珍珠蘆薈白化苗的轉(zhuǎn)錄組分析

陳漢鑫　林藝輝　馬馨怡　林秀芳　黃婉莉

關(guān)鍵詞：珍珠蘆薈；白化苗；轉(zhuǎn)錄組；光合作用；基因表達

中圖分類號：Q943.2 文獻標(biāo)識碼：A

植物葉色白化是植物葉色突變的常見類型，在植物界普遍存在，目前已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、玉米（ Zea mays） 、荔枝（ Litchichinensis）、大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryzasativa）、蘭花（Cymbidium ssp.）等眾多植物中發(fā)現(xiàn)葉片白化現(xiàn)象[1-7]。葉色白化產(chǎn)生的內(nèi)在原因主要與葉綠素含量降低，光合過程受阻，葉綠體發(fā)育異常有關(guān)[8-12]。就植株本身而言，導(dǎo)致葉片白化的機制極其復(fù)雜，主要涉及激素失調(diào)、葉綠體形成基因突變、葉綠素合成基因突變等多種過程[1， 4]。植物葉片白化通常會導(dǎo)致植株光合作用受阻而影響植物的生長和發(fā)育，已被廣泛應(yīng)用到理論基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實踐中。如葉色突變植物是研究植物光合過程中葉綠體發(fā)育分化、葉綠素合成與降解、質(zhì)核基因互作等調(diào)控機制的理想材料。在生產(chǎn)中，某些植物的葉片白化會帶來更大的經(jīng)濟價值和觀賞價值。安吉白茶因其葉片白化導(dǎo)致其氨基酸含量比普通綠茶高3～4 倍，多酚含量低于普通綠茶，提高了其營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。在園林及觀賞花卉植物中，特殊的葉色既豐富了園林景觀的色彩，也大大提高了其觀賞價值和經(jīng)濟價值。例如，禾本科植物竹子的自然突變體菲白竹、銀絲竹，十二卷屬植物黑肌玉露（Haworthia cooperivar. pilifera M. B. Bayer）的白化突變體“拉絲錦”（又名“霓虹燈”）等植物[13-14]。

蘆薈是百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，品種繁多，有超過500 個品種，具有藥用和觀賞價值[15-18]。珍珠蘆薈（Aristaloe aristata）也稱為木銼蘆薈，屬于蘆薈的小型種，葉多而短，株型緊湊，主要供觀賞用。珍珠蘆薈葉片中含有蘆薈大黃素、蘆薈寧，葉肉含粘膠質(zhì)豐富的多聚糖，是保健和美容護膚的佳品[19]。

珍珠蘆薈白化苗，因人工繁殖的難度比較高，且葉片顏色各異，極具觀賞性，在市場上比較稀有，價格比普通品種更高。鑒于珍珠蘆薈白化苗存在重要的觀賞價值及經(jīng)濟價值，為探明珍珠蘆薈苗白化突變分子機制，本研究以組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的珍珠蘆薈白化苗突變株和正常葉色苗的葉片為研究對象，在驗證其葉綠素及類胡蘿卜素含量差異基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)篩選分析珍珠蘆薈白化苗的差異表達基因，挖掘相關(guān)功能基因，為進一步選育珍珠蘆薈新品種提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 珍珠蘆薈正常株（WT）及白化苗突變株（qj 和ls）由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培所得。分別取生長期約為45 d 的植株葉片用于葉綠素和類胡蘿卜素含量測定以及RNA 提取，每種材料3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和純化試劑盒購自天根生化科技有限公司，Nanodrop 2000 微量分光光度計購自ThermoFisher Scientific 公司，LightCycler480 實時熒光定量PCR 儀購自瑞士Roche 公司，P8 型分光光度購自上海美譜達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 光合色素含量測定 采用分光光度計測定珍珠蘆薈及其2 種突變株葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的含量[20]。稱取鮮葉2.0 g 研磨，過濾，取提取液，分別在波長665、649、470 nm 下測定吸光度。根據(jù)公式分別計算出葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Caro）含量：Chla=13.95×A?6.88×A；Chlb=24.96×A?7.32×A；Caro=（1000×A?2.05×Chla?114.8×Chlb）/245。

