金線蘭屬10種藥用植物UPLC指紋圖譜及6種黃酮類成分含量測定

陳慧玲,張超,鄭承劍,吳建國,吳錦忠,吳巖斌*,黃德福

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥鑒定學(xué)教研室,上海 200433;3.福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院制劑中心,福建 福州 350125)

目前,金線蘭屬(AnoectochilusBlume)植物在全世界大約有40余種,中國有20種,其中金線蘭[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl]是“福九味”之一金線蓮的基原植物,主要分布于福建、浙江、江西、云南、廣西、湖南等地區(qū),具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、解毒等功效[1-4],臨床上用于治療手足口病、肝炎、糖尿病等,有較好的療效[5-7]。金線蘭屬植物多具清熱解毒、祛風(fēng)除濕等功效,具有抗肝損傷、抗骨質(zhì)疏松、降血糖、抗炎、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗氧化、減肥等生物活性,該屬植物形態(tài)非常相似,在民間均被當(dāng)作金線蓮使用[8-15]。然而,目前金線蘭屬植物的化學(xué)成分研究多集中在金線蘭和臺(tái)灣銀線蘭,該屬其他植物的化學(xué)成分大多未進(jìn)行系統(tǒng)的研究。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道過金線蘭及其部分近緣種的高效液相色譜(HPLC)和超高效液相色譜(UPLC)指紋圖譜[16-19],但是研究所用金線蘭產(chǎn)地大多集中在福建省,而且同屬近緣種種類和批次均較少,不能較全面的反映出該屬植物的指紋圖譜特征。因此本試驗(yàn)從福建、云南、廣西、廣東、江西采集不同產(chǎn)地的金線蘭屬10種植物,建立該屬10種藥用植物UPLC指紋圖譜,并測定其中6種黃酮類成分的含量,旨在為金線蘭屬藥用植物的鑒別及質(zhì)量控制提供一定參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥材85批金線蘭及同屬近緣種植物采自中國不同省市(樣品信息見表1),包括:金線蘭(A.roxburghii)(43批)、臺(tái)灣銀線蘭(A.formosanus)(5批)、南丹金線蘭(A.nandanensis)(8批)、麗蕾金線蘭(A.lylei)(6批)、興仁金線蘭(A.xingrenensis)(5批)、滇南金線蘭(A.burmannicus)(3批)、短唇金線蘭(A.brevilabris)(3批)、長片金線蘭(A.longilobus)(3批)、乳突金線蘭(A.papillosus)(6批)、高金線蘭(A.elatus)(3批),樣品經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授和吳錦忠教授鑒定,樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

表1 金線蘭屬10種植物樣品信息

1.2 儀器與試劑安捷倫1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);蘆丁(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號(hào):15010412);異槲皮苷(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號(hào):PRF8030703);水仙苷(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào):MUST-15070407);異鼠李素-3-O-葡萄糖苷(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào):MUST-17060810);槲皮素(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號(hào):13041809);異鼠李素(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號(hào):PRF8051802);乙腈(色譜純,德國默克公司);甲酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇、乙醇為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和異鼠李素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成含蘆丁47.2 μg·mL-1、異槲皮苷93.8 μg·mL-1、水仙苷103.6 μg·mL-1、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷45.6 μg·mL-1、槲皮素95.4 μg·mL-1、異鼠李素74.4 μg·mL-1的混合溶液,搖勻,即得。

2.2 供試品溶液的制備取經(jīng)60 ℃干燥至恒重的85批金線蘭屬植物,粉碎,精密稱取粉末0.5 g于具塞三角瓶中,加50 mL 70%甲醇,密塞,稱定重量,超聲提取45 min,放冷,用70%甲醇補(bǔ)足重量,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.3 色譜條件Phenomenex Kinelex 1.7 μm C18100A(100 mm×2.10 mm)色譜柱,柱溫35 ℃,流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),進(jìn)行梯度洗脫,洗脫程序見表2,檢測波長360 nm,流速為0.3 mL·min-1,進(jìn)樣量5 μL。

