#4818、#9246、#2697、#2678、#9272、#9271、#12586）；TLR4（Santa sc-293072）；GLUT4、IRS、P-IRS try（亞科因生物技術(shù)有限公司）；ECL 檢測試劑盒（Millipore）；2-NBDG（懋康生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo) 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞采用含10%FBS 的DMEM 于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，正常細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則的梭形貼壁細(xì)胞。將3T3-L1細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度至90%左右時，換液，細(xì)胞接觸抑制2 d，棄去培養(yǎng)基，加誘導(dǎo)液Ⅰ（0.75 mmol/L IBMX、1.0 μmol/L 地塞米松和1 mg/L 胰島素的含10%FBS的DMEM），2 d更換1次新鮮誘導(dǎo)液Ⅰ，至第6天，將誘導(dǎo)液Ⅰ更換為誘導(dǎo)液Ⅱ（10 mg/L 胰島素的含10%FBS 的 DMEM），2 d 更換1 次誘導(dǎo)液Ⅱ，直至第12天。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 收集3T3-L1 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)過程中0 d、4 d、8 d、12 d的細(xì)胞，染色觀察細(xì)胞脂滴情況。設(shè)置空白對照組，模型組：使用LPS（1 μg/ml）刺激，蛋白處理組：在LPS（1 μg/ml）刺激前30 min 加入MBL（10 μg/ml）進(jìn)行預(yù)處理，檢測細(xì)胞活力和炎癥的相關(guān)指標(biāo)；另一實(shí)驗(yàn)中，采用LPS（1 μg/ml）和不同濃度MBL 蛋白（0、1、10、20 μg/ml）干預(yù)分化成熟的脂肪細(xì)胞（12 d），檢測MBL 干預(yù)對細(xì)胞炎癥因子以及TLR4/NF-κB 信號通路的影響。在檢測細(xì)胞對葡萄糖的攝取實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組分為對照組、INS 處理組、LPS 處理組、LPS+INS 處理組以及LPS+INS+MBL（0、1、10、20 μg/ml）處理組，然后再選用10 μg/ml 的MBL 處理組檢測其通路蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 油紅O 染色 PBS 清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定40 min，新配油紅O 工作液避光染色40 min，60%異丙醇去除未結(jié)合染料并用蒸餾水洗去，拍照記錄。

1.2.4 CCK-8 在96 孔板中，細(xì)胞以8 000 個/孔的密度鋪板。按照上述處理分組情況，設(shè)5個復(fù)孔，處理后每孔加10 μl CCK-8試劑，37 ℃孵育2.5 h，使用450 nm 波長測量細(xì)胞吸光度。細(xì)胞增殖率（%）=［（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對照組-A空白組）］×100%。

1.2.5 ELISA 收集各組細(xì)胞上清，使用ELISA 試劑盒檢測上清中TNF-α 和IL-6 的含量（按照說明要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。

1.2.6 Western blot 取各組細(xì)胞，用總蛋白提取試劑盒和核質(zhì)蛋白提取試劑盒裂解細(xì)胞，提蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，調(diào)整為統(tǒng)一濃度，變性。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)，奶粉或BSA 室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜，TBST 洗膜，二抗室溫2 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，曝光。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 各組使用2%無血清無糖培養(yǎng)基饑餓5 h，加入胰島素刺激20 min，再加入2-NBDG作用20 min后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.02 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，所有實(shí)驗(yàn)均至少進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。采用單因素方差分析比較各組間的差異，以LSD 法比較任意兩組間的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞12 d 可誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞 油紅O染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化前細(xì)胞呈梭形，未見明顯脂滴（圖1A）；誘導(dǎo)第4 天，細(xì)胞由梭形變圓，胞漿內(nèi)出現(xiàn)了較多小脂滴（圖1B）；誘導(dǎo)至第8 天，細(xì)胞更大，多為圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)的脂滴也隨之變多且大，分布于核周，呈“戒環(huán)”樣（圖1C）；誘導(dǎo)至第12 天，90%以上胞漿中都含有亮紅色大脂滴，即為由小脂滴匯聚成的大脂滴，為成熟脂肪細(xì)胞（圖1D）。提示采用此種誘導(dǎo)方法在誘導(dǎo)至第12天可得到成熟脂肪細(xì)胞。

