狂犬病疫苗效價(jià)測定改良NIH法建立及應(yīng)用

吳小紅,曹守春,石磊泰,王云鵬,趙丹華,李加,李玉華

(中國食品藥品檢定研究院蟲媒病毒疫苗室,國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102629)

狂犬病疫苗(以下簡稱“狂苗”)的效價(jià)是保證疫苗有效性的重要指標(biāo)。國內(nèi)外人用狂苗效價(jià)測定均采用NIH效價(jià)試驗(yàn)方法(NIH法)。該方法于1953年由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)建立,1972年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦用于狂苗的質(zhì)量控制[1-2]。NIH法使用實(shí)驗(yàn)動物量大,不符合國際上倡導(dǎo)“減少、替代、優(yōu)化”的“3R” 動物使用原則[3],而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受到攻擊病毒、試驗(yàn)動物、人員操作等多種因素影響[4]。尤其是檢驗(yàn)結(jié)果變異范圍大,NIH試驗(yàn)95%的可信限在25%到400%之間[5]。近10年來,國際上遵循動物實(shí)驗(yàn)的3R原則以及動物福利考慮,一直呼吁建立狂苗效價(jià)測定替代方法。2010年及2017年相繼開展了兩次狂苗效價(jià)替代方法的國際合作研究[6-8]。目前獸用狂苗效價(jià)測定采用小鼠免疫后血清抗體檢測已納入歐洲藥典[9],國內(nèi)獸用狂苗替代方法也有研究報(bào)道[10]。本研究開展了改良NIH(modified NIH,M-NIH)法,即單一稀釋法研究。只采用一個(gè)稀釋度免疫小鼠,來替代采用3個(gè)稀釋度的NIH方法,大大減少了動物用量。該方法經(jīng)9家企業(yè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合驗(yàn)證,于2018年獲得國家標(biāo)準(zhǔn)批件[WS4-(ZB-001)-2018],并收入《中國藥典》2020年版(三部),應(yīng)用于人用狂苗的批簽發(fā),提高我國狂苗的技術(shù)監(jiān)管效能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。稀釋液(PBS)量取0.9%磷酸二氫鉀溶液75 mL、2.4%磷酸氫二鈉(NaHPO4·12H2O)溶液425 mL、8.5%氯化鈉溶液500 mL,混合后加水至5 000 mL,調(diào)pH值至7.2～8.0。第八批人用狂犬病疫苗效力試驗(yàn)用國家標(biāo)準(zhǔn)品(簡稱標(biāo)準(zhǔn)品),批號:250009-201108,效價(jià)6.6 IU/劑。第六批人免疫球蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品,批號:250011-201306,效價(jià)37.0 IU·mL-1,均來源于中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)。狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒CVS來源于WHO,中檢院蟲媒室傳代保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物昆明小鼠12～14 g,SPF級,不分雌雄,購自中檢院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2022-0002,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SCXK(京)2022-0014。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用狂苗生產(chǎn)企業(yè)申報(bào)批簽發(fā)狂苗、過效期狂苗、37 ℃加速熱破壞狂苗以及上市后市場抽驗(yàn)狂苗共計(jì)332批次。

