環(huán)狀RNA在肺癌發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后中的研究進展*

韓 希 綜述,張艷亮 審校

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科/云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室/云南省醫(yī)學(xué)檢驗臨床醫(yī)學(xué)研究中心,云南昆明 650032

肺癌是目前對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一,根據(jù)2020年版全球癌癥統(tǒng)計報告(GLOBO-CAN2020)的數(shù)據(jù),2020年,全球肺癌的發(fā)病人數(shù)和病死人數(shù)分別為220萬例和180萬例[1]。根據(jù)組織學(xué)類型,肺癌可分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC),其中前者占肺癌的85%[2]。環(huán)狀RNA(circRNA)是真核生物中的前體mRNA(pre-mRNA)經(jīng)反向剪接而形成的頭尾相連的環(huán)狀RNA分子,不具有5′“帽”和3′末端結(jié)構(gòu)。1976年,SANGER等[3]首次發(fā)現(xiàn)了circRNA的存在,但在當(dāng)時其被視為錯誤剪切產(chǎn)生的副產(chǎn)物。隨著二代測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,circRNA被認(rèn)為是一類具有調(diào)節(jié)功能的RNA,并且提出circRNA可以作為微小RNA(miRNA)海綿發(fā)揮生物學(xué)功能[4-5]。有研究顯示,circRNA的表達與肺癌的發(fā)生和進展過程具有密切聯(lián)系,在疾病的動態(tài)監(jiān)測過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。

1 circRNA概述

1.1circRNA的生物學(xué)特性 (1)穩(wěn)定性:因circRNA具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu),其表達極為穩(wěn)定,半衰期可比線性RNA(linear RNA)長達10倍左右,并且天然對核酸酶(RNase)具有抵抗能力,能夠使其自身豐度保持在一個較高的水平上[7-8]。(2)特異性:circRNA廣泛存在于細胞中,在不同的細胞類型及細胞的生長階段、不同疾病及疾病的進展階段分別具有不同的表達模式[9]。(3)豐富性:circRNA 廣泛存在于各物種當(dāng)中,有時其表達豐度可比相應(yīng)的宿主基因高達5倍以上[10]。(4)保守性:circRNA是一種高度保守的環(huán)狀分子,且在不同物種當(dāng)中也具有保守性[11]。

1.2circRNA的形成機制與分類 circRNA分為以下4種類型[12-13]:(1)外顯子circRNA(ecircRNA)。ecircRNA的形成主要為套索環(huán)化模式,通過外顯子的3′端剪接供體與5′端剪接受體結(jié)合,形成套索結(jié)構(gòu),進而再將套索中內(nèi)含子成分移除。ecircRNA多數(shù)定位于細胞質(zhì)中,富含miRNA的結(jié)合元件,能夠在惡性腫瘤轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用。(2)內(nèi)含子circRNA(ciRNA)。線性內(nèi)含子通過配對誘導(dǎo)反向剪接過程,2個內(nèi)含子共價結(jié)合形成內(nèi)含子ciRNA。(3)外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)。EIciRNA是由外顯子和內(nèi)含子共同環(huán)化而形成的,大多數(shù)位于細胞核,可以調(diào)控宿主基因的轉(zhuǎn)錄過程。(4)前體tRNA剪接形成的circRNA(TricRNA)。

1.3circRNA的調(diào)控機制

1.3.1circRNA的海綿吸附活性 位于細胞質(zhì)中的circRNA富含miRNA結(jié)合位點,可以作為高效的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA),通過circRNA-miRNA-mRNA軸實現(xiàn)對靶mRNA的調(diào)控作用。另外,有些circRNA還可以與多個miRNA結(jié)合,實現(xiàn)對多種基因信號通路的調(diào)控[14-15]。HANSEN等[5]早期在人和小鼠的正常大腦中發(fā)現(xiàn)了一個表達量很高的circRNA分子小腦變性相關(guān)蛋白反義轉(zhuǎn)錄物1(CDR1as),其富含多于70個miRNA的作用位點,同時還可以與Argonaute(AGO)蛋白相互作用調(diào)控miR-7的功能。circRNA 可作為“miRNA海綿”是目前circRNA發(fā)揮生物學(xué)功能的主要途徑。

