新冠病毒SARS-CoV-2主蛋白酶3CLpro抑制劑的多步虛擬篩選

杜宏金,余曉譚,李翰旭,萬洛婷,鄒瑜

(1.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心,北京100038;2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,湖北省職業(yè)病預(yù)防與控制重點實驗室,湖北 武漢 430070;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,湖北 武漢 430030)

自2019年12月新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)以來,全球陷入了持續(xù)的社會和經(jīng)濟的混亂。截至2023年4月,全球累計確診病例已超過6億,累計死亡病例超過600萬例。新型冠狀病毒SARS-CoV-2(又名2019-nCoV)是新型冠狀病毒肺炎的致病因子,目前此病毒已變異分化出多種亞型,并且有可能持續(xù)變異[1]。因此,我們需要開發(fā)出一套,能快速篩選出對新冠病毒有抑制力先導(dǎo)化合物的方法,加快藥物研發(fā)進程。

冠狀病毒是一大類單鏈包膜RNA病毒,可分為4大類,其中SARS-CoV-2屬于β屬[2]。冠狀病毒通過刺突蛋白結(jié)合表面受體進入宿主細胞[3]。SARS-CoV-2的表面受體是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)[4]。病毒進入宿主細胞后,其陽性基因組RNA直接附著于宿主核糖體,然后將兩個大的共端多聚蛋白經(jīng)主蛋白酶加工成相應(yīng)的組件,用于組裝新的病毒。為了復(fù)制RNA基因組,冠狀病毒編碼一種復(fù)制酶,它是一種RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)[5]。因此從機制可以看出,SARS-CoV-2靶向藥物的靶標主要包括ACE2,主蛋白酶和RdRp。目前為止,國內(nèi)已批準的抗新冠主蛋白酶3CLpro抑制劑包括輝瑞公司的奈瑪特韋片/利托那韋片、先聲藥業(yè)的先諾特韋片/利托那韋片、廣東眾生睿創(chuàng)生物科技有限公司的來瑞特韋片用于治療輕中度新冠肺炎患者,前兩款藥物為主蛋白酶3CLpro抑制劑與利托那韋組合包裝產(chǎn)品聯(lián)合治療產(chǎn)品,后一種藥物為主蛋白酶3CLpro抑制劑單藥治療產(chǎn)品。SARS-CoV-2主蛋白酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)揭示,為基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)工作提供了極好的基礎(chǔ)[6]。因此,主蛋白酶是SARS-CoV-2藥物再利用的有希望的靶標。

在本研究中,我們使用SARS-CoV-2的主蛋白酶(PDB ID:6LU7)作為受體蛋白,對來自ZINC 藥物數(shù)據(jù)庫的5 811個化合物進行了3輪虛擬篩選:基于結(jié)構(gòu)的篩選,基于配體的篩選和基于藥理學(xué)的篩選。由此從數(shù)據(jù)庫中獲得了11個具有高親和力、高擬合值和適當藥理作用的分子。

1 材料與方法

1.1 基于結(jié)構(gòu)的 ZINC 數(shù)據(jù)集虛擬篩選將來自ZINC 數(shù)據(jù)庫的 in-trails dataset數(shù)據(jù)集導(dǎo)入OpenBable工具中,以實現(xiàn)能量最小化,并將SDF文件轉(zhuǎn)換為PDBQT文件。通過主蛋白中的不可逆共價抑制劑N3定義活性口袋位置以15×15×15的大小、-0.71×12.41×68.83的坐標覆蓋SARS-CoV-2的活性位點,并在綁定的口袋內(nèi)覆蓋必需殘基,使用AutoDock Vina進行對接。使用Discovery studio Visualizer和Pymol程序確定最佳構(gòu)象時分子的相互作用和結(jié)合模式,根據(jù)化合物的對接分數(shù)(kcal·mol-1)對化合物進行排名,結(jié)合親和力小于-8的化合物被認為是hit化合物。