2.4 金線蓮屬植物UPLC指紋圖譜

2.4.1 精密度取樣品(AR4)供試液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,以水仙苷為參比峰,測得6個(gè)共有峰(蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素)的相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.04%、0.02%、0.00%、0.01%、0.03%和0.04%,相對(duì)峰面積的RSD分別為0.10%、0.08%、0.00%、0.09%、0.12%和0.11%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性取同一批樣品(AR4)供試液6份,按“2.3”項(xiàng)下色譜方法,連續(xù)進(jìn)樣。以水仙苷為參照峰,測得6個(gè)共有峰(蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素)的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均低于0.05%,相對(duì)峰面積的RSD均低于3%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性取同一批樣品(AR4)供試液6份,按“2.3”項(xiàng)下色譜方法,分別在0、2、4、6、10、12、24 h進(jìn)樣。以水仙苷為參照峰,測得6個(gè)共有峰(蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素)的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均低于0.06%,相對(duì)峰面積的RSD均低于4%,表明該方法樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 金線蘭屬10種植物指紋圖譜的建立按照“2.2”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,得到85批金線蘭屬植物樣品的UPLC指紋圖譜。將金線蘭屬十種植物的指紋圖譜分別導(dǎo)入《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012 版) ,分別設(shè)定參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,時(shí)間窗設(shè)為0.2,經(jīng)過多點(diǎn)矯正后生成金線蘭屬10種植物的對(duì)照?qǐng)D譜,其中金線蘭對(duì)照?qǐng)D譜確定了16個(gè)共有色譜峰,通過與對(duì)照品圖譜比對(duì),確認(rèn)其中6個(gè)特征峰,其中3號(hào)峰為蘆丁、4號(hào)峰為異槲皮苷、6號(hào)峰為水仙苷、7號(hào)峰為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、9號(hào)峰為槲皮素、12號(hào)峰為異鼠李素,見圖1～2。

A.混合對(duì)照品;B.金線蘭(AR4) 3.蘆丁;4.異槲皮苷;6.水仙苷;7.異鼠李素-3-O-葡萄糖苷;9.槲皮素;12.異鼠李素圖1 對(duì)照品與金線蘭及UPLC色譜圖

A.金線蘭;B.麗蕾金線蘭;C.乳突金線蘭;D.臺(tái)灣銀線蘭;E.滇南金線蘭;F.南丹金線蘭;G.興仁金線蘭;H.短唇金線蘭;I.高金線蘭;J.長片金線蘭 3.蘆丁;4.異槲皮苷;6.水仙苷;7.異鼠李素-3-O-葡萄糖苷;9.槲皮素;12.異鼠李素圖2 金線蘭屬10種藥用植物UPLC對(duì)照指紋圖譜

2.5.2 指紋圖相似度評(píng)價(jià)利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件分別對(duì)85批金線蘭屬植物的圖譜進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理,以43批金線蘭樣品指紋圖譜的共有模式圖為對(duì)照?qǐng)D譜,計(jì)算各批次樣品相似度,結(jié)果見表3。43批次的金線蘭的相似度在0.725～0.981之間,其中AR13和AR40的相似度為0.725和0.740,其余金線蘭的相似度大于0.8。5批臺(tái)灣銀線蘭的相似度均小于0.6;8批南丹金線蘭的相似度均小于0.74;5批興仁金線蘭、3批短唇金線蘭和與金線蘭對(duì)照?qǐng)D譜相似度較高,均大于0.8;3批次的長片金線蘭的相似度在0.721～0.933之間,6批乳突金線蘭的相似度在0.660～0.943之間;6批麗蕾金線蘭中5批相似度大于0.8,1批相似度為0.740。

2.6 黃酮含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取“2.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別稀釋至不同倍數(shù),進(jìn)樣并紀(jì)錄峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得回歸方程見表4。

