基于SSR分子標記的‘粵秀3號’黃瓜雜交種子純度及真實性鑒定

金慶敏，林毓娥，王 瑞，鐘玉娟，吳廷全

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，廣東 廣州 510640 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】黃瓜（CucumissativusL.）為葫蘆科黃瓜屬植物，起源于喜馬拉雅山南麓的印度北部、錫金、尼泊爾和中國云南地區(qū)［1-2］，是世界上重要的蔬菜作物。中國為黃瓜最大的種植區(qū)，根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織最新統(tǒng)計結(jié)果（https://www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL/visualize），2021年全球黃瓜種植面積為217.22 萬 hm2，中國種植面積達129.25 萬 hm2，占比59%；全球黃瓜總產(chǎn)量為9 352.88 萬 t，中國黃瓜產(chǎn)量達7559.77 萬 t，占比81%。因此，黃瓜在我國具有重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值［3］。世界范圍內(nèi)主要作物的優(yōu)良品種大多通過雜交育種的方法育成［4］。傳統(tǒng)的品種純度和真?zhèn)舞b定是以形態(tài)學標記為依據(jù)，這種鑒定方法從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度看具有穩(wěn)定可靠的優(yōu)點［5］，但從遺傳學角度看，品種的純度和真?zhèn)舞b定實質(zhì)上是對品種基因型的鑒定，且只有通過鑒定DNA 分子本身才能準確可靠地鑒定品種的基因型［3,6-7］。有限的親本資源和雜交品種的不斷涌現(xiàn)，使得品種尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來越小，蔬菜種子的真實性與品種純度鑒定也越來越難［8］，加之黃瓜為自花授粉作物，人工去雄不及時，常會出現(xiàn)假雜種，導致種子遺傳純度降低，給生產(chǎn)造成巨大損失［9］。為保證優(yōu)良品種能夠產(chǎn)生最大的經(jīng)濟效益，開發(fā)快速、準確、有效的品種鑒定方法顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】DNA 分子標記技術(shù)是隨著分子生物學發(fā)展而興起的新型鑒定方法，具有簡便、快速、準確的特點［10］。目前常用的分子標記技術(shù)包括擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）、序列特征化擴增區(qū)域（Sequence characterized amplified region，SCAR）和簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）等［6,11］。SSR 分子標記具有共顯性、分布廣泛、多態(tài)性高等特征，且SSR 分子標記穩(wěn)定性高、操作簡單、重復性好，且對DNA 質(zhì)量要求低，可準確高效地鑒別大量等位基因［12-13］。鑒于以上優(yōu)勢，SSR 分子標記已在水稻［14-18］、玉米［19-21］、小麥［22-23］、棉花［24-25］、茄子［26］、白菜［27-31］、冬瓜［8］、節(jié)瓜［32］、絲瓜［33］、苦瓜［34］等多種作物上得到應用。近年來，SSR 標記也被廣泛應用于黃瓜［1,3,35-38］，如在黃瓜純度鑒定［3,35］、重要基因定位［39-41］、種質(zhì)資源多樣性分析［42-45］等方面應用較多。周勝軍等［12］在699 對SSR 引物中篩選出3 對引物在‘浙秀1 號’雜交種及其父母本之間表現(xiàn)出穩(wěn)定的共顯性，其在‘浙秀1號’黃瓜雜交種的帶型均為父母本的互補帶，表明3 對引物可用于‘浙秀1 號’黃瓜雜交種的種子純度鑒定，且與田間鑒定結(jié)果一致。