耐鹽閩粵石楠組培快繁體系的建立

向星星，豐 鋒，干雨露，于奕寧

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】閩粵石楠（PhotiniabenthamianaHance）屬薔薇科石楠屬多年生灌木或小喬木，分布于我國(guó)廣東、福建、湖南、浙江等地，位于陸地與海洋交界帶的紅樹(shù)林灘涂，是生產(chǎn)力最高的生態(tài)系統(tǒng)之一，是海岸帶區(qū)域重要的生態(tài)屏障。由于人們對(duì)沿海灘涂隨意采伐、養(yǎng)殖和無(wú)序開(kāi)發(fā)等行為，以及全球氣候變化的加劇，紅樹(shù)林正面臨多種威脅［1-2］。資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在紅樹(shù)林沿海灘涂中，伴生多株耐鹽閩粵石楠，利用這些耐鹽單株建立耐鹽閩粵石楠組培快繁體系，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，為沿海灘涂綠化提供種苗支持，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值［3-4］，應(yīng)用前景廣闊。【前人研究進(jìn)展】石楠屬植物適應(yīng)性較強(qiáng)，對(duì)土質(zhì)要求不高，耐瘠薄、耐鹽堿［5］，其應(yīng)用涉及生態(tài)綠化、醫(yī)療食品和生化產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域，在綠化產(chǎn)業(yè)生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮著不可或缺的積極作用。目前關(guān)于石楠屬植物的研究主要集中于扦插育苗技術(shù)［6-7］、容器育苗技術(shù)［8］、病蟲(chóng)害防治［9-10］等。在石楠屬植物組培快繁研究方面，孔祥生等［11］最早以石楠側(cè)枝嫩芽為外植體建立組培快繁體系；李明銀等［12］以紅葉石楠葉片和莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明TDZ 和AgNO3對(duì)愈傷有促進(jìn)作用，誘導(dǎo)率最高達(dá)55%；吳麗君等［13］以紅葉石楠‘魯賓斯’的莖段為外植體進(jìn)行組培技術(shù)研究，但其離體培養(yǎng)存在增殖率高、生根率低的問(wèn)題，生根率僅有49%；孫利忠等［14］以紅葉石楠‘紅羅賓’的帶芽莖段誘導(dǎo)出不定芽并進(jìn) 行增殖、生根，仍存在增殖倍數(shù)低、分化率不高等問(wèn)題。國(guó)外也有通過(guò)紅葉石楠莖段組織培養(yǎng)的相關(guān)研究［15］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前仍未見(jiàn)組培快繁繁殖耐鹽閩粵石楠種苗的報(bào)道，因此建立一套完整、系統(tǒng)的耐鹽閩粵石楠組培快繁體系具有重要現(xiàn)實(shí)意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以耐鹽閩粵石楠實(shí)生苗帶芽莖段為材料，探討無(wú)菌材料獲得、腋芽誘導(dǎo)、不定芽增殖和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基，進(jìn)而建立組培快繁體系。通過(guò)篩選耐鹽閩粵石楠最佳外植體滅菌處理、離體快繁激素濃度最佳組合，旨在建立比較系統(tǒng)完整的耐鹽閩粵石楠組培快繁體系，為沿海灘涂利用提供種苗支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021 年11 月，在廣東省深圳市大鵬新區(qū)紅樹(shù)林濕地采集耐鹽閩粵石楠種子。試驗(yàn)于廣東海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，將采集的種子洗凈暗紅色果皮，去除雜質(zhì)后，用1% NaClO 浸泡消毒20 min。將經(jīng)過(guò)消毒的種子與細(xì)沙以體積比3∶1 混勻置于自封袋內(nèi)，濕度保持30%～40%，于4 ℃冰箱中低溫沙藏。經(jīng)低溫沙藏保存3 個(gè)月后播種，獲得耐鹽閩粵石楠實(shí)生苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體預(yù)處理及滅菌 選擇長(zhǎng)勢(shì)健壯、規(guī)格統(tǒng)一的耐鹽閩粵石楠實(shí)生苗，以耐鹽閩粵石楠莖段為外植體，去掉葉片，用洗衣粉漂洗20 min，自來(lái)水沖洗60 min 后，備用。外植體預(yù)處理后，在超凈工作臺(tái)中，首先將外植體用無(wú)菌水清洗1 次，置于無(wú)菌空瓶中，分別以75%乙醇（10、20、30 s）、0.15%氯化汞（1、3、5 min）組合處理對(duì)外植體進(jìn)行滅菌，然后切成1 cm 左右的莖段，接種于MS 基本培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶 接種1 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。接種后30 d 統(tǒng)計(jì)污染率、成活率。

污染率（%）=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

成活率（%）=萌芽不污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 按照1.2.1 的方法，將預(yù)處理后的外植體用75%乙醇滅菌10 s、0.15%氯化汞滅菌3 min，接種至不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。以MS 為基本培養(yǎng)基，以6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）組合處理對(duì)外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶接種2個(gè)莖段，3 次重復(fù)。接種后30 d 統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率和平均萌芽數(shù)。

誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出不定芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)

