烏蘇里貉源大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗

文│馬亮 （河北省秦皇島市撫寧區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

近年來，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國狐貍、水貂、貉和長毛兔等毛皮動物主要分布于河北、山東、吉林、黑龍江等多個省份和地區(qū)，尤其是狐貍、水貂和貉等毛皮動物的養(yǎng)殖數(shù)量呈逐漸上升趨勢，許多地區(qū)已經(jīng)進入規(guī)?；图s化養(yǎng)殖模式。隨著我國狐貍、水貂和貉等毛皮動物的養(yǎng)殖數(shù)量和養(yǎng)殖密度日益增加，在毛皮動物養(yǎng)殖過程中的相關(guān)病毒性、細菌性疾病及寄生蟲病的報道也逐漸增加，經(jīng)統(tǒng)計，毛皮動物養(yǎng)殖過程中細菌病發(fā)展與流行占較大比重。相關(guān)研究表明，大腸桿菌屬于革蘭氏陰性桿菌，該菌具有多種血清型，大腸桿菌的抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要包括K、O、H 3種不同的抗原結(jié)構(gòu)，不同血清型之間的菌株無交叉保護，不同血清型可以感染不同的動物。大腸桿菌不僅可以引起多種宿主動物發(fā)病，還有一些致病菌株如大腸桿菌O157等可以引起人的感染，該菌對動物和人的危害較高，同時威脅多種動物和人的公共衛(wèi)生安全。貉大腸桿菌病是由不同血清型大腸桿菌引起的一種細菌性傳染病，當貉感染大腸桿菌后，臨床癥狀以敗血癥、腸炎為主要，該病主要對幼貉危害嚴重，具有較高的感染率和死亡率，該病對貉的健康養(yǎng)殖造成嚴重危害。在貉的飼養(yǎng)過程中，隨著抗菌藥物及含抗菌藥物添加劑的濫用，會造成嚴重的耐藥性，給該病治療帶來一定難度。本試驗采集20份死亡貉的病料樣品并進行病原菌（大腸桿菌）鑒定，對其致病性及藥敏試驗進行檢測，以期為該地區(qū)貉大腸桿菌病的防控提供理論參考。

一、材料與方法

1.病料來源。于2023年采集河北省秦皇島市撫寧地區(qū)養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中患病死亡的烏蘇里貉的肝、腎、肺及糞便等病料組織40份。

2.細菌分離與培養(yǎng)。對采集的肝、腎、肺及糞便等病料組織樣片進行編號（1～40），將樣品處理接種到增菌液中，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)12～18小時后，取震蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)物，無菌條件下分區(qū)劃線接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)8～12小時后挑取典型的單個菌落進行革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)觀察。

3.生化試驗鑒定。將大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基分離得到的菌株再挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫純化培養(yǎng)12～18小時后調(diào)整菌液濃度為0.5個麥氏濁度，參照革蘭氏陰性菌試劑盒說明書，無菌條件接種于革蘭氏陰性菌試劑盒中，在37℃培養(yǎng)12～18小時進行生化鑒定，并根據(jù)細菌編碼表進行生化試驗結(jié)果判讀。

4.致病性試驗。將臨床中分離的菌株（大腸桿菌）接種于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期進行菌落計數(shù)，用無菌的普通營養(yǎng)肉湯調(diào)整菌液濃度1×108CFU/毫升。將5只小鼠分為1組，每1株分離的菌株腹腔注射攻毒5只昆明系小鼠為1個攻毒組，每1只小鼠的攻毒劑量為0.25毫升（108CFU/毫升），對照組5只小鼠，每只小鼠注射等量的無菌營養(yǎng)肉湯。致病性試驗期間（7天）觀察每個小組的小鼠發(fā)病與死亡情況。

5.藥敏試驗。將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整臨床分離菌株的菌液濃度為108CFU/毫升，對每一株分離菌株進行藥敏試驗，其操作技術(shù)及判定標準參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2013年推薦的標準K-B紙片法進行。