孟淑春等［1,38］利用66 對SSR 引物對‘京研綠翡翠’黃瓜品種進行分子標記篩選，得到10 對穩(wěn)定的SSR 引物可用于該品種種子的純度鑒定；利用72對SSR 引物對‘京研冬美9 號’黃瓜品種進行分子標記篩選，得到2 對引物可用于該品種種子的純度鑒定，且上述篩選到的引物鑒定結(jié)果均與田間鑒定結(jié)果一致。李春等［36］從240 個黃瓜SSR分子標記篩選到2 對SSR 分子標記（Cs100 和Cs109），可對‘川綠15 號’華南型黃瓜品種進行種子純度鑒定，且2 對標記的分子鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果一致，并可將‘川綠15 號’與其他品種的黃瓜種子區(qū)分開。以上均為發(fā)掘利用SSR 分子標記、建立快速高效的黃瓜種子純度鑒定方法提供了重要的理論依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c】黃瓜種子純度和真實性鑒定一直是黃瓜商業(yè)化制種中亟待解決的科學問題。傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法存在一定的局限性和不足之處，無法完全確保黃瓜種子的純度和真實性［38］。目前，市場上黃瓜品種居多，存在一品多名或一名多品的情況，且黃瓜遺傳背景狹窄，尤其是華北型黃瓜，遺傳相似性較高，用傳統(tǒng)方法鑒定存在一定難度，利用分子標記的方法可從根本上解決這個問題。同時，本單位所育成的‘粵秀3 號’黃瓜品種具有生長勢強、產(chǎn)量高、抗病抗逆性強的特點，是華南地區(qū)推廣面積較多的品種［46］。為實現(xiàn)‘粵秀3號’黃瓜在生產(chǎn)制種中增質(zhì)提效，以進一步推廣該黃瓜品種，本研究擬采用SSR 分子標記技術(shù)，以‘粵秀3 號’及其父母本為試驗材料，建立一種準確、快速和可靠的方法，用于檢測和鑒定‘粵秀3 號’黃瓜雜交種子的純度和真實性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究圍繞如何選擇適合的SSR 分子標記，以最大程度地提高‘粵秀3 號’黃瓜雜交種子鑒定的準確性和穩(wěn)定性；如何建立一套標準化的實驗流程，確保不同實驗室和操作人員之間的結(jié)果具有一致性；如何驗證該方法在不同批次和環(huán)境下的適用性和穩(wěn)定性，以確保其在實際種子鑒定中的可行性等關(guān)鍵問題展開試驗。為降低‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定成本，提高種子純度鑒定時效性及穩(wěn)定性，利用公開的SSR 標記引物資源，篩選用于‘粵秀3 號’純度和真實性鑒定的特異性引物，并建立一套高效準確的黃瓜品種種子純度鑒定方法，為SSR 標記在黃瓜品種鑒定和‘粵秀3 號’的市場化推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用黃瓜品種為廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所育成的華北型黃瓜雜種一代‘粵秀3號’，其父本材料為C-8，母本材料為A-2。父本C-8植株生產(chǎn)強勢，葉色深綠，葉片較小，抗病性強，皮色深綠有光澤，為長春密刺系統(tǒng)變異植株中所選出的單株。母本A-2 是在100 多份資源材料鑒定的基礎(chǔ)上選出的，原始材料來源于亞洲蔬菜中心，主要表現(xiàn)為早熟、分支強、主側(cè)蔓結(jié)果［46］。‘粵秀3 號’黃瓜早熟，主側(cè)蔓結(jié)瓜，連續(xù)結(jié)果性強，回頭瓜多，瓜型呈長棒狀，勻稱，外形美觀，皮色深綠有光澤，刺瘤密，白刺，單瓜重400～450 g，肉厚，味甜脆嫩，商品性好，耐貯運，較抗枯萎病、霜霉病、炭疽病、白粉病等多種病害，是華南地區(qū)推廣面積較多的品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 所有材料均于2022年7 月中旬浸種催芽播種于穴盤，在蔬菜研究所重點實驗室培養(yǎng)，待種子發(fā)芽后取兩片子葉用于DNA 提取。采用德國進口研磨儀RETSCH（萊馳）MM400 將樣品研磨后，參考姚春鵬等［34］DNA 提取方法提取黃瓜基因組DNA，用DL2000 核酸蛋白分析儀測定OD260、OD280的值，1%瓊脂糖電泳檢測DNA 質(zhì)量。

