16S rDNA測序分析妊娠期細菌性陰道病患者的陰道菌群結構組成＊

孫秀麗 張 寧 張新麗 王艷玲

濮陽市婦幼保健院婦產(chǎn)科 (河南 濮陽 457000)

妊娠期女性，由于其處在特殊的生理時期，機體抵御微生物的能力下降及體內(nèi)激素水平波動幅度較大，陰道微環(huán)境容易發(fā)生菌群比例失調(diào)，導致生殖道炎性改變，增加不良妊娠結局的發(fā)生，嚴重影響母嬰健康[1-3]。妊娠期細菌性陰道病對妊娠結局的影響較大，且大多屬于無癥狀感染，增加了孕期管理的難度。陰道微環(huán)境中寄居著大量的厭氧菌，且培養(yǎng)困難，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)學方法很難準確呈現(xiàn)妊娠期女性的陰道微生態(tài)及(或)生殖道感染等病理狀態(tài)。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的不斷升級，尤其是高通量測序技術的廣泛應用，使微生物組學的研究更加全面、更加清晰[4]。本研究基于 16S rDNA 測序技術，試圖對妊娠期細菌性陰道病患者與健康孕婦陰道菌群結構進行描述和分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象及入組標準本實驗由濮陽市婦幼保健院倫理委員會審核并批準同意開展。所有入選病例均按照首次確診為妊娠期細菌性陰道病時的孕周劃分為早孕、晚孕組。其中早孕組為孕5-13周，晚孕組為大于28周。

1.2 妊娠期BV組選取在濮陽市婦幼保健院產(chǎn)科門診診斷為妊娠期細菌性陰道病的孕早期(BE)患者15例、孕晚期(BL)患者24例，年齡在20-40歲之間。臨床癥狀主要表現(xiàn)為白帶增多伴腥臭味，根據(jù)臨床診斷(Amsel 標準)在以下 4 項臨床特征中至少三項陽性診斷為 BV，其中第一項必備：① 線索細胞陽性，② 氨試驗陽性，③ 陰道 pH＞4.5，④ 陰道均質(zhì)稀薄的分泌物[5]。

1.3 健康孕婦組 選取同時期在本院產(chǎn)科門診進行孕期檢查的健康孕婦，孕早期組(CE)、孕晚期組(CL)各30例，年齡在20-40歲之間。詳細詢問病史及用藥史、陰道分泌物Nugent評分等。入組標準需要同時滿足：①無臨床癥狀；②陰道清潔度分級為I～Ⅱ級；③Nugent評分 0～3分。兩組均選取我國漢族人，并同時滿足以下條件：孕婦1月內(nèi)未使用抗菌素及陰道局部用藥，3d內(nèi)無性生活史，無糖尿病，無同時患有滴蟲性、霉菌性陰道炎或其它陰道炎[5]。

2 方 法

2.1 樣本采集為了避免標本污染，可先排盡尿液。檢查并記錄外陰、陰道壁、宮頸黏膜有無充血、水腫、斑點等，陰道分泌物的顏色、性狀、量及有無異味。用3根無菌棉簽于陰道上1/3及后穹隆采集分泌物，迅速放入無菌棉式子管內(nèi)，置于冰盒后轉運至實驗室，立即放在冰上進行標記。1根加滴生理鹽水行涂片染色檢查；2根放 入-80℃冰箱冷凍暫存，用來抽提基因組DNA并測序。孕早期健康對照組女性陰道分泌物樣本編號為CE-01、CE-02、……CE-30；孕晚期健康對照組女性陰道分泌物樣本編號為CL-01、CL-02、……CL-30。共采集39例妊娠期 BV患者的陰道分泌物：其中，孕早期(孕12周以前)BV為15例，標記為BE ，陰道分泌物樣本編號為BE-01、BE-02、…… BE-15。 孕晚期(孕28周以上)BV為24例，標記為BL。陰道分泌物樣本編號為BL-1，BL-2…… BL-24。