1.2 方法

1.2.1 NIH法參照“《中國藥典》2015年版(三部)通則3503”進(jìn)行檢測[10]。

1.2.2 M-NIH根據(jù)不同企業(yè)效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及疫苗裝量,參照WHO《狂犬病實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第四版 Modified NIH Test公式計(jì)算樣品單一稀釋度(D)。Lg(D)=ED50(標(biāo)準(zhǔn)品加權(quán)均值)+Lg(樣品效價(jià))-Lg(標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)) -Lg(裝量)[12],將不同企業(yè)來源的狂苗稀釋成不同稀釋度:效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為4.0 IU·mL-1,裝量1.0 mL,稀釋比例為1∶174;效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為4.0 IU·mL-1,裝量0.5 mL,稀釋比例為1∶347;效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為4.5 IU·mL-1,裝量0.5 mL,稀釋比例為1∶389;效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為4.3 IU·mL-1,裝量1.0 mL,稀釋比例為1∶186。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋比例為1∶288。用單一稀釋度的待測狂苗及標(biāo)準(zhǔn)品分別免疫12～14 g小鼠10只,每只小鼠腹腔注射0.5 mL,間隔一周再免疫一次。小鼠于第一次免疫后14 d,用預(yù)先測定的含5～100 LD50的病毒量進(jìn)行腦內(nèi)攻擊,每只0.03 mL;同時(shí)將CVS攻擊毒稀釋成100、10-1、10-2和10-3進(jìn)行病毒毒力回滴,每個(gè)稀釋度10只小鼠。小鼠攻擊后逐日觀察14 d,記錄死亡情況,統(tǒng)計(jì)第5天后死亡和呈典型狂犬病腦癥狀的小鼠。計(jì)算待測狂苗和標(biāo)準(zhǔn)品的小鼠保護(hù)率(小鼠保護(hù)率:小鼠存活只數(shù)/小鼠定只只數(shù)×100%),待測狂苗保護(hù)率不低于標(biāo)準(zhǔn)品保護(hù)率判定疫苗符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)參照“《中國藥典》2020年版(三部)通則3512第二法”進(jìn)行檢測[13]。在96孔板上3倍系列稀釋待檢血清及參考品(50 μL+100 μL);然后每孔加入50 μL適量的病毒(可引起細(xì)胞達(dá)到80%～95%熒光病變灶面積的病毒量),同時(shí)設(shè)立病毒對照及細(xì)胞對照。37 ℃培養(yǎng)箱里中和1 h;取出96孔反應(yīng)板后,每孔加入50 μL BSR細(xì)胞(1×106mL-1)。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液,用0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)洗1遍,然后加入-20 ℃預(yù)冷80%丙酮50 μL,4 ℃固定30 min。棄掉丙酮,待殘余丙酮揮發(fā)后,每孔加入50 μL FITC標(biāo)記的抗狂犬核蛋白單抗,37 ℃培養(yǎng)箱里孵育30 min,用0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)洗3遍,置酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀掃描觀察,記錄每孔熒光病變灶面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品熒光病變灶面積在50%上下的兩個(gè)稀釋度,按照藥典公式計(jì)算ED50,根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)計(jì)算血清中和抗體效價(jià)。血清抗狂犬病中和抗體效價(jià)大于等于0.5 IU·mL-1為抗體陽轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 M-NIH國家標(biāo)準(zhǔn)品單一稀釋度的驗(yàn)證根據(jù)第八批國家標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果,該標(biāo)準(zhǔn)品加權(quán)ED50均值為2.46,參照上述公式[12]確定標(biāo)準(zhǔn)品的單一稀釋比例為1∶288。按照NIH免疫程序共計(jì)免疫183只小鼠,0 d免疫,7 d加強(qiáng)免疫,14 d攻毒(每只小鼠腦內(nèi)攻毒量為含CVS攻擊毒5～100 LD50/0.03 mL)。攻毒前眼眶靜脈竇采血,用RFFIT法檢測小鼠抗體效價(jià),計(jì)算小鼠陽轉(zhuǎn)率;攻毒后觀察14 d,第5天起記錄小鼠死亡情況,計(jì)算小鼠保護(hù)率。

1.2.5 M-NIH(單一稀釋法)的重復(fù)性本實(shí)驗(yàn)室分別用NIH和M-NIH兩種方法檢測2批低效價(jià)及高效價(jià)狂苗,分別進(jìn)行5次獨(dú)立試驗(yàn),計(jì)算變異系數(shù),評價(jià)該方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性。同時(shí)選取申報(bào)批簽發(fā)狂苗及過效期狂苗共計(jì)21批,進(jìn)行編盲后分發(fā)至6個(gè)有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室接收6～9批樣品,分別進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn),由中檢院匯總各實(shí)驗(yàn)室NIH法測定效價(jià)幾何平均值(geometric mean,GM)為疫苗效價(jià)最終結(jié)果,M-NIH法半定量結(jié)果以合格占比多數(shù)者為最終結(jié)果,評價(jià)實(shí)驗(yàn)室間的變異及各實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的重現(xiàn)性。