1.2.2 SSR 分子標記引物的篩選 在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下載SSR 分子標記序列，選用200 對均勻分布在黃瓜染色體上的SSR 分子標記引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參考‘粵秀3 號’黃瓜及其父母本材料，將所提取基因組DNA 各取10 份混合，分別形成‘粵秀3 號’及其父母本材料的混合池，按照父母本帶型互補的原則用于篩選‘粵秀3 號’黃瓜的特異性SSR 分子標記。

1.2.3 PCR 擴增及丙烯酰胺電泳 PCR 擴增反應體系為20 μL：基因組DNA（100 ng/μL）：1.0 μL，Mg2+（20 mmol/L）：1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）：2.0 μL，SSR 上下游引物（10 mmol/μL）：0.4 μL，Taq 酶（5U/ μL）：0.2 μL，10×PCR buffer：2.0 μL，加ddH20 補足至20 μL。

PCR 擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃保持7 min，4℃保存待檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（120 V，1.5 h）；電泳結(jié)束后，丙烯酰胺凝膠經(jīng)0.1% AgNO3銀染15 min，然后用2% NaOH、0.4% 甲醛、0.04%Na2CO3顯色，清水沖洗干凈后在燈箱拍照分析。

1.2.4 DNA 片段的回收及測序 將父母本互補的兩條差異條帶在丙烯酰胺凝膠上用手術(shù)刀割下，然后用DNA 回收試劑盒（全式金EasyPure Quick Gel Extraction Kit）將DNA 片段回收，然后將所回收條帶連接至T 載體（全式金pEASY-T1 Cloning Kit），轉(zhuǎn)化DH5α（全式金Trans5α Chemically Competent Cell）大腸桿菌，挑取陽性單克隆菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 種子純度鑒定 隨機選取42 ?！浶? 號’黃瓜種子提取基因組DNA，用篩選出的SSR 分子標記對‘粵秀3 號’黃瓜種子及其父母本參照1.2.4方法進行PCR 擴增及丙烯酰胺電泳，染色并讀帶，判定‘粵秀3 號’黃瓜種子純度。

1.2.6 田間形態(tài)鑒定 選取‘粵秀3 號’黃瓜種子260 粒，于2022 年7 月中旬浸種催芽，播種于穴盤育苗。8 月上旬（長出1～3 片真葉）移栽238株‘粵秀3 號’黃瓜于廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所白云基地。采用深溝高畦，畦寬1.8～2.0 m，畦高30 cm，株距30 cm，進行常規(guī)化管理。在盛果期隨機選取100 株‘粵秀3 號’黃瓜植株，通過田間性狀（主要包括瓜型、瓜長、皮色、刺瘤、瓜重等）鑒定其種子純度。

1.2.7 SSR 分子標記特異性鑒定 選取市場上同種類型的黃瓜品種（‘中農(nóng)108’‘園豐6 號’‘津綠5 號’‘中農(nóng)8 號’‘津研四號’）種子及其他49 份黃瓜種質(zhì)材料提取DNA，用所篩選的SSR 引物對‘粵秀3 號’及其親本進行PCR 擴增實驗。并對擴增條帶進行檢測，檢驗所篩選的SSR 分子標記對‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定的特異性和有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘粵秀3 號’黃瓜基因組DNA 提取結(jié)果分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，所提取的‘粵秀3 號’黃瓜基因組DNA 條帶清晰，無明顯拖帶和降解現(xiàn)象（圖1）。DNA 質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，其OD260/OD280比值在1.79～1.98 之間，且瓊脂糖膠的條帶單一，表明所提取的DNA 純度高、雜質(zhì)少、質(zhì)量好，滿足本試驗對基因組DNA 的質(zhì)量要求。

圖1 ‘粵秀3 號’基因組DNA 檢測Fig.1 Genomic DNA testing of ‘Yuexiu No.3’

2.2 黃瓜SSR 分子標記的篩選

以‘粵秀3 號’黃瓜父母本為模板，利用合成的200 對SSR 引物進行PCR 擴增及檢測，篩選出12 對父母本條帶差異性引物。將此12 對引物在F1中進行驗證，經(jīng)多次重復比較，篩選雜交種與父母本呈現(xiàn)共顯性互補帶型分離的引物組合，最終篩選出3B-10、2B-41 兩對SSR 引物（表1）。這兩對引物所擴增出的條帶清晰、穩(wěn)定性和重復性好，在父母本中有共顯性差異。3B-10 引物在母本A-2 材料中擴增到特異性條帶P1-A，在父本C-8 材料中擴增到特異性條帶P2-B（圖2A）；2B-41 引物在母本A-2 材料中擴增到特異性條帶P1-C，在父本C-8 材料中擴增到特異性條帶P2-D（圖2B）。

表1 ‘粵秀3 號’SSR 分子標記的引物序列Table 1 Sequences for SSR molecular markers of ‘Yuexiu No.3’

圖2 引物3B-10（A）和2B-41（B）對‘粵秀3 號’及其親本的PCR 擴增Fig.2 PCR amplification of‘ Yuexiu No.3’ and its parents with primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B)

2.3 黃瓜SSR 分子標記純度鑒定

取‘粵秀3 號’黃瓜材料基因組DNA，用3B-10、2B-41 兩 對SSR 引物進行PCR 檢測。3B-10 引物在44 份‘粵秀3 號’黃瓜F1代基因組DNA 擴增結(jié)果中，43 株具有父母本雙方的特異條帶P2-B 與P1-A（圖3），1 株僅具有母本特異性條帶P1-A，得出‘粵秀3 號’黃瓜種子純度為97.73%；2B-41 引物的檢測結(jié)果與3B-10 引物結(jié)果一致（圖4）。綜上，本研究所篩選的兩對SSR 分子標記均可穩(wěn)定、準確地對‘粵秀3 號’黃瓜進行種子純度鑒定。