2.6.2 精密度取“2.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,求RSD,計(jì)算結(jié)果顯示6種黃酮峰面積的RSD值在0.08%～0.20%之間,表明儀器的精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性取同一批樣品(AR4),平行稱取6份,制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積,求RSD值,計(jì)算結(jié)果顯示6種黃酮峰面積的RSD值在1.88%～2.85%之間,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性取同一批樣品(AR4)供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、10、12、24 h進(jìn)樣,記錄峰面積,求RSD值,計(jì)算結(jié)果顯示6種黃酮峰面積的RSD值在0.14%～2.54%范圍內(nèi),表明該方法樣品的穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率精密吸取已知6種黃酮含量的金線蘭樣品(AR4)0.25 g于具塞三角瓶中,共6份,分別加入適量的對(duì)照品溶液,加70%甲醇至25 mL,按照“2.2”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算6種黃酮加樣回收率和RSD。結(jié)果顯示,6種黃酮的平均回收率在92.02%～103.09%范圍內(nèi),RSD在0.83%～2.93%范圍內(nèi),表明6種黃酮的加樣回收率良好。

2.6.6 樣品含量測定供試品溶液按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定分析,記錄峰面積,根據(jù)線性回歸方程計(jì)算黃酮含量。85批金線蘭屬中6種黃酮的含量結(jié)果見表5,大多數(shù)樣品都能檢測到蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量、槲皮素、異鼠李素,除個(gè)別低于檢測限外,蘆丁含量在16.46～803.34 μg·g-1,異槲皮苷含量在16.76～243.67 μg·g-1、水仙苷含量在23.62～3 435.21 μg·g-1、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量在7.02～325.57 μg·g-1、槲皮素含量在16.10～222.66 μg·g-1、異鼠李素含量在3.82～59.00 μg·g-1。

表5 85批金線蘭屬植物黃酮含量測定結(jié)果(μg·g-1,n=2)

3 討論

3.1 提取溶劑和提取方式的選擇考察不同濃度的乙醇和不同濃度的甲醇溶液提取的效率,試驗(yàn)結(jié)果表明70%甲醇提取效果最好;同時(shí)考察了回流提取和超聲提取方法,結(jié)果表明兩種方法的提取效率無顯著差異,故選擇時(shí)間短的超聲提取法;此外,還考察了超聲提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響,結(jié)果顯示當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)提取效率達(dá)到最高,故采用70%甲醇超聲提取45 min制備供試品溶液。

3.2 色譜條件的選擇本試驗(yàn)分別考察了乙腈-甲酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液作流動(dòng)相,梯度洗脫,結(jié)果表明乙腈-甲酸水溶液作流動(dòng)相,金線蘭樣品中的大多數(shù)化學(xué)成分有較好的基線分離,但是以甲醇-甲酸水溶液作流動(dòng)相時(shí),基線漂移較為嚴(yán)重,故采用乙腈-甲酸水溶液作流動(dòng)相。同時(shí)也考察了不同檢測波長和柱溫對(duì)分離的影響,最終選擇360 nm作為檢測波長,柱溫為35 ℃。

3.3 金線蘭屬指紋圖譜分析金線蘭屬10種植物UPLC對(duì)照?qǐng)D譜及相似度分析結(jié)果提示興仁金線蘭、高金線蘭、長片金線蘭、短唇金線蘭、麗蕾金線蘭、滇南金線蘭和乳突金線蘭等金線蘭屬植物與金線蘭的化學(xué)成分差異較小,而臺(tái)灣銀線蘭、南丹金線蘭這2種金線蘭屬植物與金線蘭的化學(xué)成差異較大。通過金線蘭屬UPLC指紋圖譜,可以區(qū)分金線蘭與部分近緣種混偽品,包括臺(tái)灣銀線蘭、南丹金線蘭,因此不宜將這些金線蘭屬植物當(dāng)作金線蓮使用。另外,部分金線蘭屬植物圖譜和金線蘭對(duì)照?qǐng)D譜雖然有較高的相似度,但是能否作為金線蘭的替代資源,還有待進(jìn)一步的研究。