1.2.2 RNA 提取 珍珠蘆薈正常株（WT）及白化苗突變體（qj 和ls）植株葉片總RNA 提取按照RNA 提取試劑盒中的方法步驟進行，使用微量分光光度計（Nanodrop 2000）檢測其純度和濃度，將符合要求的RNA 置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序 為了使測序結(jié)果更穩(wěn)定，本研究將3 個合格樣品混合為1 個樣品，并在此基礎(chǔ)上做3 個生物學(xué)重復(fù)。使用oligo（dT）磁珠從總RNA 中富集帶poly（A）的mRNA，隨后采用超聲處理成隨機片段。以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA 和第二鏈cDNA，接著用純化試劑盒純化cND，最后進行末端修復(fù)、加尾和加接頭，構(gòu)建成cDNA 文庫，基于IlluminaHiSeq TM 4000 高通量平臺，以Pair-end 150 bp雙端測序模式對cDNA 文庫進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.4 Unigene 序列的獲得和生物信息學(xué)分析首先獲得原始讀長（raw reads），進一步過濾和質(zhì)控獲得clean reads，隨后借助Trinity 軟件根據(jù)序列之間的重疊信息（kmer 長度為31 bp，kmer深度為6）組裝拼接得到Unigene。將獲得的Unigene 序列與Nr、SwissProt、GO、KEGG 和COG 等數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對分析，得到蘆薈基因的蛋白功能注釋和分類。

1.2.5 差異表達基因鑒定與功能富集分析 采用DESeq2[21]進行基因差異表達分析。以FDR<0.05且|log2FC|>1 為標(biāo)準(zhǔn)進行差異表達基因的鑒定。其中FDR<0.05 且logFC>1 的基因為上調(diào)表達基因，F(xiàn)DR<0.05 且logFC<-1 的基因為下調(diào)表達基因。通過FPKM值計算定量Unigenes 的表達豐度，公式：FPKM=10×C/（N×L/1000）。通過BLASTx程序以e-value<1e-5 為閾值在Nr 數(shù)據(jù)庫、Swiss-prot 蛋白數(shù)據(jù)庫、KEGG 數(shù)據(jù)庫和KOG 數(shù)據(jù)庫對Unigenes 注釋。基于Nr 注釋，借助Blast2GO 軟件進行GO 注釋分析[22]。通過WEGO軟件對Unigenes 分類[23]。GO 與KEGG 富集分析是利用超幾何檢驗進行P 值計算并進行Bonferroni 校正，以q-value<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達基因顯著富集的GO 條目或pathway。

1.2.6 DEGs 的qRT-PCR 驗證 采用TaKaRa 公司的PrimeScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用TaKaRa 公司的SYBR Premix ExTaqTM 進行Real-time PCR，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)。內(nèi)參選用珍珠蘆薈actin，利用Primer 5.0 對驗證基因的CDS 區(qū)域設(shè)計特異性引物，引物詳細信息見表1。采用2–ΔΔCT 法計算珍珠蘆薈不同材料間差異基因的相對表達量。比較轉(zhuǎn)錄組水平的FPKM 值和熒光定量PCR 的相對表達量，驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選DEGs 的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 和Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)整理和制圖，采用Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠蘆薈白化苗突變株及其光合色素含量分析

與正常苗對比，白化苗突變株ls 外部色澤呈現(xiàn)白綠相間，白化苗突變株qj 外部色澤呈現(xiàn)淡淡的綠白色，而正常葉色苗呈現(xiàn)均勻綠色（圖1）。對珍珠蘆薈3 種材料葉片的光合色素葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量測定結(jié)果表明，正常植株葉片中葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量極顯著高于白化突變體（ls 和qj）。與正常苗葉片相比，突變體ls 葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別降低63.8%、61.8%和61.1%，突變體材料qj 葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量分別降低73.4%、76.0%和53.1%（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