圖3 引物3B-10 對‘粵秀3 號’親本及其雜交F1 代種子的純度鑒定Fig.3 Purity identification for the seeds from ‘Yuexiu No.3’ parents and their hybrid F1 generation by primer 3B-10

圖4 引物2B-41 對‘粵秀3 號’親本及其雜交F1 代種子的純度鑒定Fig.4 Purity identification for the seeds from ‘Yuexiu No.3’ parents and their hybrid F1 generation by primer 2B-41

2.4 ‘粵秀3 號’黃瓜田間性狀鑒定

田間性狀（主要包括瓜型、瓜長、皮色、刺瘤、瓜重等）鑒定結(jié)果顯示，隨機選取的100 株‘粵秀3 號’黃瓜植株中有98 株為雜交種，2 株性狀表現(xiàn)為母本類型，其田間純度為98%；用3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記對44 份‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定，結(jié)果顯示，43 份為雜交種，1 份為母本類型，種子純度為97.73%，與田間性狀鑒定結(jié)果一致。表明這兩對SSR 分子標記可準確地對‘粵秀3 號’黃瓜進行分子純度鑒定。

2.5 黃瓜SSR 分子標記特異性鑒定

在‘粵秀3 號’黃瓜中增加性狀相似的‘中農(nóng)108’‘園豐6 號’‘津綠5 號’‘中農(nóng)8 號’‘津研四號’黃瓜品種種子作為假種子，同時使用3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記對‘粵秀3 號’及其他49 份種質(zhì)材料進行鑒定。結(jié)果顯示，3B-10、2B-41 兩對引物在‘粵秀3 號’中為雜合互補帶型，在‘中農(nóng)108’‘園豐6 號’‘津綠5 號’‘中農(nóng)8 號’中為父本或母本的純合條帶，在‘津研四號’中則無條帶顯示（圖5），表明3B-10、2B-41 為‘粵秀3 號’的特異性分子標記，可明顯區(qū)分 ‘粵秀3 號’種子與其他參試黃瓜品種。

圖5 引物3B-10（A）和2B-41（B）對‘粵秀3 號’的特異性鑒定Fig.5 Specificity verification of primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B) for ‘Yuexiu No.3’

利用3B-10 及2B-41 對‘粵秀3 號’黃瓜與其他49 份黃瓜種質(zhì)資源的真實性進行鑒定，結(jié)果（圖6、圖7）發(fā)現(xiàn)，僅‘粵秀3 號’黃瓜具有父母本的兩個條帶，其他49 份黃瓜種質(zhì)資源均未出現(xiàn)該兩條電泳條帶。但3B-10 在49 份黃瓜種質(zhì)資源中多態(tài)性較高，未能有效區(qū)分7×8、24×25、36×37 等組合的雜交種。表明本研究所篩選的兩對SSR 分子標記中，2B-41 對‘粵秀3 號’黃瓜具有更好的特異性，可用于‘粵秀3 號’黃瓜真實性鑒定。

圖6 引物3B-10 對‘粵秀3 號’的真實性鑒定Fig.6 Authenticity identification of ‘Yuexiu No.3’ by primer 3B-10

圖7 引物2B-41 對‘粵秀3 號’的真實性鑒定Fig.7 Authenticity identification of ‘Yuexiu No.3’ by primer 2B-41

2.6 SSR 分子標記差異性條帶序列的鑒定分析

為明確3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記在‘粵秀3 號’黃瓜及其父母本中所擴增到的DNA序列及其差異，本研究對父母本中所擴增到的差異條帶進行膠回收，將DNA 片段連接至T 載體測序并對比分析。結(jié)果（圖8、圖9）表明，3B-10在父母本中所擴增到的差異條帶P1-A（160 bp）比P2-B（190 bp）在49～79 bp 處缺少5 個6 堿基（GTGAGG）的簡單重復序列；2B-41 在父母本中所擴增到的差異條帶P1-C（218 bp）則比P2-D（206 bp）在120～131 bp 處缺少12 個堿基。

圖8 引物3B-10 擴增父母本DNA 差異片段的序列比對Fig.8 Sequence alignment of parental DNA differential fragments amplified by primer 3B-10

圖9 引物2B-41 擴增父母本DNA 差異片段的序列比對Fig.9 Sequence alignment of parental DNA differential fragments amplified by primer 2B-41

