硅對迷你椒草試管苗抗逆生理特性的影響

干雨露，豐 鋒，范紫云，向星星，于奕寧，陳燦強

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】迷你椒草（Cryptocoryneparva）屬于天南星科隱棒花屬觀賞水草，因葉片及佛焰苞的形態(tài)和色彩豐富而具有較高的觀賞價值，已被廣泛應(yīng)用于水族箱造景；同時，其在濕地系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，如可降低水中的營養(yǎng)鹽含量、抑制藻類生長［1］，吸收和積累重金屬［2］以促進(jìn)生態(tài)循環(huán)。目前，椒草種苗主要來源于組培快繁，但品種間差異較大，迷你椒草組培快繁存在增殖系數(shù)低、速度慢、易感染病原菌等問題。此外，在實際生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)，高溫髙濕季節(jié)下試管苗移栽成活率極低，嚴(yán)重限制了試管苗在熱帶地區(qū)、高溫季節(jié)的推廣?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，在植物抗逆性提高的研究中，硅的作用逐漸被重視。硅作為有益植物生長的元素，可通過調(diào)節(jié)植物的氣孔來增強光合作用［3］，進(jìn)而促進(jìn)葉綠素合成、增強植物細(xì)胞壁機械強度、促進(jìn)植株對有機物的吸收［4］。大量研究表明，硅可提高植物過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等保護(hù)酶活性來提高植物抗性［5-7］。王荔軍等［8］認(rèn)為植物葉片表皮積累的硅具有紅外輻射能力，可以大幅降低葉片表皮溫度，提高植物耐熱能力。其次，施硅后可通過控制高溫下的水分蒸騰、減少水分流失，以緩解高溫環(huán)境給植物帶來的傷害［9］。但在轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，在植物未受到脅迫時，硅的添加對植物基因表達(dá)的影響微乎其微［10］，表明硅在植物受到脅迫時發(fā)揮更加重要的作用。此外，在組培過程中添加適當(dāng)質(zhì)量濃度的硅可在一定程度上減少試管苗褐化、玻璃化以及葉片畸形等情況的發(fā)生，對提高愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖率以及組培苗的增殖和生根也有一定作用［11-12］?！颈狙芯壳腥朦c】目前，硅在作物栽培、組培擴(kuò)繁及抗逆性等方面的研究持續(xù)升溫，但在組培中添加硅的研究較少，缺乏添加硅后對試管苗生理代謝方面的影響研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究針對試管苗移栽高溫環(huán)境存活率低的問題，通過添加硅酸鉀、硅酸鈉、硅酸鈣、二氧化硅4種不同的硅源，探究硅對椒草試管苗抗逆生理特性的影響，為后續(xù)試管苗移栽高溫環(huán)境提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試迷你椒草試管苗不定芽，來自廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院植物細(xì)胞工程實驗室。硅酸鉀、硅酸鈣、二氧化硅試劑均購于上海麥克林生化科技有限公司，硅酸鈉試劑購于廣東光華科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 硅對迷你椒草不定芽生理代謝的影響 采用單因素試驗方法，在培養(yǎng)基（MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AD 10.0 mg/L）中分別添加硅酸鉀、硅酸鈉、硅酸鈣、二氧化硅4 種硅源，至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，以不添加硅為對照（CK），每個處理20 瓶，每瓶1 叢，置于25 ℃、光照2 000 Lx（12 h/d）的條件下培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計增殖率。在不定芽接入培養(yǎng)基后的5、15、25 d 時，每個處理分別取樣（整株不定芽）5 g，存放于-40 ℃的冰箱待后續(xù)指標(biāo)測定。

1.2.2 硅對高溫高濕脅迫下迷你椒草生理代謝的影響 篩選出最佳硅源及濃度后，將不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)（1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L），以不添加硅處理為對照（CK）。25 d 后在自然環(huán)境中煉苗7 d 再移栽，每個處理10 株，重復(fù)3 次，隨后放入人工氣候箱（設(shè)置42 ℃、濕度95%、光照6 000 Lx），5 d 后取樣進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.3 指標(biāo)的測定 參照李合生［13］指標(biāo)測定方法，采用蒽酮法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測定可溶性蛋白含量，采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定過氧化物酶（POD）活性，采用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，采用95%乙醇提取法測定葉綠素含量。

