MACC1與c-Met基因在胰腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后意義＊

買二輝 徐 濤 張樹交 王 曉 李 冉 丁飛虎 雷 霆 李四橋

洛陽市中心醫(yī)院肝膽胰脾及疝外科一病區(qū) (河南 洛陽 471000)

胰腺癌(Pancreatic Cancer，PC)屬于一種常見的消化道惡性腫瘤疾病，在癌癥死亡率中位居第四[1]。其確診后1年之內(nèi)死亡率高達(dá)95%[2]。近年來，胰腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增加，且其手術(shù)后死亡率較高[3]。PC轉(zhuǎn)移率高是其治療效果差的重要原因[4]。在PC診斷時(shí)，約有50%左右的患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移，平均生存期低于1年[5]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(Metastasis-associated with colon cancer protein 1，MACC1)可預(yù)測(cè)早期癌癥階段的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，其表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)[6]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(hepatocyte growth factor receptor，c-Met)癌蛋白通過其信號(hào)傳導(dǎo)途徑驅(qū)動(dòng)多種腫瘤中的癌癥進(jìn)展[7]。本研究將探究MACC1與c-Met基因在胰腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后意義，以期為臨床上胰腺癌的治療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2023年1月我院收治的胰腺癌患者80例，所有病人均接受手術(shù)治療，術(shù)中取胰腺癌組織及癌旁組織。其中，男37例，女43例，年齡35～65歲，平均年齡(57.245.49)歲；腫瘤直徑1～7cm，平均直徑(4.210.59)cm。腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ期39例，Ⅳ期9例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合胰腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；能進(jìn)行手術(shù)治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在溝通、凝血功能障礙者；伴有精神疾病者；有生物免疫制劑治療史；有化療治療史[9]。選擇同期于本院接受治療的胰島細(xì)胞瘤等良性病變患者80例，取其胰腺組織，作為對(duì)照組。本研究在倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1組織學(xué)實(shí)驗(yàn) 對(duì)胰腺癌組織、癌旁組織及健康對(duì)照組胰腺組織標(biāo)本進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片。采用免疫組化SP法。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野觀察陽性細(xì)胞。每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，采用半定量積分法進(jìn)行結(jié)果判定。并且將其與患者的臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2 MACC1與c-Met的表達(dá)水平 體外培養(yǎng)正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株(HPDE6-C7)及胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1、BxPC-3、AsPC-1、MIA Paca-2，分別檢測(cè)各株細(xì)胞中MACC1與c-Met的表達(dá)水平。1.2.3 RT-PCR技術(shù) 選取高表達(dá)MACC1與c-Met的細(xì)胞株(假設(shè)A株、B株)，通過RNA干擾技術(shù)分別抑制兩組細(xì)胞MACC1表達(dá)，48H后采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MACC1與c-Met，并設(shè)立相應(yīng)的對(duì)照組。

1.2.4 細(xì)胞增殖及凋亡情況 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾后A、B組細(xì)胞的細(xì)胞增殖及凋亡的變化。

1.2.5 遷移及侵襲能力 采用劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)分析抑制表達(dá)A、B組細(xì)胞的遷移及侵襲能力變化。

1.2.6 MACC1及c-Met可能的信號(hào)通路研究 免疫印跡法檢測(cè)干擾后A、B組細(xì)胞的MACC1與c-Met蛋白變化水平；進(jìn)一步研究相關(guān)信號(hào)通路的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以(±s)表示，組間、組內(nèi)比較分別采用獨(dú)立樣本t和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。分類計(jì)數(shù)資料均以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05，表明差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 MACC1、c-Met在各組織中的表達(dá)情況結(jié)果顯示，在胰腺癌組織中MACC1和c-Met蛋白的高表達(dá)率分別為83.75%、80.00%，明顯高于胰腺組織和癌旁組織，差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 MACC1和c-Met蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果顯示，隨著腫瘤分期的增高及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，MACC1和c-Met蛋白的表達(dá)有所增加(P＜0.05)；MACC1和c-Met蛋白的表達(dá)與病人的年齡、性別、腫瘤直徑等無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)性(P＞0.05)，見表2。

表2 MACC1和c-Met蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 各細(xì)胞株中MACC1與c-Met基因水平的表達(dá)情況結(jié)果顯示，MACC1在BxPC-3中表達(dá)最多，c-Met在AsPC-1中表達(dá)最多，見表3。因此，選擇BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表3 各細(xì)胞株中MACC1與c-Met基因水平的表達(dá)情況