本研究共獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads）68.23 Gb，經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)控得到有效數(shù)據(jù)（clean reads）67.72 Gb，GC 含量介于47.63%～48.25%之間，Q20平均值超過98%，Q30 平均值超過94%（表2）。經(jīng)過組裝，一共得到122 665 條Unigenes，其中，最長長度為24 511 bp，最短長度為201 bp，平均長度為822 bp，Unigene N50 數(shù)量為19 100，N50長度為1443 bp。不同長度Unigenes 分布比例顯示，長度在200～500 bp 的Unigene 占55.9%，長度超過2000 bp 的占9.36%。上述結(jié)果表明，測序結(jié)果良好，各項質(zhì)控指標(biāo)達到要求，可用于后續(xù)分析。

2.3 Unigene 功能注釋 將組裝得到的122 665條Unigenes 序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫進行比對，其中，51 798 條Unigenes 在Nr 數(shù)據(jù)庫（non-redundantprotein database）中獲得注釋，占42.2%；35 338條Unigenes 注釋到SwissProt 數(shù)據(jù)庫，占28.8%；30 666 條Unigenes 在COG 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占25.0%；29 046 條Unigenes 在GO 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占23.7%；45 496 條Unigene 在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占37.1%（圖3）。

將比對到Nr 數(shù)據(jù)庫的序列進一步分析，結(jié)果表明，珍珠蘆薈與蘆筍（Asparagus officinalis）匹配比例最高，為8822 條，占到可匹配序列的7.19% ， 接下來依次為蒺藜苜蓿（ Medicagotruncatula，5.89%）、棕櫚（Elaeis guineensis，1.93%）、葡萄（Vitis vinifera，1.68%）、海棗（Phoenixdactylifera，1.57%）、金杜鵑（Rhodamnia argentea，1.29%）、石斛（Dendrobium catenatum，1.22%）、黃花蒿（Artemisia annua，1.14 %）（圖4）。

2.3 差異表達基因的GO富集分析

以FDR<0.05 且|log2FC|>1 為條件進行差異表達基因的篩選。結(jié)果表明（圖5），與正常植株WT 的葉片相比，白化苗突變株ls 葉片中有914個差異表達基因，其中453 個上調(diào)，461 個下調(diào)（WT-vs-ls）；白化苗突變株qj 葉片中有1851 個差異表達基因，其中868 個上調(diào)，983 個下調(diào)（WT-vs-qj）。

為了研究珍珠蘆薈白化苗突變株的DEGs 涉及的生物學(xué)功能，將白化植株ls 和qj 中的DEGs分別進行了GO 功能富集分析。由圖6A 和圖6B可知，ls 和qj 的DEGs 均被富集到生物過程（biological process， BP）、細胞組分（cellularcomponent， CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個功能類別。在生物過程中，ls 的DEGs顯著富集在色素積累（pigment accumulation）、組織中的色素積累（pigment accumulation in tissues）、細胞壁組成或生物發(fā)生（cell wall organizationor biogenesis ） 、發(fā)育性生長（ developmentalgrowth）等；qj 的DEGs 則顯著富集在細胞壁組成或生物合成（cell wall organization or biogenesis）、內(nèi)源性刺激反應(yīng)（response to endogenousstimulus）和色素聚集（pigment accumulation）等生物過程。在細胞組分中，ls 的DEGs 顯著富集在細胞壁（cell wall）、細胞外周（cell periphery）、細胞外區(qū)域（extracellular region）等；qj 的DEGs則顯著富集在細胞外周（cell periphery）、細胞壁（cell wall）和外部封裝結(jié)構(gòu)（external encapsulatingstructure）。在分子功能中，ls 顯著富集在水解O-糖基化合物水解酶活性（hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity， acting onglycosyl bonds）和酶抑制劑活性（enzyme inhibitoractivity）；qj 的DEGs 則顯著富集在在水解O-糖基化合物水解酶活性（hydrolase activity， hydrolyzingO-glycosyl compounds）、作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity， acting on glycosylbonds）和氧化還原酶活性（oxidoreductaseactivity）。