1.3.2與RNA結(jié)合蛋白(RBP)相互作用 RBP是一類可以參與RNA代謝調(diào)控的蛋白質(zhì)。circRNA 可以與 RBP結(jié)合形成復(fù)合物調(diào)節(jié)游離RBP的活性,從而對下游靶mRNA的功能產(chǎn)生影響[16]。人類抗原R(HuR)是一種研究較為廣泛的RBP,circDCUN1D4可以作為支架促進HuR蛋白與硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)的相互作用,從而提高TXNIP mRNA的穩(wěn)定性。有研究證實,circDCUN1D4能夠通過堿基互補直接與TXNIP mRNA相互作用,可以形成circDCUN1D4/HuR/TXNIP RNA-蛋白質(zhì)三元復(fù)合體,并且circDCUN1D4抑制肺腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和糖酵解也需要依賴TXNIP途徑發(fā)揮調(diào)控作用[17]。HUANG等[18]研究發(fā)現(xiàn),circXPO1通過與IGF2BP1相互作用,增強肺腺癌細胞中CTNNB1 mRNA的穩(wěn)定性,并且通過體內(nèi)外實驗證實了circXPO1/IGF2BP1-CTNNB1軸可以促進肺癌細胞的增殖和遷移,而沉默circXPO1能夠抑制腫瘤的生長。上述研究提示circXPO1可能是肺腺癌的治療靶點。

1.3.3翻譯蛋白質(zhì)或多肽 由于circRNA不具有頭尾結(jié)構(gòu),缺乏翻譯所需的必要元件,因此,一般被認(rèn)為是不具備翻譯功能。但最新的研究表明,circRNA可以以一種不依賴帽的方式,通過內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和6-甲基腺嘌呤(m6A)誘導(dǎo)的核糖體參與位點(MIRES)來啟動蛋白質(zhì)/多肽的翻譯[19]。YANG等[20]研究發(fā)現(xiàn),circRNA CIRC-FBXW7在健康人腦中表達上調(diào),由IRES 序列驅(qū)動的開放閱讀框(ORF)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)FBXW7-185aa的序列進行編碼,在人類膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。circZNF609可以在人和鼠的成肌細胞中表達,調(diào)節(jié)成肌細胞的增殖。circZNF609序列中含有跨過反向剪接位點的ORF,可以以不依賴“帽”和依賴剪接的方式使之被翻譯成為蛋白質(zhì),并且其翻譯過程還可以在應(yīng)激條件下進行[21]。

1.3.4調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和剪接 與線性RNA不同,circRNA可以存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。EIciRNA廣泛存在于細胞核,通過與U1小核糖核蛋白粒子(U1 snRNP)相互作用可以與U1 snRNP形成EIciRNA-U1 snRNP復(fù)合物,進一步與親本基因啟動子上的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)轉(zhuǎn)錄物作用,促進親本基因的轉(zhuǎn)錄表達[22]。NAN等[23]通過體內(nèi)外研究證實,circNOL10可以抑制轉(zhuǎn)錄因子SCML1泛素化降解過程并促進其表達,SCML1可以調(diào)控HN多肽家族的線粒體功能,影響多條信號通路,最終抑制肺癌細胞的惡性程度及致瘤能力,延緩肺癌的進展。