3.4 黃酮類成分比較分析43批金線蘭樣品中含量最高的黃酮類化合物是水仙苷,其中25批野生金線蘭、13批組培金線蘭、5批栽培金線蘭中水仙苷的含量分別為481.96～3 435.21、201.17～952.92、714.90～2 491.25 μg·g-1。由于種質(zhì)、生長環(huán)境、土壤、氣候、采集時(shí)間、組培條件和栽培等因素均可能金線蘭化學(xué)成分的含量,因此水仙苷雖然是金線蘭中含量最高的黃酮類成分,但是該成分的含量也不能區(qū)分組培、栽培和野生的金線蘭。彭琴等[18]報(bào)道金線蘭中水仙苷含量顯著高于臺(tái)灣銀線蘭、長片金線蘭、麗蕾金線蘭,可以作為化學(xué)標(biāo)志物區(qū)分金線蘭與臺(tái)灣銀線蘭、長片金線蘭、麗蕾金線蘭),本研究5批次的臺(tái)灣銀線蘭中水仙苷的含量為23.26～37.47 μg·g-1,明顯低于金線蘭中水仙苷的含量,與其報(bào)道結(jié)果相似,通過該成分的定量分析,可以鑒別金線蘭和臺(tái)灣銀線蘭。本研究3批長片金線蘭和6批麗蕾金線蘭中水仙苷的含量分別為254.32～1 800.17、150.47～885.12 μg·g-1,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致,這可能與文獻(xiàn)[18]中采集的長片金線蘭(2批)和麗蕾金線蘭(2批)批次較少有關(guān)。此外,臺(tái)灣銀線蘭與長片金線蘭的植物形態(tài)極其相似,其葉脈均為白色[20],難于鑒別,本試驗(yàn)3批次的長片金線蘭中水仙苷的含量為254.32～1 800.17 μg·g-1,明顯高于臺(tái)灣銀線蘭中水仙苷的含量,通過該成分的定量分析,可以鑒別長片金線蘭與臺(tái)灣銀線蘭。8批次的南丹金線蘭、5批次的興仁金線蘭、6批次的乳突、3批次的滇南金線蘭、3批次的短唇金線蘭和3批次的高金線蘭中水仙苷的含量分別為211.56～767.63、527.77～1 386.63、359.79～1 200.52、267.14～381.17、422.30～1 116.84、898.15～925.84 μg·g-1,與金線蘭沒有顯著的差異。

黃酮類成分是金線蓮的主要活性成分之一,組培金線蘭經(jīng)過適時(shí)栽培后,其黃酮類成分含量有顯著的提高。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),組培金線蘭經(jīng)過栽培后,其總黃酮的含量有明顯提高,且其體外抗氧化和降血糖活性也有顯著的提高[11]。本研究中的組培金線蘭(AR1、AR13、AR15)經(jīng)過2到8個(gè)月栽培后(AR2、AR3、AR4、AR14、AR16),蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量、槲皮素、異鼠李素的含量均有不同程度的提高。因此,經(jīng)過適時(shí)栽培可提高金線蘭中黃酮類化合物的含量,金線蓮生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)重視金線蓮的栽培,為市場提供優(yōu)質(zhì)的金線蓮產(chǎn)品。

綜上,本研究建立了金線蘭屬植物UPLC指紋圖譜及黃酮類成分含量測定方法,可以用于金線蘭與部分同屬混偽品的鑒別,但不能用于區(qū)分金線蘭與興仁金線蘭、高金線蘭、長片金線蘭、短唇金線蘭、麗蕾金線蘭、滇南金線蘭和乳突金線蘭等金線蘭屬植物,研究結(jié)果可為金線蘭屬藥用植物質(zhì)量控制、品質(zhì)評(píng)價(jià)以及尋找金線蓮的替代資源提供參考。