平均萌芽數(shù)（個(gè)）=總萌芽個(gè)數(shù)/無(wú)菌外植體數(shù)

1.2.3 不定芽增殖培養(yǎng) 將1.2.2 誘導(dǎo)的不定芽培養(yǎng)60 d，轉(zhuǎn)接到不同增殖培養(yǎng)基。采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以基本培養(yǎng)基（MS、1/2MS、WPM）、6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）、NAA（0.1、0.25、0.5 mg/L）組合處理進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶接種1 個(gè)不定芽，3 次重復(fù)。接種后30 d 統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=增殖培培養(yǎng)后的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù)

1.2.4 不定芽生根培養(yǎng) 將1.2.3 增殖培養(yǎng)獲得的不定芽培養(yǎng)2～4 代后，轉(zhuǎn)接到不同生根培養(yǎng)基。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，分別以NAA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）和IBA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）進(jìn)行不定芽生根培養(yǎng)，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶接種3～5 株不定芽，3次重復(fù)。接種后60 d統(tǒng)計(jì)生根率、根長(zhǎng)和根系數(shù)量，用直尺測(cè)定根長(zhǎng)。

上述培養(yǎng)基均添加瓊脂5.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH 5.8；培養(yǎng) 條件為：溫度25（±1）℃、光照強(qiáng)度2 000 Lx、光照時(shí)間12 h/d。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用DPS 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析（Duncan）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對(duì)耐鹽閩粵石楠莖段滅菌效果的影響

如表1 所示，不同滅菌方法處理的耐鹽閩粵石楠莖段污染率和成活率不同。隨著75%乙醇和0.15%氯化汞處理時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染率降低，成活率也降低。當(dāng)75%乙醇消毒20 s、0.15%氯化汞消毒5 min 后，外植體污染率 為0，但外植體呈深褐色、不能誘導(dǎo)出不定芽，表明外植體受到了傷害。綜合污染率和成活率，最佳的滅菌處理是75%乙醇10 s+0.15%氯化汞3 min，此時(shí)污染率為19.0%、成活率為76.67%，與其他處理差異顯著。

表1 不同滅菌方法對(duì)耐鹽閩粵石楠莖段滅菌效果的影響Table 1 Effects of different sterilization methods on the sterilization effect of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance stems

2.2 6-BA 與NAA 不同濃度組合對(duì)耐鹽閩粵石楠莖段誘導(dǎo)的影響

觀察接種第14 天的耐鹽閩粵石楠莖段發(fā)現(xiàn)，腋芽在6-BA 與NAA 不同濃度組合的9 種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均可萌發(fā)，少量培養(yǎng)基基部可見(jiàn)愈傷組織形成。如表2 所示，當(dāng)NAA 濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率顯著提升；當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA 時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最高、達(dá)73.33%，平均萌芽數(shù)1.03 個(gè)，生長(zhǎng)狀況良好（圖1），與其他處理差異顯著。添加0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA 以及添加2.0 mg/L 6-BA、0.3 mg/L NAA 的處理誘導(dǎo)率均低于50%，表明培養(yǎng)基添加激素濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生。耐鹽閩粵石楠不定芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

圖1 耐鹽閩粵石楠莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance stems of induction culture

表2 不同激素濃度對(duì)耐鹽閩粵石楠莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響Table 2 Effects of different hormone concentration on induction culture of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance stem segments

2.3 基本培養(yǎng)基、6-BA 和NAA 對(duì)耐鹽閩粵石楠不定芽增殖的影響

如表3 所示，以1/2MS 為基本培養(yǎng)基處理的閩粵石楠不定芽增殖系數(shù)較高，且不定芽長(zhǎng)勢(shì)較好，葉片嫩綠；以WPM 為基本培養(yǎng)基處理的不定芽生長(zhǎng)較矮；隨著6-BA 濃度增加，不定芽增殖系數(shù)逐漸升高，當(dāng)6-BA 濃度為2.0 mg/L 時(shí)，平均增殖系數(shù)為2.83，較1.0、3.0 mg/L 6-BA 處理分別高0.29 和0.52。通過(guò)對(duì)各因素進(jìn)行極差分析發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基、6-BA 和NAA 的極差值R分別為0.3、0.5、0.2，表現(xiàn)為6-BA ＞基本培養(yǎng)基＞NAA，說(shuō)明6-BA 為增殖培養(yǎng)的主要影響因子，其次是基本培養(yǎng)基。綜上，耐鹽閩粵石楠最佳增殖培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖系數(shù)達(dá)3.1，且不定芽生長(zhǎng)健壯（圖2）。

圖2 耐鹽閩粵石楠不定芽增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of adventitious buds of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance of proliferation culture

表3 基本培養(yǎng)基、6-BA 和NAA 對(duì)耐鹽閩粵石楠不定芽增殖的影響Table 3 Effects of basic medium,6-BA and NAA on the proliferation of adventitious buds of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance

2.4 NAA 和IBA 對(duì)耐鹽閩粵石楠不定芽生根的影響

截取2～3 cm 的不定芽進(jìn)行單株生根培養(yǎng)，如表4 所示，組培苗在未添加激素的1/2MS 培養(yǎng)基中，生根率為0；隨著添加激素濃度提高，莖稈更加粗壯、根系變粗，基部產(chǎn)生大量愈傷組織（圖3），其中IBA 較NAA 對(duì)耐鹽閩粵石楠不定芽的生根誘導(dǎo)效果更好，當(dāng)IBA 濃度為0.4 mg/L 時(shí)，生根率為87%，平均根長(zhǎng)為3.78 cm，平均根數(shù)為6.22 條，顯著高于其他處理。綜上，耐鹽閩粵石楠的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/L IBA。

圖3 耐鹽閩粵石楠不定芽生根培養(yǎng)生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of adventitious buds of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance of rooting culture

表4 NAA 和IBA 對(duì)耐鹽閩粵石楠不定芽生根的影響Table 4 Effects of NAA and IBA on rooting of adventitious buds of salt-tolerant Photinia benthamiana Hance

3 討論

本研究采用耐鹽閩粵石楠莖段為外植體直接誘導(dǎo)不定芽，進(jìn)而進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)，縮短了從外植體到組培苗的整個(gè)誘導(dǎo)周期，是一種更加快速高效的再生體系［16］。降低耐鹽閩粵石楠外植體污染率是研究其組培快繁技術(shù)需解決的重要問(wèn)題，通常取自田間的外植體帶菌較多，較難徹底消毒滅菌［17］。因此尋求最佳的滅菌藥劑及其濃度和時(shí)間的組合，控制外植體污染和成活率，是滅菌環(huán)節(jié)的重要問(wèn)題［18-19］。本試驗(yàn)通過(guò)取當(dāng)年生耐鹽閩粵石楠實(shí)生苗莖段為材料進(jìn)行75%乙醇滅菌10 s+0.15%氯化汞滅菌3 min，外植體污染率為19%，成活率為76.67%，有效解決了無(wú)菌體系建立面臨的污染率較高問(wèn)題。劉松青等［20］在桑芽組織快繁技術(shù)研究中采用消毒75%酒精處理1 min+5%次氯酸鈉溶液處理10 min 進(jìn)行篩選試驗(yàn)，效果較好。

增殖培養(yǎng)是種苗擴(kuò)繁的重要階段［21］，生長(zhǎng)素類物質(zhì)和細(xì)胞分裂素物質(zhì)對(duì)種苗質(zhì)量和培養(yǎng)效率有很大影響［22-23］。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也是一種高效率的方法［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA 和NAA 對(duì)耐鹽閩粵石楠不定芽誘導(dǎo)均有顯著影響。龔霄雯［25］研究發(fā)現(xiàn)，在添加1.0 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 的培養(yǎng)基中，紅葉石楠‘紅羅賓’的腋芽萌發(fā)率達(dá)95%；獨(dú)山石楠在添加2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基中，腋芽萌發(fā)率達(dá)83.3%?；九囵B(yǎng)基對(duì)不定芽的增殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況也有顯著影響［26］，MS 培養(yǎng)基是增殖培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基，這與邢建宏等［27］研究結(jié)果相似。為更全面探討不同培養(yǎng)基對(duì)耐鹽閩粵石楠增殖效果的影響，本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討MS、1/2MS、WPM 培養(yǎng)基對(duì)其增殖培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)1/2MS 培養(yǎng)基的增殖效果優(yōu)于MS 培養(yǎng)基。這可能是由于MS 培養(yǎng)基鹽離子濃度過(guò)高，造成較高的滲透壓，導(dǎo)致一定程度上抑制了植物細(xì)胞的分裂分化［28］，表明基本培養(yǎng)基對(duì)石楠外植體的增殖培養(yǎng)中有一定影響。

木本植物生根是離體培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟。研究表明，基本培養(yǎng)基及激素濃度配比、蔗糖和瓊脂等添加物都會(huì)影響組培苗的生根效果［29］。NAA和IBA 是誘導(dǎo)不定根形成的常用激素，其濃度配比影響植物生根效果，在保證生根的情況下，使根多且粗壯，利于移栽成活［30］。高濃度激素條件下，莖段基部產(chǎn)生大量愈傷組織，根數(shù)增加，但生根率降低，根長(zhǎng)變短。由此推測(cè)，低濃度激素有利于促進(jìn)耐鹽閩粵石楠組培苗生根。

4 結(jié)論

本研究以耐鹽閩粵石楠莖段為材料，建立了一套外植體滅菌、腋芽誘導(dǎo)、不定芽增殖和生根培養(yǎng)的組培快繁體系。其中，莖段經(jīng)75%乙醇滅菌10 s+0.15%氯化汞滅菌3 min 處理后，滅菌效果最佳，污染率19%，成活率76.67%；誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 最佳，誘導(dǎo)率為73.33%，平均萌芽數(shù)1.03 個(gè)；增殖培養(yǎng)以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 最佳，增殖系數(shù)為3.1，叢生芽生長(zhǎng)快且健壯；生根培養(yǎng)以1/2MS+0.4 mg/L IBA 最佳，生根率為87%，平均根數(shù)6.22 條，平均根長(zhǎng)3.78 cm。