以稱重法計算增殖系數(shù)，公式如下：

增殖系數(shù)=增殖芽重-接種芽重

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS 軟件和Duncans分析法對不同指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。使用SPSS 27.0 利用隸屬函數(shù)值和主成分分析賦予權(quán)重，得出不同硅處理綜合評價D值進(jìn)行排序。隸屬函數(shù)值、各綜合指標(biāo)權(quán)重和綜合評價D值的計算公式參考文獻(xiàn)［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽增殖的影響

由圖1 可知，添加硅酸鉀后，迷你椒草不定芽增殖率隨硅酸鉀濃度升高呈先上升后下降趨勢，0.6 g/L 硅酸鉀處理不定芽的增殖系數(shù)顯著高于其他處理，但與CK 相比差異不顯著，其他處理均低于CK。隨各硅源濃度增加，硅酸鈉處理中，不定芽增殖系數(shù)峰值出現(xiàn)在0.8 g/L（2.19）；硅酸鈣處理不定芽增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升后降趨勢；二氧化硅處理中，迷你椒草不定芽增殖率呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。

圖1 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽增殖的影響Fig.1 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on adventitious bud proliferation of Cryptocoryne parva

2.2 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽可溶性糖含量的影響

由圖2 可知，0.2、0.4、0.6 g/L 硅酸鉀處理后，迷你椒草不定芽可溶性糖含量隨處理時間延長呈先降后升趨勢，25 d 時各處理不定芽可溶性糖含量 較CK 分別增長53.84%、51.53%、95.39%、25.62%。硅酸鈉處理后，不定芽可溶性糖含量隨處理時間增加呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，并在0.4 g/L硅酸鈉處理15 d、25 d 后達(dá)到最高，與CK 相比分別增加26.72%、97.92%。硅酸鈣條件下，在5 d 時除0.4 g/L 處理不定芽的可溶性糖含量高于CK，其他處理均低于CK。25 d 時0.4 g/L 處理達(dá)到最大值（12.87 mg/g）。二氧化硅條件下第25 d，所有處理不定芽的可溶性糖含量均隨二氧化硅濃度升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，0.4 g/L 處理顯著高于其他處理，較CK 增長50.86%。

圖2 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on soluble sugars content in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.3 不同硅源及硅濃度對迷你草不定芽可溶性蛋白含量的影響

由圖3 可知，添加不同硅源25 d 后，不定芽可溶性蛋白含量較CK 均有不同程度地增加。硅酸鉀處理后，不定芽可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)時間延長呈緩慢上升趨勢，在0.8 g/L 處理15 d、25 d時顯著高于其他處理，此時硅酸鉀各處理較CK增長14.7%～27.67%。添加0.2 g/L 硅酸鈉5 d 后不定芽可溶性蛋白含量達(dá)到最大值（18.99 mg/g），較CK 增長42.46%，1.0 g/L 處理下隨培養(yǎng)時間增加可溶性蛋白含量減少，表明高濃度硅酸鈉不利于蛋白積累。硅酸鈣處理25 d 后，各處理不定芽可溶性蛋白含量與CK 相比培養(yǎng)差異不明顯，僅增長2.56%～7.88%。二氧化硅處理后，隨培養(yǎng)時間增加，不定芽可溶性蛋白含量先上升后下降，25 d 時各處理較CK 增長13.49%～26.68%。

圖3 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on soluble proteins content in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.4 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽SOD活性的影響

從圖4 可以看出，不同濃度硅酸鉀處理下，迷你椒草不定芽的SOD 活性隨培養(yǎng)時間增加先上升后下降，0.4、0.6 g/L 硅酸鉀處理在15 d、25 d 時不定芽SOD 活性均顯著高于其他處理，25 d 時加硅處理不定芽的SOD 活性較CK 增加40.71%～137.67%。0.8、1.0 g/L 硅酸鈉處理下，迷你椒草試管苗不定芽的SOD 活性趨勢相同，即先上升后下降，并在15 d 時達(dá)到峰值；0.2、0.6 g/L硅酸鈉處理25 d 后其不定芽SOD 活性與CK 相比差異顯著，較CK 分別增長45.53%、41.99%。硅酸鈣處理下，迷你椒草試管苗的SOD 活性隨硅酸鈣濃度增加呈遞減趨勢，但隨培養(yǎng)時間增加其SOD 活性逐漸上升，25 d 時較CK 分別增長62.87%、58.1%、16.09%、31.68%。1.0 g/L 二 氧化硅處理15 d 后，不定芽SOD 活性下降、與CK無顯著差異，0.2 g/L 處理在15 d 時達(dá)到峰值、較CK 增長46.77%。

