基于3R原則探討動物實驗中人道終點的判定與應(yīng)用

李春令,劉增祥,溫成麗,呂實波,程東,孫昌華

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院,山東 濟(jì)南 250101;2.山東省疾病預(yù)防控制中心,山東 濟(jì)南 250014)

實驗動物機(jī)構(gòu)是科學(xué)研究的基礎(chǔ)平臺[1],要想獲得準(zhǔn)確的動物實驗數(shù)據(jù),必須依靠標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物、科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭游飳嶒炦^程、適合實驗動物生存的實驗環(huán)境[2]。在生命科學(xué)及生物醫(yī)藥等多行業(yè)、多領(lǐng)域的研發(fā)和各類實驗中,實驗動物起著越來越重要和不可或缺的基礎(chǔ)性支撐作用[3],通常被稱為“不可替代的活的精密儀器”。隨著人們動物保護(hù)意識的提高,動物實驗帶來的倫理學(xué)挑戰(zhàn)變得越來越突出,如何處理好動物實驗與動物保護(hù)的關(guān)系已是當(dāng)今社會關(guān)注的熱點之一[4-6]。

近年來,國內(nèi)相繼頒布并實施了一系列的標(biāo)準(zhǔn),例如GB/T 35892-2018《實驗動物福利倫理審查指南》[7]、T/CALAS 73-2019《實驗動物福利倫理委員會工作指南》[8]、DB11/1734-2020《實驗動物福利倫理審查技術(shù)規(guī)范》[9]、T/CALAS 31-2017《實驗動物安樂死指南》[10]、GB/T 39760-2021《實驗動物安樂死指南》[11]、RB/T 173-2018《實驗動物人道終點評審指南》[12]。2000年OECD發(fā)布了《應(yīng)用臨床體征識別、評估安全性評價中動物實驗仁慈終點的指南》、美國國家科學(xué)院發(fā)布的《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》、加拿大動物保護(hù)協(xié)會(CCAC)發(fā)布了《研究、教學(xué)和檢測中選擇實驗動物仁慈終點指南》、歐盟27國在2013年實施的新保護(hù)實驗用動物指令均對仁慈終點或人道終點的判定及安樂死的時機(jī)、方法和評價等都做了一些詳細(xì)介紹。人道終點(humane endpoints)亦稱仁慈終點,指在動物實驗中動物承受嚴(yán)重疼痛、痛苦和窘迫,或瀕死的早期階段,實驗研究人員人為地介入來結(jié)束動物生命的時間點即作為試驗的終點[13]。2000年OECD(經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織)對人道終點的定義為:能反映實驗動物遭受嚴(yán)重疼痛、痛苦或瀕臨死亡最早的指標(biāo)[14-15],其核心為“在所提及指標(biāo)出現(xiàn)時提前對動物實施安樂死”。OECD鼓勵在毒性與安全性的評估研究中使用人道終點理論,在實驗動物遭受疼痛與痛苦前進(jìn)行預(yù)測,充分踐行3R原則。在實驗過程中應(yīng)隨時觀察,適時對符合人道終止?fàn)顟B(tài)的動物及時終止實驗[1]。

減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)的“3R”原則是實驗動物使用和管理領(lǐng)域的國際發(fā)展趨勢,也是當(dāng)今國際上開展動物試驗普遍遵循的動物福利原則[1,16-18]。隨著“3R”原則的深入淺出,人道終點逐步被看作“優(yōu)化”原則的重要組成部分,其目的是盡可能減輕實驗期間動物遭受的疼痛和痛苦[14,19]。資料表明,研究人員對不同種屬的實驗動物安樂死、人道終點的探索從未終止,并進(jìn)行不斷的優(yōu)化和完善[20-35]。通過對動物人道終點的判定原則和方法進(jìn)行探討,在最大限度保障動物福利的前提下,有效保證了動物實驗數(shù)據(jù)的真實性、準(zhǔn)確性和完整性,為從事動物實驗的研究人員提供了一定的參考。