圖1 油紅O染色Fig.1 Oil red O staining

2.2 MBL 及LPS 干預(yù)不影響3T3-L1 脂肪細(xì)胞增殖活力 在3T3-L1 脂肪細(xì)胞分化過程中，10 μg/ml MBL 以及1 μg/ml LPS 對其增殖能力無明顯影響（圖2A）；且對成熟階段的細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)：不同濃度的MBL（1、10、20 μg/ml）以及LPS（1 μg/ml）對細(xì)胞的存活無明顯影響（圖2B）。結(jié)果表明：在3T3-L1 脂肪細(xì)胞分化初期至成熟的過程中，不同濃度MBL及LPS對其增殖能力無明顯影響。

圖2 MBL與LPS對3T3-L1細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of MBL and LPS on proliferation of 3T3-L1 cells

2.3 MBL 抑制LPS 誘導(dǎo)的不同分化階段脂肪細(xì)胞炎癥因子分泌 為探討MBL 在3T3-L1 脂肪細(xì)胞分化過程中的抑炎作用，選擇0 d、4 d、8 d、12 d 4 個時間點(diǎn)，使用LPS 對細(xì)胞進(jìn)行刺激，并加入MBL 進(jìn)行干預(yù)。Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，LPS處理組的IL-6、TNF-α水平顯著升高，而MBL的加入顯著抑制了這一作用（圖3）。提示在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的不同階段，MBL 均可以抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α表達(dá)。

圖3 3T3-L1脂肪細(xì)胞全分化過程中IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平及灰度分析Fig.3 Expression levels and gray level analysis of IL-6，TNF-α during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

2.4 MBL 以濃度依賴方式降低LPS 誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥因子分泌 選擇分化至12 d 的脂肪細(xì)胞進(jìn)行分析，加入LPS對成熟的脂肪細(xì)胞進(jìn)行刺激，不同濃度MBL 干預(yù)。ELISA 及Western blot 結(jié)果顯示：與空白對照組相比，LPS 可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞增加IL-6、TNF-α 分泌，而MBL 干預(yù)以濃度依賴的方式抑制IL-6 和TNF-α 分泌（圖4）。初步推測MBL 在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化全過程直至成熟均具有抑炎作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。

圖4 成熟脂肪細(xì)胞IL-6 和TNF-α 的因子分泌、蛋白表達(dá)水平及灰度分析Fig.4 Cytokine secretion， protein expression and gray scale analysis of IL-6 and TNF-α in mature adipocytes

2.5 MBL 抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB 信號通路活化 使用LPS 對成熟的脂肪細(xì)胞進(jìn)行刺激，并加入不同濃度的MBL 進(jìn)行干預(yù)。Western blot 結(jié)果顯示，MBL 可抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4 高表達(dá)，從而抑制下游的IKK、IκB 磷酸化，進(jìn)而阻滯NF-κB p65 入核表達(dá)，且MBL 濃度越高抑制作用越明顯（圖5）。提示，MBL 可能通過TLR4/NF-κB 信號通路調(diào)控炎癥，并呈濃度依賴關(guān)系。

圖5 成熟脂肪細(xì)胞TLR4/NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)水平及灰度分析Fig.5 Expression levels and gray level analysis of TLR4/NF-κB signaling pathway in mature adipocytes