3 討論

目前，我國蔬菜種子市場處于瓶頸期，種子質(zhì)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要元素，其質(zhì)量的優(yōu)劣程度直接影響到農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。種子純度鑒定不僅是保證種子質(zhì)量不可或缺的一部分，而且在品種權(quán)保護、品種登記管理、種質(zhì)資源多樣性分析及種子生產(chǎn)中有重要價值［38］。相對于周期長、成本高、易受環(huán)境影響的傳統(tǒng)種子純度鑒定方法，以SSR 分子標記為基礎(chǔ)的種子純度鑒定方法快速、高效、低成本且操作簡單，是目前商品種種子純度鑒定的理想方法［8］。

隨著黃瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展及生產(chǎn)的需求，越來越多的新品種涌入市場，同時也存在劣種、假種等現(xiàn)象，在黃瓜育種及制種過程中黃瓜品種純度的鑒定顯得尤為重要［9］。利用SSR 分子標記對黃瓜進行分子純度鑒定，結(jié)果更為準確，且與田間鑒定結(jié)果一致。李海梅等［9］基于黃瓜線粒體父系遺傳特性，從線粒體基因組中的72 對SSR 引物中篩選出4 對引物，在30 份黃瓜品種中呈現(xiàn)多態(tài)性，其中利用引物mtSSR4 和mtSSR10 對4 份黃瓜F1種子純度進行鑒定，結(jié)果顯示黃瓜F1種子的帶型與其父本一致，可將摻入雜交組合中的假種子區(qū)分開。但其種子鑒定結(jié)果有一定的局限性，不能排除F1種子中摻入雜交種父本的情況，而本研究所篩選到的引物可嚴格區(qū)分出雜交種子的父母親本。周勝軍等［12］從699 對SSR 引物中篩選出3 對引物，其可有效鑒定出‘浙秀1 號’黃瓜雜交種及其父母親本，引物穩(wěn)定性良好且種子純度鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致，但其未對所篩選引物的特異性進行鑒定，僅限于對父母本的區(qū)分，不能與其他品種黃瓜種子相區(qū)分。本研究使用與‘粵秀3 號’黃瓜田間性狀類似的5 個黃瓜品種及其他49 份黃瓜種質(zhì)資源對3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記的特異性進行驗證，結(jié)果表明所篩選到的SSR 分子標記2B-41 不僅可鑒定其純度，也可有效地將‘粵秀3 號’與其他相似黃瓜品種區(qū)分開來，說明該標記對‘粵秀3 號’黃瓜品種有良好的特異性，實現(xiàn)了其對品種的真實性鑒定。陳鴻鴕等［37］利用100 對SSR 引物對黃瓜品種‘SH23’及其親本進行篩選，得到5 對在‘SH23’及其親本和對照品種間多態(tài)性較高的SSR 引物，均可有效鑒別出‘SH23’及其他品種，表明SSR 標記可用于黃瓜品種的真實性鑒定。本研究所建立的‘粵秀3號’黃瓜種子純度鑒定方法，在科學取樣的基礎(chǔ)上得到種子純度鑒定結(jié)果，其準確率可達100%。此外，本研究解析了3B-10、2B-41 兩對SSR 分子標記在‘粵秀3 號’黃瓜父母本中的差異條帶，與前人已報道的黃瓜種子純度鑒定相比，豐富了SSR 分子標記的內(nèi)涵，明確了具體的DNA 差異片段序列信息，增強了SSR分子標記在鑒別和區(qū)分黃瓜品種遺傳背景差異的能力。‘粵秀3 號’為華南地區(qū)主要的黃瓜栽培品種，該分子標記的開發(fā)可有效解決制種后的種子質(zhì)量檢測滯后問題，大幅節(jié)約時間及人工成本，為‘粵秀3 號’在華南地區(qū)的推廣提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究從200 對SSR 分子標記引物中篩選得到可用于‘粵秀3 號’黃瓜種子純度鑒定的兩對引物3B-10 和2B-41。3B-10 引物在父、母本中可分別擴增出190 bp 和160 bp 的特異性條帶，而2B-41 引物在父、母本中則分別能夠擴增出206 bp 和 218 bp 的特異性條帶，這些條帶均可作為特異標記使用；兩對引物均能夠有效區(qū)分 ‘粵秀3號’雜交種子與其父本、母本，且該結(jié)果與田間生物學鑒定結(jié)果一致。2B-41 可用于‘粵秀3 號’的真實性鑒定，可有效地將其與其他品種種子所區(qū)分。本研究所開發(fā)的3B-10 和2B-41 兩對SSR分子標記引物可快速、準確、有效地對黃瓜‘粵秀3 號’雜交種子的純度進行鑒定，且操作簡單、成本較低，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有極高的商業(yè)應用價值。