1 人道終點判定的基本原則

根據(jù)不同的實驗研究目的,實驗方案制定時應(yīng)包括動物人道終點的時機(jī),方案需通過IACUC(實驗動物福利與倫理委員會)的審核。在實驗方案中應(yīng)明確說明試驗終點的科學(xué)性、必要性和對動物福利的考慮,對一些與動物福利和倫理相矛盾且必須開展的實驗時,方案中要有充分的理由。

根據(jù)動物實驗的要求和動物狀態(tài),明確人道終點的判定準(zhǔn)則,既要符合現(xiàn)行公認(rèn)原則,又要保證相關(guān)研究人員可以理解、掌握和運用[1]。實驗中,人道終點的評估是個持續(xù)過程,當(dāng)研究的科學(xué)目標(biāo)已達(dá)到,沒必要進(jìn)行下去時,應(yīng)及時終止并記錄。實驗中,當(dāng)動物遭受到非實驗本身引起且未預(yù)料到的意外痛苦時,應(yīng)實施人道終點并記錄。動物遭受的疼痛/痛苦由實驗本身引起且實驗前已有預(yù)料或?qū)嶋H中遭受的痛苦比預(yù)料更嚴(yán)重時[14],應(yīng)實施人道終點并記錄。確保專題負(fù)責(zé)人(SD)、IACUC共同參與人道終點的制定。IACUC應(yīng)負(fù)責(zé)監(jiān)督動物實驗過程中人道終點的判定,及時制止和糾正不當(dāng)行為,并給予專業(yè)的指導(dǎo),在人道終點的判定和實施過程中應(yīng)保證獸醫(yī)的權(quán)威性。人道終點的確定不是一成不變、一勞永逸的事情,它可因動物實驗的研究目的、研究對象及研究類型等不同而存在差異,它是一個持續(xù)不斷優(yōu)化的過程。

2 人道終點的判定方法

選擇和確定人道終點的目的是為了在動物因?qū)嶒炘馐懿槐匾奶弁春屯纯嘀皽?zhǔn)確地預(yù)測出結(jié)束實驗的終點,最大限度地縮短實驗時間,避免或減輕實驗后期給動物造成的疼痛和痛苦[36]。因此,國際上將人道終點及安樂死作為一種優(yōu)化策略,用來減輕動物在試驗期間遭受的疼痛和痛苦[19]。動物人道終點判定,需區(qū)分動物疾病和瀕死狀態(tài)。如動物出現(xiàn)下列任何癥狀時,應(yīng)考慮執(zhí)行人道處死動物的方法[19,37-47]。

2.1 通用性指標(biāo)

2.1.1 體質(zhì)量變化主要包括體質(zhì)量快速下降、成長期動物無增重,未監(jiān)測到體質(zhì)量變化動物可呈現(xiàn)出惡病質(zhì)狀態(tài)及持續(xù)性肌肉消耗狀況等,還可反映為動物食欲不振或廢絕。

2.1.2 外部體征的主要表現(xiàn)各種不良因素引起的全身性脫毛或被毛蓬松或被毛污穢不潔,無法治療的長期腹瀉,持續(xù)性的倦怠伴隨蜷縮、弓背、目光呆滯、精神萎靡、嗜睡或持續(xù)躺臥等。

2.1.3 生理指標(biāo)動物在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中,機(jī)體功能和代謝發(fā)生改變的情況。包括可測量的臨床指標(biāo)如心率、呼吸頻率、體溫、血液、生理生化指標(biāo)等;描述性的臨床癥狀如腹瀉、脫水、漸進(jìn)性皮炎、咳嗽、呼吸困難、鼻腔分泌物、黃疸、發(fā)紺或蒼白、貧血、出血等。

2.1.4 異常行為包括活動性下降、警覺性下降、不活躍、刻板行為、離群、自殘、焦躁不安等。

2.1.5 疼痛/痛苦等級量化評分疼痛/痛苦等級量化評分主要包括體質(zhì)量變化、體態(tài)、可測量臨床指標(biāo)、行為、對外界刺激的反應(yīng)5項,評分分為0～3四個等級,每個評分等級對應(yīng)相應(yīng)的變量(見表1)。