1.2.6 M-NIH(單一稀釋法)與NIH法的一致性比較(準(zhǔn)確度)本實(shí)驗(yàn)室采用13批上市后抽驗(yàn)及39批次申報(bào)批簽發(fā)共52批次狂苗,分別用兩種方法進(jìn)行檢測,分析兩種方法的一致性,并確定M-NIH法標(biāo)準(zhǔn)品的保護(hù)率范圍作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。另外,9家實(shí)驗(yàn)室對各自企業(yè)生產(chǎn)的狂苗包括申報(bào)批簽發(fā)疫苗、過效期疫苗、37 ℃放置28 d加速熱破壞疫苗及上述編盲21批樣品合計(jì)284批次,進(jìn)行兩種方法的比較。

1.2.7 M-NIH(單一稀釋法)的適用性3家企業(yè)至少各5批申報(bào)批簽發(fā)疫苗,分別用M-NIH及NIH進(jìn)行3次試驗(yàn),考察方法的適用性。

1.2.8 M-NIH(單一稀釋法)在狂苗批簽發(fā)中的應(yīng)用M-NIH法獲得國家標(biāo)準(zhǔn)批件后,2019年7月至2023年6月采用M-NIH法對申報(bào)批簽發(fā)的狂苗合計(jì)820批進(jìn)行了疫苗效價(jià)的抽驗(yàn),M-NIH法不合格者,采用NIH法結(jié)果作為最終判定結(jié)果。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0對兩種方法通過計(jì)算 Kappa系數(shù)和Mcnemar-Bowker檢驗(yàn)來進(jìn)行一致性分析。Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說明兩種方法有一致性。當(dāng)Kappa值在0.4到0.6之間說明一致性中等;在0.6到0.8之間說明一致性較高;在0.8到1之間說明有極好的一致性。Mcnemar-Bowker檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明兩種檢測方法效果相同。采用卡方檢驗(yàn)對小鼠免疫后中和抗體陽轉(zhuǎn)率和小鼠保護(hù)率比較以及不同實(shí)驗(yàn)室不同方法符合率進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 第八批國家標(biāo)準(zhǔn)品單一稀釋比例的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品按1∶288稀釋,共免疫183只小鼠,14 d采血檢測抗體陽轉(zhuǎn)率為53.0%(97/183),小鼠血清抗體滴度結(jié)果分布在0～27.2 IU·mL-1。14 d小鼠腦內(nèi)病毒攻擊后觀察14 d計(jì)算保護(hù)率為54.6%(100/183)。標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果加權(quán)均值ED50為2.46,按照1∶288比例稀釋后抗體陽轉(zhuǎn)率及小鼠保護(hù)率均在50%左右,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.137,P=0.711),結(jié)果見表1。

表1 國家標(biāo)準(zhǔn)品1∶288單一稀釋比例的驗(yàn)證結(jié)果

2.2 M-NIH法重復(fù)性結(jié)果本實(shí)驗(yàn)室對標(biāo)示為疫苗1,疫苗2的低、高效價(jià)兩批狂苗各重復(fù)5次NIH及M-NIH法檢測,M-NIH法檢測標(biāo)準(zhǔn)品的保護(hù)率變異系數(shù)為11.3%;疫苗1保護(hù)率變異系數(shù)為34.3%;疫苗2保護(hù)率變異系數(shù)為15.4%。NIH法檢測2批疫苗的效價(jià)檢測變異系數(shù)分別為16.3%和8.9%,結(jié)果見表2。21批編盲樣品在各實(shí)驗(yàn)室的重現(xiàn)性結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)室間變異系數(shù)為12.6%～80.3%,結(jié)果見表3。21批疫苗計(jì)算幾何平均效價(jià),其中編號13、14、15的3批狂苗因兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室間偏差較大未統(tǒng)計(jì)。納入統(tǒng)計(jì)的18批疫苗的幾何平均效價(jià)分布及符合率統(tǒng)計(jì)見表4。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 21批編盲樣品重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 18批編盲狂苗幾何均值效價(jià)分布及兩種方法符合率結(jié)果