圖4 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽SOD 活性的影響Fig.4 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on SOD activities in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.5 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽POD活性的影響

由圖5 可知，施硅處理增加迷你椒草不定芽的POD 活性，且4 種硅處理下均隨硅濃度增加呈先上升后下降趨勢。0.6 g/L 硅酸鉀處理不定芽在整個階段表現(xiàn)均較好，其POD 活性分別比CK 增加62.82%、19.97%、39.01%。硅酸鈉處理15 d、25 d 時各處理間POD 活性差異較小，較CK 分別增加4.15%～35.71%、19.49%～38.36%，0.4 g/L處理在第5 d 顯著高于其他處理。硅酸鈣處理下，隨培養(yǎng)時間增加其不定芽POD 活性呈先下降后緩慢上升趨勢，在25 d 時除0.2 g/L 處理外，其他濃度處理均高于CK，分別增長63.52%、98.11%、85.85%、44.65%。二氧化硅條件下，所有處理不定芽的POD 活性在5 d 時大幅增長，15 d 時急聚下降，25 d 時隨二氧化硅濃度增加POD 活性逐漸下降，僅0.2、0.4、0.6 g/L 處理顯著高于CK。

圖5 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽POD 活性影響Fig.5 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on POD activities in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.6 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽MDA含量影響

由圖6 可知，在處理25 d 后，所有加硅處理的不定芽MDA 含量均顯著低于CK，硅酸鉀0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 處理分別較CK 降低9.67%、50.05%、56.20%、39.52%、46.43%。硅酸鈉處理后，隨培養(yǎng)時間增加不定芽MDA 含量均呈現(xiàn)先增后降趨勢，25 d 時較CK 降低31.72%～58.56%。硅酸鈣處理25 d 后，不定芽MDA 含量較CK 降低22.57%～49.12%。二氧化硅處理25 d 時，不定芽MDA 含量隨二氧化硅濃度增加呈先降后升，較CK 降低5.98%～48.73%。

圖6 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽MDA 含量的影響Fig.6 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on MDA content in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.7 不同硅源及硅濃度下迷你椒草不定芽生理代謝綜合性評價分析

通過計算綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，根據(jù)主成分因子的貢獻(xiàn)值大小，計算4 個綜合指標(biāo)的權(quán)重，權(quán)重值分別為0.413、0.259、0.168、0.160（表1）。再根據(jù)隸屬函數(shù)值和權(quán)重大小，計算得到加硅各處理的綜合評價值（D值），并對其進(jìn)行排序，經(jīng)綜合評價排序得出硅酸鉀0.6 g/L處理是較好的，其次是硅酸鉀0.8 g/L、二氧化硅0.2 g/L。

表1 綜合指標(biāo)值、隸屬函數(shù)值、生理指標(biāo)評價D 值及排序Table 1 Comprehensive index values,membership function values,and D values and ranking of physiological index evaluation

2.8 硅對高溫高濕脅迫下迷你椒草生理代謝的影響

由表2 可知，加硅處理（硅酸鉀0.6 g/L）的迷你椒草移栽高溫高濕環(huán)境第5 d 時，各指標(biāo)均顯著高于CK。加硅處理的可溶性蛋白和可溶性糖含量較CK 分別提高51.91%、98.77%，葉綠素含量較CK 提高91.67%。脅迫處理中，加硅處理抑制了迷你椒草電導(dǎo)率上升，顯著提高了SOD、POD 活性。

表2 硅對高溫高濕脅迫下迷你椒草生理代謝影響Table 2 Effects of silicon on physiological metabolism of Cryptocoryne parva under high temperature and humidity stress

3 討論

本試驗以迷你椒草不定芽為研究對象，通過在培養(yǎng)基中添加不同硅源，探究硅對試管苗生理代謝的影響。結(jié)果表明，添加0.6 g/L硅酸鉀25 d后，迷你椒草不定芽的增殖系數(shù)與CK 相比無顯著差異，但其他加硅處理的增殖率均低于CK，表明加硅處理對迷你椒草不定芽增殖無明顯作用，甚至低于對照。有研究指出添加硅后，植物體內(nèi)硅、磷兩種元素的吸收會形成競爭關(guān)系，抑制植物對磷的吸收，導(dǎo)致增殖系數(shù)下降［15］。