2.2 樣本總DNA的提取取上述所有樣本，使用 The PowerSoil?DNAIsoilation kit(美國 MOBIO)進行 DNA 抽提，操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。提取后的基因組DNA 用 Nanodrop 2000進行濃度及純度的測定，各樣本基因組 DNA 濃度≥ 20.0ng/μl，OD260/OD280＝1.8～2.0。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 16SrDNA V3V4區(qū)基因擴增及Illumina測序 將上述樣本的基因組總D N A 進行1 6 S r D N A 基因測序分析。選擇細菌 1 6 S r D N A V 3 V 4 可變區(qū)進行P C R 擴增，所用引物F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT。送上海派森諾生物技術股份有限公司，采用Illumina MiSeq的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit測序平臺進行測序分析。上機測序前，樣本逐一質(zhì)檢，只有單一的峰無接頭且濃度在 2nM以上視為達標。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)、剪接引物和載體序列，獲得分析序列與16S rDNA數(shù)據(jù)庫中的序列配對。2 0μL PCR反應液體系(包括DNA模板2μL，上、下游引物定量為2 pmol/ μL，2×pfu PCR MasterMix 5 μL，6×DNA Loading buffer 5 μL，滅菌ddH2O 補足體積，每個樣品設2個重復)，擴增反應在ABI GeneAmp@9700型PCR儀上進行，程序步驟如下：①95℃ 預變性3 min，循環(huán)1次：②95℃反應30 s，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，共27 個循環(huán)；③保持72℃延伸10 min結束。利用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京)對PCR產(chǎn)物進行切膠回收，回收后的PCR產(chǎn)物利用ABI StepOne(ABI，USA)熒光定量分析平臺進行定量檢測，根據(jù)每個樣品的測序量要求，按照合適的比例進行混合。

2.4 MiSeq文庫構建與16SrDNA V3V4可變區(qū)高通量測序 根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作流程將純化后的PCR擴增片段進行文庫構建。采用 Illumina MiSeq 的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 測序平臺進行測序分析。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)、剪接引物和載體序列，去除嵌合體等疑問序列，獲得分析序列與 16S rDNA 數(shù)據(jù)庫中的序列配對。

2.5 數(shù)據(jù)分析優(yōu)化去除含N堿基的reads、無法拼接的序列及存在模糊堿基的序列，即為clean reads。對獲得的序列進行可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)歸并劃分，每個OTU 的代表序列用于微生物的物種鑒定及分類地位鑒定分析；根據(jù) OTU 在各個樣本中的豐度差異，評估每個樣本的微生物多樣性分布特征；通過Alpha 多樣性、Beta多樣性以及物種差異等多種多變量統(tǒng)計學分析方法，進一步比較不同樣本(組)間的菌群分布特征。

2.6 統(tǒng)計分析采用R軟件進行統(tǒng)計學分析；計數(shù)資料采用(%)表示；α多樣性采用Kruskal-Wallis檢驗進行比較分析，使用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)[6]分析組間具有顯著差異的標志物種。

3 結 果

3.1 測序結果共完成99 個樣品測序，獲得 8 927 795條Reads，平均每個樣品 為90 179 條 Reads，最少的樣本為 49 555 條Reads。QIIME2 軟件注釋結果顯示，在CE組、CL組、BE組、BL組分別鑒定出獨有的OTUs1579條、5143條、3255條、2494條OTUs，其中共有的OTUs為204條。見圖1。

圖1 不同組間 OTUs 的韋恩圖。圖2 不同分組的稀釋曲線圖。

3.2 細菌Alpha 多樣性分析 隨著測序深度的增加，各分組中的菌群 OTU 曲線趨于平穩(wěn)，反映該測序深度較合理，可以反映當前樣本所包含的菌群組成多樣性。見圖2。CE組與BE組之間的Alpha 多樣性比較，差異有統(tǒng)計學意義(p＜ 0.05)，CL組與BL組之間的 Alpha 多樣性比較，無顯著統(tǒng)計學差異。見圖3～圖4。

圖3 CE、BE組的Alpha多樣性(Shannon指數(shù))分布。圖4 CL、BL組的Alpha多樣性(Shannon指數(shù))分布。圖5不同分組的細菌門水平物種組成。圖6 不同分組的細菌屬水平物種組成。

