LPS與ATP共同誘導(dǎo)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞焦亡模型的建立①

劉慧玲 吳傳新 龍賢梨 李 麗 李 飛 郭 暉 孫 航

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病毒性肝炎研究所，重慶 400010）

細(xì)胞焦亡是一種依賴半胱天冬蛋白酶（caspase-1/-4/-5/-11）活化的炎癥細(xì)胞死亡方式，其形態(tài)介于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死之間，且細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制和調(diào)控機(jī)制與凋亡和壞死大不相同［1］。一直以來的觀點(diǎn)認(rèn)為在感染性疾病中，免疫細(xì)胞的耗竭主要由細(xì)胞凋亡引起，然而近年來在HIV 感染的研究中發(fā)現(xiàn)CD4+T 細(xì)胞的耗竭不僅有凋亡參與，也有焦亡參與，這種炎癥性細(xì)胞死亡方式將更多的免疫細(xì)胞吸引到感染區(qū)域，最終對(duì)免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞［2］。后續(xù)的研究進(jìn)一步證實(shí)僅有5%的CD4+T 細(xì)胞耗竭由凋亡引起，而95%的CD4+T 細(xì)胞耗竭由caspase-1誘導(dǎo)的焦亡引起［3-4］。

研究發(fā)現(xiàn)在多種微生物感染中，caspase-1 的激活是一種宿主防御機(jī)制，感染過程中的局部炎癥會(huì)增強(qiáng)組織破壞和病原體傳播，但隨著感染的進(jìn)展，caspase-1 的激活會(huì)限制病原體的復(fù)制，增強(qiáng)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，但若感染持續(xù)存在，焦亡可造成免疫細(xì)胞過度死亡，導(dǎo)致免疫耗竭，引起機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)［1］。因此適宜的細(xì)胞焦亡是機(jī)體抵御病原入侵的重要機(jī)制，但過度激活細(xì)胞焦亡可使機(jī)體免疫失調(diào)進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官功能障礙，甚至威脅生命［5］。

鑒于細(xì)胞焦亡在應(yīng)對(duì)外來病原感染時(shí)產(chǎn)生的“雙刃劍”作用，越來越多的科研人員開始關(guān)注這種特殊的炎癥性細(xì)胞死亡方式，并探索其對(duì)感染性疾病發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。目前國(guó)內(nèi)外研究細(xì)胞焦亡時(shí)的動(dòng)物模型多使用不同濃度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠發(fā)生膿毒癥［6-7］；或直接使用基因敲除小鼠［8-9］。體外模型則多為L(zhǎng)PS 單獨(dú)作用于細(xì)胞或LPS 和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（或其他細(xì)菌）共同誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡［7，10-13］，但LPS 和ATP 的使用濃度及時(shí)間均不相同，且無法準(zhǔn)確反映焦亡的發(fā)生率。本研究旨在通過LPS 和ATP 共同誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)焦亡發(fā)生率，探索LPS 和ATP 共同誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的最佳條件，為研究免疫細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制提供穩(wěn)定可靠的體外焦亡模型。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。LPS、ATP 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；DMEM 由本實(shí)驗(yàn)室制備；胎牛血清（life）、青-鏈霉素復(fù)合溶液購(gòu)自湖北賽維爾生物科技有限公司；Annexin V-PE/7-AAD（貨號(hào)：559763）、F4/80（貨號(hào)：565410）、CD-11b（貨號(hào)：557657）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GSDMD（貨號(hào)：ab209845）、caspase-11（貨號(hào)：ab246492）、IL-1β（貨號(hào)：ab234437）、HMGB1（貨號(hào)：ab18256）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；caspase-1（貨號(hào)：D7F10）、ASC（貨號(hào)：D2W8U）、NLRP3（貨號(hào)：D4D8T）、IL-18（貨號(hào)：E8P5O）購(gòu)自美國(guó)CST公司；IL-1β ELISA 試劑盒（貨號(hào)：CME0015）、TNF-α ELISA 試劑盒（貨號(hào)：CME0004）購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀（CytoFLEX）購(gòu)自德國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 6～8 周齡C57BL/6 小鼠腹腔注射1 ml 3%硫乙醇酸鹽溶液，3 d 后，用預(yù)冷的PBS 洗出小鼠腹腔液，400 g、4 ℃離心10 min，重懸于10%DMEM 完全培養(yǎng)基中。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后，洗去懸浮細(xì)胞，余下的貼壁細(xì)胞即為原代腹腔巨噬細(xì)胞，更換為新鮮的10%DMEM 完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.2 原代腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察 使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察貼壁后的巨噬細(xì)胞形態(tài)；瑞氏-吉姆薩染色進(jìn)一步觀察細(xì)胞形態(tài)，原代巨噬細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片，貼壁后棄上清，多聚甲醛固定，晾干，瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液滴加于整個(gè)爬片上，加入等量PBS，充分混合，水洗，干燥，鏡檢。