2.4 差異表達基因的KEGG富集分析

為研究白化苗突變株ls 和qj 的代謝通路情況，本研究對ls 和qj 的DEGs 分別進行KEGG 富集分析。結(jié)果表明，ls 的差異表達基因顯著富集在植物－病原互作（plant-pathogen interaction）、代謝通路（metabolic pathways）、MAPK 信號通路－植物（MAPK signaling pathway-plant）、二萜生物合成（diterpenoid biosynthesis）及次生代謝物生物合成（biosynthesis of secondary metabolite）等通路（圖7A）；而qj 的DEGs 則顯著富集在核糖體（ribosome）、脂肪酶延伸（fatty acid elongation）、次生代謝物生物合成（biosynthesis ofsecondary metabolite ） 、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）和類黃酮生物化成（flavonoid biosynthesis）等通路（圖7B），2個突變體ls 和qj 均在次生謝物生物合成中差異表達基因存在顯著富集現(xiàn)象。

2.5 參與光合作用相關(guān)基因的篩選及表達分析

基因porA 和Cab13 與葉綠素的合成緊密相關(guān)，其在2 個突變體中均呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達。在與光合作用相關(guān)基因（如光合途徑、天線蛋白、葉綠素合成）中，以FDR<0.05 且|log2FC|>1 為閾值，從突變體ls 中選取了7 個基因，在突變體qj中選取了22 個基因進行分析。結(jié)果表明，與正常植株WT 相比，在突變體ls 中，呈現(xiàn)顯著下調(diào)的基因有原葉綠素酸酯氧化還原酶A（porA）和葉綠素a/b 結(jié)合蛋白（cab13）（圖8）；在突變體qj 中，呈現(xiàn)顯著下調(diào)的基因有moda 和porA（圖8）。與葉綠素合成緊密相關(guān)的基因porA 和Cab13在2 個突變體中均呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達。

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性，采用qRT-PCR對與葉綠素合成的相關(guān)基因porA、cab13 和moda 表達情況進行驗證，結(jié)果表明（圖9），與正常植株WT 相比，白化苗突變株ls 和qj 的porA、cab13 和moda 的表達均顯著下調(diào)，該數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組中FPKM 值的變化數(shù)據(jù)一致，說明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

3 討論

白化突變雖一般為致死性突變，許多植株在幼苗期就會死亡，因此在實際應(yīng)用中受到了限制，但園藝植物的白化突變體卻有極高的觀賞價值，且白化現(xiàn)象也具有一定的理論價值。白化突變體可以用來標(biāo)記性狀，也可以作為特殊的種質(zhì)資源來研究與葉綠體發(fā)育和葉綠素合成的相關(guān)基因的調(diào)控機制。高等植物葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等三大類光合色素含量和分布決定了其顏色[24-27]。本研究通過測定珍珠蘆薈正常植株（WT）和白化苗突變株（ls 和qj）的光合色素表明，白化苗突變株的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量均遠遠低于正常植株。

許多研究表明，植物葉綠素的生物合成是一個高度有序的生理生化過程，20 多個基因編碼的16 種酶參與該過程，當(dāng)此過程發(fā)生障礙，則前體物質(zhì)會積累，進而導(dǎo)致其含量增加，其后的物質(zhì)含量會迅速下降，從而產(chǎn)生顏色變異的葉片；類胡蘿卜素廣泛存在于植物的綠色組織中，它可以保護葉綠素免受光氧化。在合成胡蘿卜素和葉黃素的過程中，相關(guān)基因發(fā)生突變，也能引起植物白化現(xiàn)象的產(chǎn)生，因此，葉色白化突變體形成的內(nèi)在原因主要是葉綠素合成代謝受阻導(dǎo)致的[2， 4， 5]。葉綠素的合成與代謝是一個復(fù)雜調(diào)控過程，涉及許多酶促反應(yīng)，其中每一步酶促反應(yīng)的變化都將影響葉綠素的最終合成而使葉色發(fā)生變化甚至導(dǎo)致植株死亡。已有研究結(jié)果表明，與葉綠素合成和降解緊密相關(guān)基因的異常表達是促使葉片白化現(xiàn)象的主要原因[28]。