2.6 MBL 可以減輕LPS 誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取損傷 LPS 可抑制胰島素刺激IRS-1 try 和Akt 的磷酸化并使細(xì)胞對葡萄糖的攝取產(chǎn)生抑制作用［15］。為了探討MBL 是否能調(diào)節(jié)胰島素抵抗，檢測MBL 對成熟脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組2-NBDG 的熒光強(qiáng)度：MBL+INS+LPS處理組相較于INS+LPS 處理組，提高了對2-NBDG的攝取，即MBL 的干預(yù)可以修復(fù)LPS 對細(xì)胞攝取葡萄糖的損傷，以濃度依賴的方式提高細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力（圖6）。

圖6 成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取情況Fig.6 Glucose uptake in mature adipocytes

2.7 MBL 可以解除LPS 對IRS-1/Akt 信號通路的抑制 MBL+INS+LPS 處理組與INS+LPS 處理組相比，MBL 干 預(yù) 增 加 了IRS try 和Akt 的 磷 酸 化，并 使GLUT4的表達(dá)增強(qiáng)（圖7）。提示MBL可以通過減弱LPS 對3T3-L1 細(xì)胞中胰島素信號通路IRS-1/Akt 的抑制，進(jìn)而激活GLUT4 的膜移位，增強(qiáng)細(xì)胞對葡萄糖攝取的能力。

圖7 成熟脂肪細(xì)胞胰島素通路蛋白表達(dá)及灰度分析Fig.7 Expression levels and gray level analysis of insulin pathway proteins in mature adipocytes

3 討論

肥胖是能量攝入和消耗失衡的結(jié)果［16］。越來越多的研究結(jié)果表明，肥胖與慢性低度炎癥相關(guān)，是胰島素抵抗等多種代謝性疾病的重要病因機(jī)制［3］。有研究發(fā)現(xiàn)免疫因素在代謝性疾病中扮演著重要角色，故人們開始注重天然免疫與既往認(rèn)為的非感染性疾病如肥胖相關(guān)代謝性疾病之間的關(guān)系［13］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）能夠識別病原相關(guān)分子模式，其活化能夠引起多蛋白質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生炎癥因子，激活獲得性免疫應(yīng)答。研究表明，TLR4信號通路與肥胖慢性炎癥有關(guān)，其配體LPS 被認(rèn)為是引發(fā)脂肪組織炎癥的早期關(guān)鍵因子［17-18］。

前期研究課題組發(fā)現(xiàn)MBL 預(yù)處理可降低成脂分化相關(guān)因子如PPAR、CEBPα mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)，降低3T3-L1 細(xì)胞分化過程中的脂滴積累，抑制細(xì)胞的成脂分化，且這種抑制作用與自噬密不可分［12-13］。由于肥胖與炎癥、胰島素抵抗等病理性的改變密切相關(guān) ，初步推測MBL可能與脂肪組織內(nèi)炎癥及胰島素抵抗有關(guān)。因此深入研究MBL 與炎癥和胰島素抵抗的關(guān)系，可為防治肥胖提供新方向。

由于3T3-L1 細(xì)胞是研究肥胖常用的體外細(xì)胞模型，LPS 誘導(dǎo)的TLR4信號通路可能是脂肪細(xì)胞相關(guān)炎癥的關(guān)鍵因素［18-19］。故以3T3-L1細(xì)胞為體外研究模型，LPS為細(xì)胞刺激劑，探討MBL對脂肪細(xì)胞炎癥和胰島素抵抗的調(diào)節(jié)及機(jī)制。在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，MBL 預(yù)處理顯著抑制了LPS 誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α和IL-6的分泌。提示在脂肪細(xì)胞從開始分化到誘導(dǎo)成熟的過程中，MBL 對于細(xì)胞炎癥因子分泌的抑制作用是一直存在的。為進(jìn)一步分析MBL對脂肪細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)作用，選取成熟脂肪細(xì)胞（12 d），以不同濃度MBL 進(jìn)行干預(yù)，Western blot 及ELISA 檢測IL-6、TNF-α 炎癥因子表達(dá)，結(jié)果顯示MBL 以濃度依賴方式對炎癥因子的分泌進(jìn)行抑制。TLR4/NF-κB是經(jīng)典的炎癥信號通路。當(dāng)TLR4處于一個高表達(dá)狀態(tài)時可刺激下游的IKK、IκB 磷酸化，使NF-κB由質(zhì)入核表達(dá)分泌炎癥因子如：IL-6、TNF-α，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥。因此又進(jìn)一步分析了MBL 對這條信號通路的調(diào)控作用，Western blot 結(jié)果顯示MBL 預(yù)處理可以阻止LPS 誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB 信號通路的激活，且呈濃度依賴性。提示MBL 可通過TLR4/NF-κB通路抑制肥胖相關(guān)炎癥。