3.3 物種注釋結果在門水平上，共發(fā)現(xiàn)26個門，CE組、BE組、CL組、BL組均以厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)占主要比例，分別位列前三位，見圖5。在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)51個屬，見圖6。CE組占比超過0.5%的主要屬，依次為乳桿菌屬(Lactobacillus)8 7.3 4%, 加 德 納 菌 屬(G a rd n e re l l a) 4.8%, 阿 托 波 菌 屬(Atopobium)4.06%, 鏈球菌屬(Streptococcus)1.64%, 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)0.64%, 普氏菌屬(Prevotella)0.52%.CL組依次為乳桿菌屬88.44%，加德納菌屬4.46%，雙歧桿菌屬1.73%，普氏菌屬0.42%，阿托波菌屬 0.69%。BE組依次為乳桿菌屬44.13%，加德納菌屬29.18%，阿托波菌屬10.1%，普氏菌屬 6.3%，梭氏菌屬(Shuttleworthia)3.33%，巨球型菌屬(Megasphaera)2.27%，需氧球菌屬(Aerococcus)0.82%，梭狀芽胞桿菌屬0.52%。BL組依次為乳桿菌屬60.23%，加德納菌屬25.62%，阿托波菌屬8.29%，巨球型菌屬1.54%，普氏菌屬1.46%，需氧球菌屬0.52%。

4 討 論

妊娠期女性由于雌激素水平的改變，陰道上皮細胞內(nèi)糖原含量增加明顯，陰道微生物以乳桿菌為主，乳桿菌分解糖原后乳酸大量積聚，菌群多樣性下降、代謝能力簡化，維持著陰道的低pH和低多樣性的菌群穩(wěn)態(tài)，對感染更具抵抗力，有利于母體及嬰兒健康，但菌群結構特征具有種族差異性[7-8]。 本研究通過 16S rDNA 測序分析發(fā)現(xiàn)，在妊娠期 BV患者的陰道微生物構成中，細菌門水平以厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌門，屬水平占比最大的是乳桿菌屬。乳桿菌屬在生物分類中歸類于厚壁菌門乳桿菌科，研究發(fā)現(xiàn)，多個乳桿菌種均在維持陰道微生態(tài)方面發(fā)揮了重要的作用[9]，乳桿菌屬有很好的抑制生長能力，在陰道內(nèi)與陰道上皮細胞的粘附可阻止病原菌在陰道內(nèi)的定植[10]。

近年來研究表明，惰性乳桿菌不僅是主要陰道乳桿菌，而且可能是優(yōu)勢菌[6]。它能夠持續(xù)生存于陰道中，包括在健康女性和 BV 的微環(huán)境下。多數(shù)研究人員認為，惰性乳桿菌作為陰道微生態(tài)紊亂后定植在陰道內(nèi)的過渡物種，不僅無法維持陰道微生態(tài)的平衡，可能會導致陰道菌群失衡的持續(xù)存在，甚至是引起不良妊娠結局的相關危險因素之一[11]。

雖然多數(shù)學者認為，乳桿菌可以調(diào)節(jié)酸堿度，使陰道局部呈弱酸環(huán)境而抑制或殺滅其他致病微生物，同時通過競爭定植空間，阻止致病微生物的大量繁殖，保持陰道微生境的健康狀態(tài)。但本實驗結果表明，以加德納菌、陰道阿托波菌、短雙歧桿菌等為優(yōu)勢菌的10例孕婦的陰道pH水平亦可以穩(wěn)定在正常范圍。

BV患者由于妊娠引起免疫力降低，陰道內(nèi)優(yōu)勢乳桿菌數(shù)量顯著減少，易發(fā)生致病微生物的侵犯。本研究發(fā)現(xiàn)，BV患者陰道菌群組成及比例發(fā)生了明顯變化，大部分患者的乳桿菌明顯減少,加德納菌屬，阿托波菌屬，巨球型菌屬，普氏菌屬，需氧球菌屬，纖毛菌屬的比例明顯增多。這些細菌豐度的改變可能與妊娠細菌性陰道病的發(fā)生、發(fā)展以及預后相關。本研究結果與相關報道存在一定差異，具體的影響因素有待進一步探究。