在本研究中，對葉色正常和白化的珍珠蘆薈進行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明在白化苗突變株ls葉片中共篩選到914 個差異表達基因（DEGs），其中453 個上調(diào)，461 個下調(diào)；在白化苗突變株qj 葉片中篩選到1851 個差異表達基因，其中868個上調(diào)，983 個下調(diào)。GO 功能富集分析顯示，ls和qj 的差異表達基因均顯著富集在色素積累（pigment accumulation）的生物過程中；在分子功能則均顯著富集在水解O-糖基化合物水解酶活性（hydrolase activity， hydrolyzing O-glycosylcompounds ） 和作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity， acting on glycosyl bonds）中。在對差異基因的KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，ls 和qj均顯著富集在次生代謝物合成等通路中，而與光合作用相關(guān)途徑的差異基因未獲得顯著富集。在對光合色素合成相關(guān)基因的表達情況分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在2 個白化突變株中呈現(xiàn)出顯著差異表達，其中與葉綠素合成的關(guān)鍵基因除porA、cab13和moda 在白化突變株呈現(xiàn)顯著下調(diào)外，sgr 等其他搜尋獲得的基因呈現(xiàn)上調(diào)表達；與類胡蘿卜素降解相關(guān)的基因9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（nced）表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達，這與光合色素含量的測定結(jié)果相一致。研究表明，呈現(xiàn)下調(diào)表達的基因porA、cab13 和moda 為葉綠素合成相關(guān)酶編碼基因，這些基因的突變或下調(diào)表達會影響植物葉素綠的合成。

porA 為原葉綠素酸酯氧化還原酶，它催化底物原葉綠素的還原，最終形成葉綠素。porA 為2個突變株共同下調(diào)表達的基因，porA 基因下調(diào)會導(dǎo)致原葉綠素酸酯合成葉綠素酸酯的酶促反應(yīng)受到影響，進而影響2 個突變株的葉綠素合成，因此推測該基因下調(diào)對珍珠蘆薈白化苗形成起著重要的作用，這與左朋[29]研究中利用過表達porA、porB 基因促進葉綠素的合成的研究結(jié)果相符合。研究顯示porA-1 突變體以及porA RNAi 植株會呈現(xiàn)出嚴(yán)重的光合自養(yǎng)生長缺陷[30]。在暗形態(tài)發(fā)生中，缺失porA 會導(dǎo)致初級質(zhì)體基粒體積和數(shù)量減少，以及光活性的植物原葉綠素酸酯轉(zhuǎn)化的減少[30]。此外，porA 基因?qū)|(zhì)體發(fā)育中膜的超微結(jié)構(gòu)以及正常生化反應(yīng)是至關(guān)重要的[30]；而在呈現(xiàn)上調(diào)表達的基因中，sgr 編碼一個Mg2+去螯合酶，參與到葉綠素的降解過程，sgr 在水稻中過量表達能促進葉綠素分解，減少正常生長葉片中的基粒類囊體片層數(shù)量和葉綠素含量[31]。番茄、水稻、鱷梨、葡萄及草莓等植物中nced 基因主要通過參與到脫落酸生物合成過程，導(dǎo)致植物體內(nèi)脫落酸含量變化，使植物器官呈現(xiàn)不同顏色[32]。

本研究以珍珠蘆薈及其白化突變株為研究對象，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析挖掘出與葉片白化形成相關(guān)的關(guān)鍵功能基因，研究結(jié)果為揭示珍珠蘆薈組培苗白化突變體形成可能包含的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。