肥胖是導(dǎo)致胰島素抵抗和代謝并發(fā)癥，如2 型糖尿病的主要因素［3］。胰島素主要通過刺激骨骼肌、脂肪組織和肝臟等組織的各種生理反應(yīng)來維持血糖穩(wěn)態(tài)。胰島素在細(xì)胞外可與胰島素受體（insulin receptor，IR）的α 亞基結(jié)合啟動胰島素信號通路［20］。參與這一途徑的信號分子包括IR、IRS-1、PI3K、PDK1、Akt、AS160 和 葡 萄 糖 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體4（GLUT4）。胰島素作用的最終目標(biāo)是激活GLUT4的膜移位和增加葡萄糖攝?。?1］。在肥胖狀態(tài)下，IRS-1 ser 磷酸化能使Akt 活性受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素信號通路受損，發(fā)生胰島素抵抗［22］。2-NBDG是一種帶有熒光的葡萄糖探針，流式細(xì)胞術(shù)通過檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度評價細(xì)胞對葡萄糖攝取能力，進(jìn)一步判斷是否存在胰島素抵抗。使用不同濃度 MBL預(yù)處理3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot 兩種方法驗(yàn)證MBL 是否影響3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖。結(jié)果顯示，MBL 可以通過解除LPS 對IRS-1 酪氨酸基和Akt 磷酸化的抑制作用，在一定程度上修復(fù)LPS 誘導(dǎo)的3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖能力的損傷。提示，MBL 可能具有改善胰島素抵抗的作用。

HOTAMISLIGIL 等［23］首次發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α可以誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，而且IL-6 也可以誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生；TNF-α 和IL-6 可以通過調(diào)節(jié)IRS/Akt 信號通路調(diào)節(jié)胰島素敏感性［24］。本研究表明MBL 可以抑制TLR4/NF-κB 信號通路分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6，因此，MBL可以通過抑制炎癥緩解胰島素抵抗。

除TNF-α 等炎癥因子之外，無疑還有其他信號也可促進(jìn)胰島素抵抗并介導(dǎo)T2D 發(fā)展。研究表明，肥胖不僅可以激活I(lǐng)KKβ 導(dǎo)致NF-κB 易位，使許多標(biāo)志物和潛在炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加導(dǎo)致胰島素抵抗；還可以激活JNK 導(dǎo)致IRS-1 絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，通過胰島素受體/IRS-1軸負(fù)向調(diào)節(jié)正常信號，導(dǎo)致胰島素抵抗［25］。這說明，胰島素抵抗的發(fā)生與炎癥密不可分。本研究發(fā)現(xiàn)，MBL 不僅可以抑制炎癥，還可進(jìn)一步緩解胰島素抵抗，更證明了兩者的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，通過研究MBL 對LPS 誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的影響，證實(shí)MBL 不僅可抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而且能夠改善胰島素抵抗，為后續(xù)臨床開發(fā)能夠干預(yù)肥胖的免疫分子提供可靠的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。推測天然免疫分子MBL 可能改善高脂誘導(dǎo)的炎癥和胰島素抵抗，具有預(yù)防肥胖并發(fā)癥的潛力。