表1 疼痛/痛苦等級量化評分

2.2 特定性指標(biāo)特定性指標(biāo)指針對特定研究需特別觀察的指標(biāo)。常見的特定指標(biāo)主要包括以下幾個指標(biāo)。

2.2.1 毒理學(xué)研究的觀察指標(biāo)一般觀察:脫水,體質(zhì)量下降,身體部位缺失,姿勢異常,體溫降低,附屬物破潰,腫脹,軟組織腫塊,脫垂,包莖;皮膚和被毛:脫毛、沾尿液或糞便、蒼白、紅腫、發(fā)紺、黃疸、傷口、膿腫、潰瘍;眼睛:眼球突出,眼球下垂,紅眼,流淚,眼球渾濁;口、鼻、頭部:斜頸,流涕,牙齒咬合不全,流涎;呼吸:打噴嚏,呼吸困難,呼吸急促;尿液:變色,血尿,多尿,無尿;糞便:變色,血便,稀便/腹瀉;運動:多動、昏迷、共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈、肌肉震顫。

2.2.2 腫瘤研究的相關(guān)指標(biāo)常規(guī)實驗,腫瘤負(fù)擔(dān)不應(yīng)超過動物正常體重的5%;治療性實驗中,不能超過動物體重的10%;腫瘤不能到達(dá)嚴(yán)重影響動物行使正常功能的位置,或由于腫瘤的生長引起動物痛苦(固體腫瘤);動物減輕的體重超過正常體重的20%(應(yīng)考慮到腫瘤所占的重量);腫瘤生長部位出現(xiàn)潰瘍或感染;轉(zhuǎn)移到其他組織器官;持續(xù)的自殘行為。

2.2.3 感染性研究的相關(guān)指標(biāo)動物體溫降低超出一定限度(如超過4～6 ℃);體重下降,如減輕(下降10%～20%)可作為人道終點重要指標(biāo);活動次數(shù)減少、嗜睡等其他異常生理和行為變化。

2.3 大動物(含非人靈長類動物)人道終點的判定未麻醉或鎮(zhèn)靜狀態(tài)下,動物無法站立或極度勉強(qiáng)才可站立長達(dá)24 h。高溫或低溫超過24 h且經(jīng)過相應(yīng)的治療無改善。體質(zhì)量降低15%～20%,或動物出現(xiàn)惡病質(zhì)或消耗性疾病。動物食欲廢絕達(dá)5 d或飲欲廢絕達(dá)3 d,或食欲、飲欲減退(低于正常量的50%)分別達(dá)7 d和5 d且經(jīng)治療無改善。動物感染情況明確可知,或因動物體溫升高、白細(xì)胞數(shù)目增加并診斷為感染,在抗生素治療無效并伴隨動物全身性不適癥狀出現(xiàn)時。出現(xiàn)器官功能喪失的臨床癥狀且治療無效,或經(jīng)獸醫(yī)判定預(yù)后不良時。包括但不限于:心血管系統(tǒng):失血過量、給予輸液治療后仍然貧血(低于20%);呼吸系統(tǒng):呼吸困難、發(fā)紺;消化系統(tǒng):嚴(yán)重嘔吐或下痢、消化道阻塞、套疊或腹膜炎;泌尿道系統(tǒng):腎衰竭(肌酐、尿素氮值升高超過正常范圍2倍以上);肌肉骨骼系統(tǒng):肌肉受損或骨折導(dǎo)致肢體功能喪失;皮膚:無法治愈的傷口,反復(fù)性自殘;神經(jīng)系統(tǒng):中樞神經(jīng)抑制(長時間對外界刺激無反應(yīng))、震顫、痙攣、癱瘓、對止痛劑治療無效的疼痛。