2.3 M-NIH和NIH的比較驗(yàn)證(M-NIH準(zhǔn)確度)

表5 中檢院實(shí)驗(yàn)室52批M-NIH與NIH法比較結(jié)果

圖1 國家標(biāo)準(zhǔn)品保護(hù)率M-NIH法驗(yàn)證結(jié)果

表6 9家實(shí)驗(yàn)室M-NIH法與NIH法的比較結(jié)果

2.4 M-NIH法的適用性采用M-NIH法和NIH法對3家企業(yè)申報(bào)批簽發(fā)產(chǎn)品檢測結(jié)果顯示,16批狂苗按照重復(fù)性結(jié)果分析,NIH效價(jià)取幾何均值,M-NIH半定量結(jié)果以合格占比多數(shù)者為最終結(jié)果。兩種方法檢測結(jié)果均符合規(guī)定,符合率為100%(16/16);按照每次配對實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì),有5次試驗(yàn)結(jié)果不一致,符合率為89.6%(43/48),兩種符合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.81,P=0.179)。各實(shí)驗(yàn)室M-NIH法檢測結(jié)果批間變異系數(shù)在17.5%～32.1%之間,實(shí)驗(yàn)間變異系數(shù)在0%～34.1%之間,結(jié)果見表7～9。

表7 企業(yè)A狂苗適用性驗(yàn)證結(jié)果(效價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 4.0 IU/劑)

表8 企業(yè)B狂苗適用性驗(yàn)證結(jié)果(效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)4.3 IU/劑)

表9 企業(yè)C狂苗適用性驗(yàn)證結(jié)果(效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)4.5 IU/劑)

2.5 M-NIH法在狂苗批簽發(fā)中的應(yīng)用2019年7月至2023年6月中檢院應(yīng)用M-NIH法對企業(yè)申報(bào)批簽發(fā)狂苗抽樣合計(jì)820批進(jìn)行效價(jià)測定,M-NIH法不合格時(shí),采用NIH法進(jìn)行檢測,作為最終判定結(jié)果。結(jié)果顯示,820批狂苗經(jīng)M-NIH法檢驗(yàn)769批合格,合格率為93.8%(769/820),其中51批M-NIH法檢驗(yàn)不合格批次,經(jīng)NIH法檢驗(yàn)49批合格,2批仍不合格,簽發(fā)不合格報(bào)告。820批狂苗共計(jì)發(fā)出合格報(bào)告818批,合格率為99.8%(818/820),結(jié)果見表10。