2.4 RNA干擾后MACC1、c-Met的表達(dá)情況結(jié)果顯示，MACC1和c-Met蛋白表達(dá)水平在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)；而RNA干擾后的BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株中MACCI和c-Met蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05)，見表4。

表4 RNA干擾后MACC1、c-Met的表達(dá)情況

2.5 細(xì)胞增殖及凋亡情況結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株中對(duì)MACC1進(jìn)行抑制后，細(xì)胞增殖明顯變慢，而細(xì)胞凋亡率明顯增多，見表5。

表5 細(xì)胞增殖情況[A]

2.6 細(xì)胞遷移及侵襲能力結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株中對(duì)MACC1進(jìn)行抑制后，細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯降低，見表6。

表6 細(xì)胞遷移情況

2.7 下調(diào)MACC1表達(dá)對(duì)各信號(hào)通路的影響結(jié)果顯示，干擾后的胰腺癌細(xì)胞，MACC1與c-Met、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平均顯著下降；下調(diào)MACC1表達(dá)抑制了Notch1、Hey1、Hes1、Ras、p-ERK1/2等通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時(shí)，p53、MDM2等p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)也明顯改變。

3 討 論

胰腺癌是致死率較高的惡性腫瘤之一，目前尚無有效的早期診斷手段，且胰腺癌患者的預(yù)后極差[10]。MACC1在多種實(shí)體瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[11]。已有研究指出，MACC1在細(xì)胞培養(yǎng)物以及結(jié)腸癌患者中誘導(dǎo)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。近來有研究通過RNA-seq和微陣列數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)c-Met是胰腺癌的重要樞紐基因[13]。

在本研究中，MACC1和c-Met蛋白在胰腺癌組織中的高表達(dá)率明顯高于胰腺組織和癌旁組織(P＜0.05)。且隨著腫瘤分期的增高及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，MACC1和c-Met蛋白的表達(dá)有所增加(P＜0.05)；而MACC1和c-Met蛋白的表達(dá)與病人的年齡、性別、腫瘤直徑等無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)性(P＞0.05)，表明MACC1和c-Met蛋白的表達(dá)量隨著胰腺癌的進(jìn)一步惡化逐漸增加。與Zhang X[14]、Qin T[15]等人的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)镸ACC1是一種重要的致癌基因，通過調(diào)控HGF-MET信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。MACC1含有多個(gè)基序，參與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。其在多種腫瘤中具有致癌作用，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。且c-Met屬于受體酪氨酸激酶家族，在上皮細(xì)胞中高表達(dá)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)是c-Met的唯一配體，HGF與c-Met結(jié)合后，可導(dǎo)致c-Met磷酸化，從而激活MAPK、STAT3和PI3K/AKT等多種信號(hào)通路，這些信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。

本研究結(jié)果還顯示，MACC1和c-Met蛋白表達(dá)水平在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)；而RNA干擾后的BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株中MACCI和c-Met蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05)。且相較于對(duì)照組，BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株中對(duì)MACC1進(jìn)行抑制后，細(xì)胞增殖明顯變慢，細(xì)胞凋亡率明顯增多；同時(shí)，細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯降低。腫瘤最顯著的特點(diǎn)就是無限增殖和容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，無限增殖不但會(huì)引起壓迫癥狀，還會(huì)引起明顯的惡病質(zhì)。大部分的癌癥患者在晚期都會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這就會(huì)造成體內(nèi)多發(fā)腫瘤，從而明顯縮短患者的生存期[16]。而對(duì)MACC1進(jìn)行抑制后，MACCI和c-Met蛋白表達(dá)水平明顯降低，且可明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此，MACCI和c-Met對(duì)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。最后，本研究還發(fā)現(xiàn)下調(diào)MACC1表達(dá)抑制了Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9等凋亡蛋白以及Notch1、Hey1、Hes1、Ras、p-ERK1/2等信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，同時(shí)，p53、MDM2等p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)也明顯改變。張德宇[17]的研究中也指出MACC1的表達(dá)情況與P53和Notch信號(hào)通路活性有關(guān)。Xu Z[18]等人認(rèn)為即使是在胰腺癌的晚期階段，使用相關(guān)抑制劑靶向 HGF/c-MET通路，也能顯著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)，進(jìn)一步表明MACCI和c-Met對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的重要性。

綜上所述，在胰腺癌中，MACC1和c-Met的異常高表達(dá)可能與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。下調(diào)MACC1可以抑制凋亡蛋白的表達(dá)、胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，還可抑制Ras/ERK、Notch以及p53信號(hào)通路。MACC1和c-Met與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為判斷胰腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，也是潛在的癌癥治療靶點(diǎn)。