1.2.3 原代腹腔巨噬細(xì)胞純度檢測(cè) 貼壁后的原代腹腔巨噬細(xì)胞使用胰酶消化，EP 管收集細(xì)胞懸液，PBS 洗3 次，適量PBS 重懸，加入5%體積的F4/80 抗體，避光4 ℃孵育30 min，PBS 洗3 次，200 μl PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 PE Annexin-V/7-AAD 檢測(cè)細(xì)胞焦亡 分離出原代腹腔巨噬細(xì)胞，接種于24 孔板，每孔細(xì)胞約1×105個(gè)。貼壁后培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM，根據(jù)HUANG 等［14］的研究，確定LPS 的濃度和作用時(shí)間分別為500 ng/ml 和24 h。將巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 1 h、500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 2 h、500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 4 h 和500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 6 h，4 mmol/L ATP、5 mmol/L ATP 和6 mmol/L ATP 分組同3 mmol/L ATP，之后使用Annexin-V/7-AAD試劑盒檢測(cè)焦亡發(fā)生率。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理 確定ATP 作用的最適濃度及時(shí)間后，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為4 組：①control 組：差異貼壁的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中加入無菌PBS 溶液；②LPS 組：500 ng/ml 的LPS 誘 導(dǎo) 巨 噬 細(xì) 胞24 h；③ATP 組：5 mmol/L 的ATP 刺 激 巨 噬 細(xì) 胞4 h；④LPS+ATP 組：500 ng/ml 的LPS 誘導(dǎo)24 h 后再加入5 mmol/L的ATP刺激4 h。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，裂解細(xì)胞，收集蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，采用SDS-PAGE 80 V 電泳20 min 后轉(zhuǎn)120 V 電泳60 min，300 mA 轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST 洗膜3 次，15 min/次。分別用β-actin（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、caspase-11（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）和HMGB1（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育90 min，TBST 洗膜3 次，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)蛋白條帶。以目的蛋白與β-actin的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 ELISA 檢測(cè)IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組上清液中IL-1β 和TNF-α含量。

1.2.8 電鏡觀察細(xì)胞焦亡形態(tài) 經(jīng)LPS 和ATP 共同處理巨噬細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)液，加入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h，1%鋨酸、0.1 mol/L PBS（pH=7.4）室溫（20 ℃）固定2 h，脫水，滲透，包埋，切片，染色，分別使用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察，采集圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析，組間差異比較采用One-Way ANOVA 分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài) 光學(xué)顯微鏡下可觀察到分離出的原代腹腔巨噬細(xì)胞貼壁后多呈不規(guī)則、梭形或偽足狀態(tài)。經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后可觀察到胞核大且染色呈紫藍(lán)色，胞漿染色淡，呈淺藍(lán)色，可見明顯偽足（圖1）。

圖1 原代腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Form of primary peritoneal macrophages

2.2 原代腹腔巨噬細(xì)胞純度 F4/80 是小鼠巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志，小鼠巨噬細(xì)胞的特異表型為F4/80+，可通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示分離出的原代腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)差異貼壁法去除未貼壁的細(xì)胞后，其純度可由50%升高至90%以上，完全可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求（圖2）。