硅酸鉀、硅酸鈉處理25 d 時，迷你椒草不定芽的可溶性糖含量均顯著高于CK；硅酸鉀0.6 g/L 處理不定芽可溶性糖含量顯著高于其他處理，較CK 增長95.39%；硅酸鈉0.4 g/L 處理不定芽可溶性糖含量較CK 增長97.92%；二氧化硅處理在25 d 時，隨處理濃度增加，不定芽可溶性糖含量先增后降；而硅酸鈣隨處理濃度增加，不定芽可溶性糖含量則呈下降趨勢，且在濃度0.6 g/L 時其含量顯著低于CK。季明德等［16］通過研究硅在蔗糖合成與分解反應(yīng)中的作用，證明硅能促進(jìn)植物對可溶性糖的積累，可溶性糖作為有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)不僅能為植物生長提供足夠能量，還具有一定信號功能，能提高植物的抗逆性［17-18］，但高濃度的硅對植物可溶性糖積累有抑制作用。可溶性蛋白可降低細(xì)胞冰點，緩解植物在逆境中的傷害［19］，添加硅處理不定芽的可溶性蛋白含量較CK 都有不同程度增長，且處理多呈先下降后上升趨勢，有研究發(fā)現(xiàn)前期硅能增加植物細(xì)胞壁的強度和韌性，保持內(nèi)外滲透壓平衡，減弱可溶性蛋白的信號強度，導(dǎo)致可溶性蛋白累積量減少［20］，硅酸鉀0.6、0.8 g/L 在培養(yǎng)25 d 可溶性蛋白含量最高，兩個處理間無顯著差異，但分別較CK 增長27.34%、27.76%，差異極顯著。硅酸鈉處理不定芽的可溶性蛋白含量在培養(yǎng)25 d 較CK 增長5.75%～24.73%，硅酸鈣0.8 g/L 處理顯著高于其他處理,二氧化硅所有處理可溶性蛋白含量均顯著高于CK、增幅13.49%～26.63%，表明硅可促進(jìn)迷你椒草可溶性蛋白積累。

SOD、POD 作為植株體內(nèi)活性氧清潔劑，有利于提高植物在逆境中的耐受性［21-22］。POD 能催化過氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，對植物呼吸代謝起重要作用［21］，SOD 可將植物細(xì)胞中的O2轉(zhuǎn)化為H2O2，防止脅迫環(huán)境下對細(xì)胞損傷［23-24］。本研究結(jié)果表明，4 種硅的添加均可不同程度提高迷你椒草不定芽的POD、SOD 活性。硅酸鉀添加0.6 g/L 時，不定芽SOD 活性最高。硅酸鈉添加0.2 g/L 時，SOD 活性較CK 提高45.43%；0.8 g/L 時，POD 活性顯著高于其他濃度處理。硅酸鈣和二氧化硅處理不定芽的SOD 活性較CK 分別增長13.49%～62.87%、0.86%～75.85%；硅酸鈣0.6 g/L 處理不定芽的POD 活性為1 253.73 μg/g，二氧化硅0.2 g/L 處理不定芽的POD 活性顯著高于其他處理。MDA 是膜脂過氧化物產(chǎn)物，可作為判斷植物受傷害程度的依據(jù)［25］，本研究中所有施硅處理不定芽的MDA 含量均顯著低于CK，表明硅可以在一定程度上減輕活性氧自由基對植物的傷害。

將試管苗生根移栽后進(jìn)行高溫高濕脅迫，結(jié)果表明加硅處理迷你椒草試管苗的葉綠素含量較CK 增長91.67%，加硅處理能保持膜系統(tǒng)的活力，維持柵欄組織中葉綠素體形態(tài)，促進(jìn)光合速率提高［3］。加硅處理迷你椒草不定芽的可溶性糖、可溶性蛋白含量均顯著高于CK，SOD、POD 活性均高于CK，表明加硅處理能提高迷你椒草試管苗的抗逆性，但也有待后續(xù)更深入的研究。

4 結(jié)論

4 種硅源處理后，迷你椒草試管苗的可溶性糖、可溶性蛋白含量較CK 均有不同程度的增加，表明添加適宜濃度的硅可以提高植物碳水化合物代謝能力和體內(nèi)SOD、POD 的活性。主成分分析及隸屬函數(shù)分析得出，在添加硅酸鉀0.6 g/L時各指標(biāo)表現(xiàn)最好。加硅處理通過提高迷你椒草葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖含量，以及調(diào)節(jié)SOD、POD 活性，緩解高溫高濕脅迫帶來的傷害，增強試管苗抗逆境脅迫能力。