3 動物瀕死期的判定

瀕死期又稱臨終期,是死亡過程的開始階段。這個時期動物各系統(tǒng)的功能嚴(yán)重紊亂,中樞神經(jīng)系統(tǒng)自腦干以上功能處于抑制狀態(tài)。動物表現(xiàn)為意識模糊或消失,臥地昏迷,呼喚不應(yīng),對刺激幾乎無反應(yīng),機(jī)體反射反應(yīng)減弱或消失;體質(zhì)量消瘦,嚴(yán)重時可呈惡病質(zhì)狀態(tài);體溫驟降;瞳孔呈散大狀態(tài);心臟減弱、心率波動;血壓下降;呼吸微弱而不穩(wěn),或出現(xiàn)病理性的呼吸。瀕死期的持續(xù)時間長短不一,主要與動物的死因、機(jī)體狀態(tài)和救治情況等因素有關(guān),可從幾秒鐘到數(shù)小時,甚至?xí)L。

在藥理、毒理學(xué)等動物實驗中,為了獲取實驗的第一手?jǐn)?shù)據(jù),對瀕死期的動物采用人道終點的判定原則和方法是非常必要的,尤其是在新藥研發(fā)或藥物非臨床安全性評價研究過程中為及早獲取動物的死亡原因提供了寶貴的資料。通過及時、及早地發(fā)現(xiàn)并判定瀕死動物,為后續(xù)的緊急剖檢、采血、采尿(如果可能)、組織臟器的摘取提供了可能性和可操作性,可獲取血液學(xué)、血清生化、血凝學(xué)、尿液(如果可能)等臨床檢驗指標(biāo)所需樣本,對摘取的動物臟器進(jìn)行詳細(xì)大體病理學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查,通過對臨床檢驗數(shù)據(jù)、病理學(xué)檢查結(jié)果、動物體質(zhì)量變化及大體癥狀觀察進(jìn)行綜合分析,為判定藥物的毒性或毒性靶器官提供了極為重要的參考依據(jù)。

4 結(jié)語

實驗動物和動物實驗是生命科學(xué),特別是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中的重要條件和基礎(chǔ)。實驗動物被研究人員公認(rèn)為“活的試劑”“活的精密儀器”,其自身常常作為藥物安全性評價的特殊載體,其生存狀態(tài)和福利的好壞直接影響實驗結(jié)果,所以深入探討動物實驗中人道終點的判定與應(yīng)用,在動物福利和倫理越來越受到關(guān)注的今天顯得尤為重要。近年來,雖然我國在人道終點的研究和應(yīng)用方面取得了一定進(jìn)展,但是與西方發(fā)達(dá)國家相比仍然存在許多不完善之處,需要不斷的改進(jìn)。如何科學(xué)合理地確定動物實驗的人道終點,在實現(xiàn)研究目的的同時,最大限度地減輕實驗動物所承受的疼痛和痛苦,是動物使用計劃中一項重要的工作。實驗動物行業(yè)或領(lǐng)域內(nèi)要努力遵循“3R”原則,在科學(xué)、合理、人道的使用動物的同時,促進(jìn)生命科學(xué)、生物醫(yī)藥研究與人類道德文明同步和諧發(fā)展[48-50]。

目前,各從事動物實驗的研究機(jī)構(gòu)、CRO公司對動物人道終點的判定和應(yīng)用尤其是對瀕死期或需要人道終點的動物存在著標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、參差不齊的現(xiàn)狀,故此類動物的實驗數(shù)據(jù)誤差較大。本文通過對動物人道終點的判定原則和方法進(jìn)行詳細(xì)和深入的探討,結(jié)合實踐中總結(jié)出的一點心得,難免存在不足之處,僅供同道們參考。同時,希望大家能夠進(jìn)一步深刻理解和踐行實驗動物福利、倫理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和要求,不斷完善動物人道終點的適用原則和范圍并靈活應(yīng)用,在動物實驗中不斷的獲取新的經(jīng)驗、認(rèn)知和其他良好實踐,以指導(dǎo)人道終點的標(biāo)準(zhǔn)不斷持續(xù)的改進(jìn)和完善。