2 circRNA在肺癌中的作用

2.1circRNA作為致癌基因 LU等[24]研究發(fā)現(xiàn),circCSNK1G3在肺癌組織中表達上調(diào)。通過細胞增殖和凋亡等功能實驗證實,過表達circCSNK1G3可促進肺癌的惡性程度,并通過生信分析及雙熒光素酶檢測,circCSNK1G3與miR-143-3p的表達呈負(fù)相關(guān),進而誘導(dǎo)下游靶基因HOXA10信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進肺癌的進展。ZHANG等[25]研究結(jié)果表明,circ_0017639在肺癌組織中高度表達,circ_0017639的高表達通過觸發(fā)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強了NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。circSATB2在肺癌中上調(diào),發(fā)揮致癌作用,敲減circSATB2可抑制細胞增殖、侵襲,促進細胞凋亡;之后通過實驗驗證發(fā)現(xiàn),circSATB2具有miR-326的結(jié)合位點,而肌動蛋白結(jié)合蛋白(FSCN1)為miR-326的靶基因,circSATB2 通過調(diào)節(jié) miR-326/FSCN1 軸發(fā)揮致癌基因的作用。此外,circSATB2可以在NSCLC患者血清外泌體中檢測到。因此推測,circSATB2 可以作為肺癌檢測的新型循環(huán)生物標(biāo)志物[26]。hsa_circ_0001875是一個在NSCLC組織和細胞系中顯著上調(diào)的環(huán)狀分子,可以促進NSCLC腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移;在作用機制上,circ-000187通過轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smad2信號通路調(diào)節(jié)miR31-5p/sp1軸,促進上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,發(fā)揮致癌作用[27]。

2.2circRNA作為抑癌基因 circSCAP在肺癌組織中的表達水平低于癌旁組織,其表達水平與肺癌患者TNM分期呈負(fù)相關(guān);通過生物學(xué)功能實驗驗證發(fā)現(xiàn),過表達circSCAP可以顯著減弱NSCLC細胞的活力,抑制遷移和侵襲;circSCAP可以直接與SF3A3結(jié)合并促進其降解,導(dǎo)致MDM4S水平升高,激活p53信號,進而抑制NSCLC的惡性程度,延緩肺癌的進展[28]。LI等[29]研究發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0030998在肺癌組織較癌旁組織中表達量較低,并可以通過與miR-558相互作用延緩肺癌的進展,抑制細胞增殖活性及侵襲等惡性細胞表型,同時可以降低肺癌細胞對紫杉醇的耐藥性。circNDUFB2在肺癌組織中呈低表達,并且可以作為支架蛋白增強TRIM25與IGF2BPs的結(jié)合,IGF2BPs是能夠促進腫瘤進展的正向調(diào)控因子,三者形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)可以加速IGF2BPs的泛素化降解進程。此外,circNDUFB2還能夠激活RIG-I-MAVS信號通路,觸發(fā)腫瘤的免疫防御反應(yīng)[30]。

2.3circRNA與肺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲 轉(zhuǎn)移與癌癥患者的死亡和治療失敗密切相關(guān)。circRNA 是多種惡性腫瘤進展相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)控分子,如經(jīng)典的Wnt信號通路、TGF-β等信號通路,這些通路都是影響腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移與EMT的重要調(diào)控通路。circ_0001806在NSCLC組織和細胞中表達呈高表達,circ_0001806可通過“miRNA海綿”抑制miR-1182的功能,增強神經(jīng)腫瘤腹側(cè)抗原2(NOVA2)的表達,促進NSCLC細胞的遷移和侵襲[31]。c-Myc是原癌基因 MYC 編碼的轉(zhuǎn)錄因子,是多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶基因,與多種惡性腫瘤的發(fā)生具有密切聯(lián)系[32]。ZHANG等[33]研究發(fā)現(xiàn),circRNA_010763可作為miR-715的ceRNA發(fā)揮生物學(xué)功能,抑制miR-715對c-Myc的負(fù)調(diào)控,上調(diào)c-Myc基因的表達,促進癌細胞的生長、加速癌細胞的遷移和侵襲。LIU等[34]研究發(fā)現(xiàn),雌激素受體β(Erβ)可通過與circ-TMX4宿主基因TMX4的5′端啟動子區(qū)域結(jié)合促進其表達;體內(nèi)外實驗驗證結(jié)果顯示,circ-TMX4可以抑制miR-622的表達,通過減少miRNA與其3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的結(jié)合,增加CXCR4信使RNA的翻譯,從而促進NSCLC細胞的侵襲。