表10 M-NIH法在狂苗批簽發(fā)中的應(yīng)用

3 討論

狂苗效價(jià)測定替代方法的3個(gè)研究方向:①減少動物使用量;②疫苗單一稀釋度免疫小鼠后進(jìn)行血清抗體檢測;③建立體外效價(jià)試驗(yàn)[6,14-16]。人用狂苗的效價(jià)替代研究進(jìn)展緩慢主要原因是替代方法需與“金標(biāo)”NIH法進(jìn)行比較,而“金標(biāo)”NIH法本身變異性很大,WHO認(rèn)可NIH試驗(yàn)可信限為25%～400%,體外替代方法和“金標(biāo)”NIH法比較的相關(guān)性較差。因此,要建立人用狂苗體外替代方法難度很大,需要大量的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和監(jiān)管當(dāng)局的批準(zhǔn)[17-18]。2017年由WHO牽頭組織的全球性合作研究,利用巴斯德開發(fā)的可以識別三聚體RABV糖蛋白的抗原位點(diǎn)Ⅲ(aa 330至338)mAb-D1單抗,采用雙抗體夾心ELISA法,研究建立人用狂苗的效價(jià)測定體外替代方法,研究結(jié)果與NIH法檢測比較結(jié)果一致,是最有望替代NIH試驗(yàn)的體外方法[19-22]。近年來越來越多國際專家建議體外效價(jià)試驗(yàn)來替代體內(nèi)動物試驗(yàn)[23-24]。但截至目前,尚未有WHO或歐洲藥典等指南發(fā)布體外效價(jià)替代方法。同時(shí),Volokhov等[25]專家指出體外ELISA法不能真正反映誘導(dǎo)產(chǎn)生體內(nèi)保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原含量。雖然Machado等[26]的研究證實(shí)通過減少NIH法50%動物使用量可以不影響結(jié)果判定,但仍需要進(jìn)行3個(gè)稀釋度的動物免疫。我國狂苗的質(zhì)控可以通過體外ELISA法檢測抗原含量進(jìn)行批間一致性控制,但由于國內(nèi)各企業(yè)所用狂犬病毒疫苗株和細(xì)胞基質(zhì)以及生產(chǎn)工藝之間差別較大,與NIH法比較相關(guān)性較差,不適用于國家技術(shù)監(jiān)管部門統(tǒng)一評價(jià)狂苗效價(jià)。因此本研究建立M-NIH半定量方法,采用單一稀釋度,大大減少動物使用量,符合動物使用的“3R”原則。

中檢院52批次狂苗驗(yàn)證結(jié)果顯示,兩種方法的符合率為92.3%(Kappa=0.82,P<0.01),9家實(shí)驗(yàn)室247批次狂苗擴(kuò)大聯(lián)合驗(yàn)證結(jié)果顯示,兩種方法的符合率為80.2%(Kappa=0.54,P<0.01),兩種方法符合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.34,P=0.037),考慮跟實(shí)驗(yàn)用疫苗相關(guān),前者的驗(yàn)證疫苗均使用了申報(bào)批簽發(fā)疫苗及效價(jià)抽樣合格疫苗。而9家實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大驗(yàn)證用疫苗247批次中參照WHO指南的要求加入了不合格疫苗作為對照樣品[5],大量效價(jià)在臨界值附近的疫苗造成了M-NIH半定量結(jié)果判定的準(zhǔn)確性有所下降,與NIH法的符合率低于52批次驗(yàn)證結(jié)果。對21批編盲樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也充分顯示了對低于合格標(biāo)準(zhǔn)及高于合格標(biāo)準(zhǔn)的疫苗,M-NIH與NIH符合率分別是100%和87.5%,而對于效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)臨界值的疫苗兩種方法檢測結(jié)果的符合率僅有50%。因此規(guī)定對于M-NIH法效價(jià)不符合標(biāo)準(zhǔn)的疫苗需采用經(jīng)典的NIH法進(jìn)行檢驗(yàn)。采用該方法的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)已建立穩(wěn)定的NIH方法并通過充分驗(yàn)證,并定期對該方法進(jìn)行評估,確保該方法的可靠性[13]。

M-NIH法設(shè)立了國家標(biāo)準(zhǔn)品保護(hù)率的范圍作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)準(zhǔn)品保護(hù)率的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異為21.7%,實(shí)驗(yàn)室間變異為23.4%,說明該方法重復(fù)性良好,3家企業(yè)狂苗適用性驗(yàn)證結(jié)果也顯示M-NIH法在各實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果穩(wěn)定,批間一致性良好(批間變異系數(shù)在17.5%～32.1%之間,實(shí)驗(yàn)間變異系數(shù)在0%～34.1%之間)。該方法獲得批準(zhǔn)后已應(yīng)用于狂苗的批簽發(fā)檢驗(yàn)。該方法的應(yīng)用提高了狂苗效價(jià)的抽檢率,效價(jià)測定由20%提高到25%以上,同時(shí)也大大提高了狂苗檢驗(yàn)效率,加快了批簽發(fā)進(jìn)度,節(jié)省了人力和動物使用量。單一稀釋法作為狂苗批簽發(fā)效價(jià)NIH法的補(bǔ)充方法發(fā)揮了重要的技術(shù)支撐作用。