圖2 原代腹腔巨噬細(xì)胞純度Fig.2 Purity of primary peritoneal macrophages

2.3 不同劑量ATP 與LPS 對(duì)原代腹腔巨噬細(xì)胞焦亡的影響 結(jié)果顯示經(jīng)500 ng/ml LPS 刺激24 h 后再用ATP刺激4 h，巨噬細(xì)胞的焦亡發(fā)生率與ATP刺激的其他時(shí)間點(diǎn)具有明顯差異，且以5 mmol/L ATP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞4 h 后焦亡發(fā)生率最高，以上結(jié)果證明500 ng/ml LPS 24 h+5 mmol/L ATP 4 h為誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的最佳刺激方案（圖3）。

圖3 不同濃度ATP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡Fig.3 Pyroptosis of macrophages induced by different concentrations of ATP

2.4 LPS 和ATP 共同作用后焦亡相關(guān)蛋白與炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況

2.4.1 焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 Western blot 檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，LPS+ATP 組焦亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白GSDMD、caspase-1、caspase-11、HMGB1、pro-IL-1β、pro-IL-18、NLRP3 和ASC 蛋白水平明顯升高，且LPS 組的pro-IL-1β、pro-IL-18、ASC、caspase-11 和NLRP3蛋白水平明顯高于空白對(duì)照組（圖4）。

2.4.2 焦亡相關(guān)炎癥細(xì)胞因子IL-1β 和TNF-α 表達(dá)水平 ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)上清中炎癥細(xì)胞因子IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，LPS 組和LPS+ATP 組中IL-1β 和TNF-α 表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且ATP 組培養(yǎng)上清中的IL-1β含量也明顯高于對(duì)照組（圖5）。

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平Fig.5 Concentrations of IL-1β and TNF-α in cell culture supernatant

2.5 電鏡觀察細(xì)胞焦亡形態(tài) 電鏡下可觀察到LPS+ATP 組多數(shù)巨噬細(xì)胞呈焦亡狀態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞表面有破損。SEM 可觀察到焦亡的巨噬細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，偽足（PS）大面積減少、退化，個(gè)別斷裂；細(xì)胞膜大面積破損，大量細(xì)胞內(nèi)容物釋放至胞外，細(xì)胞周圍可見游離細(xì)胞基質(zhì)（CO），膜表面可見多處破損（圖6A、B）。經(jīng)TEM 觀察可見焦亡細(xì)胞中度水腫，細(xì)胞核（N）呈近圓形，核固縮，局部核周隙增寬（圖6C 黑色箭頭處），線粒體（M）中度腫脹，基質(zhì)溶解呈空泡狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）明顯擴(kuò)張（圖6C），細(xì)胞膜完整性被破壞（圖6D黑色箭頭處）。

圖6 電鏡觀察巨噬細(xì)胞焦亡形態(tài)Fig.6 Form of pyroptosis macrophages observed by electron microscope

3 討論

膿毒癥是感染性疾病嚴(yán)重的并發(fā)癥，死亡率高達(dá)40%，LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，免疫系統(tǒng)紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制，其中大量炎癥細(xì)胞激活和促炎介質(zhì)釋放是免疫系統(tǒng)紊亂的重要原因，經(jīng)證明TNF-α 和IL-1β 是膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的早期促炎介質(zhì)，而高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的晚期促炎介質(zhì)，細(xì)胞焦亡的發(fā)生伴隨大量炎癥因子的釋放，這種大量炎癥因子釋放的表現(xiàn)可能與膿毒癥免疫系統(tǒng)紊亂相關(guān)［15-16］。目前針對(duì)膿毒癥的治療方案仍以控制感染、液體復(fù)蘇及生命支持為主，尚缺乏有效的針對(duì)性治療，因此細(xì)胞焦亡有望成為治療膿毒癥的突破口，而一個(gè)穩(wěn)定可靠的體外細(xì)胞焦亡模型是研究其分子機(jī)制所必需的。