二、結(jié)果

1.細菌分離培養(yǎng)。從采集患病死亡的烏蘇里貉的肝、腎、肺及糞便等40份病料組織中分離得到10株疑似大腸桿菌的菌株，通過分離菌株的培養(yǎng)特性（伊紅美藍培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基）及形態(tài)學(xué)觀察等進行鑒定，與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的大腸桿菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)基本一致。

2.細菌生化試驗。從采集患病死亡的烏蘇里貉的肝、腎、肺及糞便等40份病料組織樣品中分離得到10株疑似大腸桿菌的分離菌株，通過革蘭氏陰性菌生化鑒定試劑盒鑒定，結(jié)果顯示，分離的10株菌株均鑒定為大腸桿菌。與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的大腸桿菌的生化特性基本上一致，分離率為25%（10/40）。

3.致病性試驗。在致病性試驗期間，攻毒組小鼠在攻毒后2～7天出現(xiàn)了不同的臨床癥狀，如采食量減少、扎堆、腹瀉等，個別小鼠攻毒后未表現(xiàn)臨床癥狀且出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡小鼠可見嚴重腸道病變（腫大、出血及黏膜脫落等）。采集死亡小鼠的肝，并分離到大腸桿菌，對照組小鼠健康存活，經(jīng)過統(tǒng)計分離的5株大腸桿菌均能引起小鼠發(fā)病與死亡，其死亡率在60%以上。說明臨床分離5株沙門菌為致病性大腸桿菌，并命名為E1、E2、E3、E4、E5。

4.藥敏試驗。采用K-B藥敏紙片法檢測5株致病性大腸桿菌分離菌株（E1～E5）的耐藥性。結(jié)果表明，臨床分離的5株致病性大腸桿菌（E1～E5）對頭孢噻呋、頭孢噻肟、安普霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素6種藥物高度敏感，對新霉素、氟苯尼考、多黏菌素3種藥物中度敏感，對其他7種藥物耐藥性嚴重。說明從患病貉病料組織中分離的5株致病性大腸桿菌（E1～E5）對臨床常用藥物具有不同的敏感性。

表1 5株大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果

三、討論

大腸桿菌病是貉養(yǎng)殖過程中常見的細菌性傳染病之一，該病是由血清型大腸桿菌引起的不同日齡的貉（幼貉、母貉）發(fā)病，尤其是幼貉發(fā)病率和死亡率均較高，主要引起母貉流產(chǎn)等，該病對幼貉、母貉的危害較大。大腸桿菌為臨床中常見的人畜共患病原菌之一，該菌在我國養(yǎng)殖場中廣泛分布與流行，應(yīng)引起注意，做好綜合防控措施，減少沙門菌病的發(fā)生與流行。近幾年，隨著貉養(yǎng)殖量的增加，貉的相關(guān)疾病，尤其是細菌性疾病比較復(fù)雜，常呈現(xiàn)混合感染，當發(fā)生疾病時要通過實驗室進行診斷，才能快速確定病原，進行有效防控。近幾年，在我國不同地區(qū)均報道大腸桿菌感染引起貉死亡的病例，并呈現(xiàn)逐年增高趨勢。大腸桿菌成為貉養(yǎng)殖過程中常見疾病，因此在養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意該病的綜合防控。本研究從40份病料樣品中分離到10株大腸桿菌，其分離率為225%（9/40），其中分離的5株大腸桿菌均能引起小白鼠死亡，均為致病性大腸桿菌。說明引起該地區(qū)養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶烏蘇里貉死亡的病原菌為大腸桿菌。因此，規(guī)模化養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶應(yīng)注意貉大腸桿菌病的綜合防控。研究表明，分離的5株致病性大腸桿菌（E1～E5）均對頭孢噻呋、頭孢噻肟、安普霉素等6種藥物高度敏感，對新霉素、氟苯尼考、多黏菌素3種藥物中度敏感，對其他7種藥物耐藥性嚴重。因此，在臨床防治貉大腸桿菌病時，應(yīng)合理使用抗菌藥物，減少其耐藥性，提高治療效果，同時注意貉養(yǎng)殖過程中的環(huán)境消毒。