2.4circRNA調(diào)控肺癌腫瘤微環(huán)境 腫瘤間質(zhì)與細胞外基質(zhì)、氧氣水平和pH等因素共同構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境,微環(huán)境變化在腫瘤發(fā)生階段具有至關(guān)重要的作用[35]。缺氧是腫瘤生長的重要標(biāo)志,主要受缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1α)的調(diào)節(jié)。HIF-1α在缺氧環(huán)境中表達量增多,可以調(diào)節(jié)多種與缺氧有關(guān)的基因,使腫瘤細胞可以快速對缺氧的微環(huán)境進行適應(yīng)性調(diào)節(jié),促進腫瘤的進展[36]。有研究發(fā)現(xiàn),circHMGB2在腫瘤組織中較配對癌旁組織表達上調(diào),circHMGB2的高表達可以影響肺癌細胞的增殖,并且可以通過circHMGB2/miR-181a-5p/CARM1軸促進形成免疫抑制腫瘤微環(huán)境來限制程序性死亡受體-1(PD-1)的療效[37]。SHANGGUAN等[38]研究發(fā)現(xiàn),circSLC25A16(hsa_circ_0018534)可以促進NSCLC細胞的糖酵解過程,提升葡萄糖攝取、乳酸合成和三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生的能力,促進癌細胞的增殖。此外,circSLC25A16可以吸附miR-488-3調(diào)節(jié)HIF-1α的表達,促進乳酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄激活。

3 circRNA的臨床價值

circRNA 穩(wěn)定性高、半衰期長,并廣泛存在于人體的血清、血漿和外泌體中,容易被收集檢測,使得circRNA成為包括癌癥在內(nèi)多種疾病理想的生物標(biāo)志物。

3.1可作為肺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物 在NSCLC組織中篩選出表達顯著上調(diào)的circRNA100146,circRNA100146對NSCLC的診斷具有一定價值,其靈敏度和特異度均高于大多數(shù)肺癌的診斷標(biāo)志物[39]。circRNA_101237在NSCLC細胞和組織中均呈高表達,經(jīng)Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,circRNA_101237表達量高的患者的總體生存期短于表達水平低的患者,提示circRNA_101237的表達與NSCLC患者預(yù)后不良具有密切關(guān)系[40]。

3.2可作為肺癌治療的靶點 circ_0072088在NSCLC組織中表達顯著下調(diào),細胞功能實驗中證實,circ_0072088可以通過與miR-944結(jié)合抑制LASP1的表達,進而抑制NSCLC細胞的惡性進展,提高NSCLC細胞對順鉑藥物的敏感性,因此,circ_007208可能成為NSCLC新的治療靶點[41]。circRNA-002178在LUAD組織和細胞中顯著上調(diào),circRNA-002178可以通過海綿介導(dǎo)miR-34在癌細胞中促進T細胞耗竭促進PD-L1的表達。circRNA-002178可以通過外泌體從癌細胞轉(zhuǎn)移到CD8+T細胞中,并吸收CD8+T細胞中的miR-28-5p誘導(dǎo)PD-1的表達,提示circRNA-002178可作為檢測LUAD一個潛在的生物標(biāo)志物,并可以作為肺癌免疫治療的靶點[42]。

4 小結(jié)與展望

隨著circRNA 在不同類型的肺癌組織中被發(fā)現(xiàn),circRNA被證實參與肺癌的進展。circRNA對于肺癌的診斷具有較高的特異度與靈敏度,研究潛力較大。雖然越來越多的研究人員進行circRNA與肺癌發(fā)病機制的研究,但大部分研究重點集中在circRNA的miRNA海綿吸附功能上,應(yīng)更多地關(guān)注circRNA與蛋白質(zhì)的相互作用及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能等的研究。由于circRNA數(shù)量繁多、功能復(fù)雜,它們的分子機制在很大程度上仍然是未知的,阻礙了其在臨床上的應(yīng)用,并且NSCLC患者的預(yù)后不良可能與肺癌進展的復(fù)雜性和分子機制的不明確性相關(guān)。因此,還需對circRNA進行深入研究,使其能夠在癌癥研究及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中正確和精確地使用。