1.2 基于配體的藥效團模型的構(gòu)建SARS-CoV-2和SARS-CoV在其解碼的主蛋白酶中具有96%的序列同一性。在催化區(qū)域中,兩種蛋白酶之間有差異的大多數(shù)殘基在蛋白質(zhì)表面上。S46(2019-nCoV)/A(SARS-CoV)可能與結(jié)合活性位點的底物或抑制劑相互作用。然而,從A到S的微小變化預(yù)計不會顯著干擾小分子抑制劑與活性位點的結(jié)合。因此,有效抑制SARS-CoV主蛋白酶的抑制劑也有望對SARS-CoV-2的主蛋白酶起類似作用[5]。通過比較和疊加一系列活性相似但結(jié)構(gòu)不同的化合物的特征結(jié)構(gòu),可以生成一套基于配體的藥效團模型。再通過評價和驗證后,選取最佳的藥效團模型用于虛擬篩選小型化合物數(shù)據(jù)庫,搜索潛在的藥物[7]?；谟?xùn)練集活性分子結(jié)構(gòu)多樣性的原理,我們選取了文獻報道的16種SARS冠狀病毒類主蛋白酶抑制劑構(gòu)建訓(xùn)練集(如表1所示)。

根據(jù)活性分子的IC50值,我們定義了Principal和Max Omit Feat的性質(zhì)。對于IC50≤1 μmol·L-1的活性分子,Principal定義為2,確保參考分子在構(gòu)建藥效團空間時考慮了分子中的所有化學(xué)特征,Max Omit Feat定義為0,意味著藥效團模型中的所有特征元素都需要與參考化合物匹配。對于IC50在1 ～ 100 μmol·L-1之間的中等活性分子,Principal定義為1,其中考慮了該分子的構(gòu)象,Max Omit Feat定義為1,表示藥效團模型中的某個特征元素對于化合物可以省略。選擇疏水性(HYD)特征、氫鍵受體(HBA)、氫鍵供體(HBD)、芳香環(huán)中心(RA)作為特征藥效團特征。基于訓(xùn)練集分子的活性構(gòu)象,利用Discovery Studio 2016的共同特征藥效團生成模塊(Common Feature Pharmacophore Generation)構(gòu)建模型(如圖1所示)。

圖1 16種SARS冠狀病毒類主蛋白酶抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3 藥效團模型的評價和驗證能否準確預(yù)測分子針對靶標的活性,藥效團模型是關(guān)鍵。因此,必須選用合適的方法評價藥效團模型,為此我們構(gòu)建了一個測試集來比較不同藥效團的識別能力。測試集共包含5 408個分子,分為陽性測試組和陰性測試組。其中陽性測試組的24個分子是隨機選擇的已過生物活性測試的化合物,陰性測試組的5 384個分子取自Drug Like Diverse數(shù)據(jù)庫。我們使用兩個參數(shù)SE(靈敏度)和SP(特異性)來評估藥效團的預(yù)測能力。SE值代表模型識別活性分子的能力,SP值代表模型識別非活性分子的能力。兩者的值越接近于 1,表示藥效團的識別能力越強。SE定義為真陽性(TP)與真陽性(TP)和假陰性(FN)之和的比率:SE=[TP/ (TP+ FN)]。SP 定義為真陰性(TN)與真陰性(TN)和假陽性 (FP) 之和的比率:SP=[TN/ (TN+ FP)]。我們使用十個生成的藥效團來篩選陽性測試組和陰性測試組,分別計算出 SP 和SE 值。篩選由Discovery Studio中的Ligand Profile模塊進行,每個化合物產(chǎn)生 200個構(gòu)象來繪制藥效團。能量閾值設(shè)置為 10,以避免不合理的構(gòu)象;擬合方法設(shè)置為靈活,最大省略特征設(shè)置為0,這意味著化合物需要映射所有藥效團特征。