細(xì)胞焦亡可分為由caspase-1 激活的經(jīng)典炎癥小體焦亡途徑和caspase-11 激活的非經(jīng)典炎癥小體焦亡途徑。在經(jīng)典炎癥小體途徑中，多種病原相關(guān)分 子 模 式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs）可激活炎癥小體，進(jìn)而活化caspase-1。目 前NOD 樣 受 體 蛋 白3［nucleotidebinding domain（NOD）-like receptor protein 3，NLRP3］是研究最清楚的炎癥小體之一，該炎癥小體由模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白［apoptosis-associated speck-like protein containing a Caspase-recruitment domain（CARD），ASC］和caspase-1組成。在非經(jīng)典炎癥小體途徑中，通常是LPS 直接激活caspase-11 誘導(dǎo)焦亡發(fā)生，還可在NLRP3 和ASC 的共同作用下激活caspase-1［17］。邵峰院士及其團(tuán)隊(duì)在2015年提出GSDMD 是所有炎性caspase 的底物，是焦亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，活化的caspase-1 可以切割多種底物，如GSDMD、pro-IL-1β和IL-18 前體（pro-IL-18），切割后的GSDMD 氨基末端（GSDMD-N）與細(xì)胞膜結(jié)合后形成孔洞，然后釋放出成熟的IL-1β和IL-18［13，16，18-22］。

目前國(guó)內(nèi)外研究焦亡機(jī)制使用的體外模型大多為L(zhǎng)PS 和ATP 共同作用于巨噬細(xì)胞系誘導(dǎo)焦亡，巨 噬 細(xì) 胞 系 焦 亡 模 型 尤 以RAW264.7 為 主［11-13］，RAW264.7 是小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，其形態(tài)和功能都與原代巨噬細(xì)胞有一定的差異［23］，而LPS和ATP 作用的時(shí)間和濃度多通過細(xì)胞活性和藥物毒性確定，此方法雖然將藥物的毒性作用控制到最低狀態(tài)，但無法確定細(xì)胞焦亡的發(fā)生率［12］。根據(jù)細(xì)胞焦亡同時(shí)具有壞死和凋亡表型特征，即焦亡細(xì)胞表現(xiàn)為膜聯(lián)蛋白-V（Annexin-V）和7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin，7-AAD）染色呈雙陽性［24-25］。故本研究以小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞為主要研究對(duì)象，通過流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確快速地檢測(cè)模型構(gòu)建過程中巨噬細(xì)胞焦亡的發(fā)生率，在確保LPS 對(duì)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的毒性作用最小的前提下，發(fā)現(xiàn)經(jīng)500 ng/ml LPS 誘導(dǎo)24 h 后再使用5 mmol/L ATP 刺激4 h 為誘導(dǎo)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞焦亡的最佳組合方式［14］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 組的NLRP3 和caspase-11與炎癥相關(guān)蛋白及炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18 明顯高于control 組，焦亡關(guān)鍵蛋白caspase-1和GSDMD則無明顯差異，此結(jié)果表明LPS成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型。在LPS+ATP 組中，不僅炎癥相關(guān)的蛋白和細(xì)胞因子明顯高于control 組，焦亡關(guān)鍵蛋白caspase-1 和GSDMD 也明顯高于control 組，并且電鏡下也觀察到大量焦亡細(xì)胞，證明了焦亡模型構(gòu)建成功。當(dāng)LPS單獨(dú)作用于巨噬細(xì)胞時(shí)引起了炎癥反應(yīng)，但caspase-1 和GSDMD 沒有增高，當(dāng)加入ATP 之后，caspase-1 和GSDMD 則顯著升高，因此細(xì)胞焦亡的發(fā)生需要PAMPs 和DAMPs 共同作用，而caspase-1 的升高是受caspase-11 影響還是由于經(jīng)典途徑的激活仍需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究在LPS 刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)后加入ATP 成功建立了穩(wěn)定的焦亡模型，為后續(xù)研究膿毒癥免疫細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制提供成熟的體外細(xì)胞模型。