1.4 基于配體的數(shù)據(jù)集虛擬篩選經(jīng)評價和驗證后,選擇最佳的藥效團模型作為3D query,從分子對接的結(jié)果中篩選化合物。參數(shù)設(shè)置與上一步相同。我們將擬合值的閾值設(shè)定為3.5。

1.5 基于藥理學(xué)的最終數(shù)據(jù)集篩選虛擬篩選的計算結(jié)果良好并不意味著化合物實際上對SARS-CoV-2有良好的抑制作用。因此,化合物還需要一步的藥理學(xué)篩選。我們查詢了上一步篩選出的化合物的全部已報道的藥理作用,并挑選出了所有與抗病毒有關(guān)的藥物。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選結(jié)果虛擬篩選由PyRx執(zhí)行。我們選擇了結(jié)合親和力小于- 8 kcal·mol-1的分子,共有678個分子。

2.2 基于配體的藥理學(xué)模型的特點及可靠性驗證我們構(gòu)建了10個基于配體的藥效團模型,相關(guān)參數(shù)見表2。綜合考慮SE值和SP值,我們決定選用模型4。

表2 10個藥效團模型的特征、試驗組和試驗結(jié)果

TP:真陽性,該化合物既有生物活性,又經(jīng)藥效團篩選;TN:真陰性,該化合物無生物活性,未被藥效團篩選;FP:假陽性,該化合物沒有生物活性但已被藥效團篩選出來;FN:假陰性,化合物具有生物活性,未被藥效團篩選;SE:靈敏度,SE=[TP/(TP+ FN)];SP:特異性,SP=[TN/(TN+ FP)]。

模型4以HHAA為特征,包含4個HBA和2個HYD。模型4對訓(xùn)練集的化合物組具有高度敏感性(SE=0.833)和高度特異性(SP=0.840),與訓(xùn)練集分子匹配良好,因此模型的可靠性很高(如圖2所示)。

氫鍵受體特征顯示為綠色球體,疏水性特征顯示為藍色球體圖2 訓(xùn)練化合物CHEMBL242436繪制的藥效團模型4

2.3 基于配體的虛擬篩選結(jié)果和基于藥理學(xué)的篩選結(jié)果模型 4 用作 3D query來篩選步驟 1 中的化合物庫,共有484個分子通過了篩選。Fit 值大于3.5的分子有137個。在經(jīng)過基于藥理學(xué)的篩選之后,剩下11個分子(如表3所示)。

表3 最終篩選出的11種化合物的計算結(jié)果和藥理作用

表6 含量測定結(jié)果(mg/100 g,n=2)

3 結(jié)論

COVID-19 的爆發(fā)引起了全世界的恐慌、社會和經(jīng)濟的混亂,并且疫情仍在全球蔓延。對已上市藥物進行計算機虛擬篩選從而發(fā)現(xiàn)抗SARS-CoV-2 藥物為一種快速而經(jīng)濟的方法。因此,我們選擇ZINC的in-trials 數(shù)據(jù)集作為我們的篩選數(shù)據(jù)集,建立多重篩選的方法尋找潛在的抗SARS-CoV-2藥物。

本研究中,我們使用由3個步驟組成的虛擬篩選工作流程來篩選數(shù)據(jù)庫,并確定11種潛在抑制劑。這3個步驟包括基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選、基于配體的虛擬篩選和基于藥理學(xué)的篩選。這些藥物大部分是抗病毒藥物,不僅與SARS-Cov-2主蛋白酶有很好的親和力,而且與藥效團模型有很好的擬合。

至此,我們的研究在一方面可以大大縮小藥物篩選的范圍,因為它們可以盡快進行體外實驗,以確定它們對SARS-CoV-2是否具有抑制作用;另一方面,我們提供了一組可用于虛擬篩選的方法和模型,對其他類似的藥物虛擬篩選具有借鑒意義。未來我們可以使用更大的數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選,從而加速人類尋找針對 COVID-19 的有效藥物的過程。