大豆苷元調(diào)節(jié)SIRT1/AMPK信號通路對非酒精性脂肪肝大鼠自噬反應(yīng)的影響

吳德建,楊 秋,謝桂丹,彭 鑫

儋州市人民醫(yī)院:1.消化內(nèi)科;2.檢驗科,海南儋州 571799

近年來,肥胖和2型糖尿病患病率上升,非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病率亦持續(xù)上升且呈低齡化趨勢,并隨著病程延長,非酒精性單純性脂肪肝可能發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎,甚至發(fā)展成肝硬化、肝細胞癌[1-2]。目前,由于NAFLD診斷困難、發(fā)病機制復(fù)雜、缺乏標準的治療方法,其仍是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[3]。因此,尋找安全、高效的早期干預(yù)措施阻滯或延緩NAFLD病情進展具有重要意義。大豆苷元(DAI)是一種大豆異黃酮,具有抗炎和抗氧化作用,已有研究表明DAI預(yù)處理可減輕刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝損傷小鼠氧化應(yīng)激和肝細胞凋亡[4]。自噬作為一種通過溶酶體吞噬降解自身組分的細胞內(nèi)分解代謝途徑,在調(diào)節(jié)胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝和改善NAFLD的肝細胞脂肪變性中發(fā)揮重要作用[5]。激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路增強自噬,可減輕高脂飲食喂養(yǎng)的NAFLD大鼠脂質(zhì)沉積[6]。此外,DAI治療糖尿病大鼠可升高AMPK和SIRT1表達水平,降低血糖并調(diào)節(jié)血脂水平,減輕氧化應(yīng)激,緩解心肌組織損傷[7]?；诖?筆者推測DAI可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/AMPK信號通路激活自噬反應(yīng),減輕NAFLD大鼠肝臟損傷。為驗證上述猜測,本研究著重觀察DAI在改善NAFLD大鼠肝臟損傷時對自噬及SIRT1/AMPK信號通路的影響,以期為NAFLD的藥物治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只健康雄性SD大鼠,無特定病原體(SPF)級,6～7周齡,體重(200±10)g,由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2020-0005。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(23±2)℃,濕度(50±5)%,12 h光/暗循環(huán),自由飲水攝食。本研究遵循《實驗動物保護條例》相關(guān)規(guī)定,符合動物實驗學(xué)“3R”原則(即減量化原則、再使用原則、再循環(huán)原則)。

1.2試劑與儀器 DAI(上海源葉生物科技有限公司,貨號:B20227-20 mg);SIRT1抑制劑(EX-527,美國MCE公司,貨號:HY-15452);天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、原位末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1120-100、T2130-50T);免疫組化試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號:E-IR-R215);SYBR Green Realtime PCR Master Mix(日本TOYOBO公司,貨號:QPK-201);微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin-1、p62、SIRT1、AMPK、磷酸化的AMPK(p-AMPK)、GAPDH抗體(兔抗)及辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG(美國Abcam公司)。cobas c 311全自動生化分析儀(德國羅氏診斷);Sunrise酶標儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司);E100生物顯微鏡(日本尼康公司);ABI 7500 RT-qPCR儀(美國Thermofisher公司);ZF-268全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海金鵬分析儀器有限公司)。

1.3分組、造模與給藥 60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機數(shù)表法分為對照組、NAFLD組、DAI低劑量組(DAI-L組)、DAI高劑量組(DAI-H組)和DAI-H+EX-527組,每組12只。對照組大鼠給予普通飼料,其余組大鼠給予高脂飼料(普通飼料+10%豬油+1%膽固醇+0.5%膽酸鈉等)以構(gòu)建NAFLD模型,連續(xù)喂養(yǎng)12周[8-9]。造模結(jié)束后每組隨機取2只大鼠處死,通過觀察大鼠肝臟外部形態(tài)、肝組織病理學(xué)改變等判斷是否造模成功。確定造模成功后,每組剩余的10只大鼠進行后續(xù)實驗。參照文獻[7,10]并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果進行相應(yīng)處理,DAI-L組、DAI-H組大鼠分別灌胃50、100 mg/kg DAI;DAI-H+EX-527組大鼠灌胃100 mg/kg DAI同時腹腔注射5 mg/kg EX-527;NAFLD組和對照組給予等量生理鹽水。其中,DAI每天灌胃1次,EX-527每3天腹腔注射1次,連續(xù)6周。

1.4樣本收集與肝臟指數(shù)檢測 末次給藥后大鼠禁食12 h,稱取體重。隨后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血,血樣4 ℃靜置1 h后以3 000 r/min離心15 min,取上層血清,保存于-20 ℃冰箱。處死大鼠,摘取肝臟組織,使用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈,并用濾紙吸除多余水分,稱量肝臟濕重,計算每只大鼠肝臟指數(shù)[肝臟指數(shù)(%)=大鼠肝臟濕重(g)/大鼠體重(g)×100%][11]。稱量肝臟濕重后立即將每只大鼠的肝臟組織分成4份,1份置于4%多聚甲醛中固定,1份使用生理鹽水制備10%組織勻漿液,剩余2份置于-80 ℃冰箱保存。

1.5全自動生化分析儀檢測血清肝功能指標及血脂水平 嚴格參照全自動生化分析儀及各自試劑盒操作說明,檢測大鼠血清肝功能指標(AST、ALT)及血脂(TC、TG)水平。

1.6HE染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué) 將固定24 h后的肝組織制成常規(guī)石蠟切片(厚度4 μm),切片經(jīng)脫蠟、水化后進行蘇木素、伊紅染色,顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變。采用NAFLD活動度積分(NAS)評價大鼠肝組織脂肪變性(0%～5%、>5%～33%、>33%～66%、>66%分別記為0、1、2、3分)、氣球樣變(無、不明顯且少量、顯著且大量分別記為0、1、2分)和肝小葉炎癥程度(無、<2、2～4、>4級分別記為0、1、2、3分),計算總評分(即NAS評分,范圍:0～8分)[12]。

1.7TUNEL法檢測肝細胞凋亡率 4 μm厚的石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、水化后置于枸櫞酸鹽緩沖液中加熱進行抗原熱修復(fù),3% H2O2滅活內(nèi)源性酶后滴加TUNEL反應(yīng)緩沖液,DAPI染核,熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。凋亡細胞呈綠色熒光,計算細胞凋亡率。

1.8免疫組化法檢測肝組織中LC3陽性表達 4 μm厚的石蠟組織切片脫蠟至水、抗原熱修復(fù)、滅活內(nèi)源性酶后滴加正常山羊血清進行封閉,滴加一抗(LC3抗體)4 ℃孵育過夜,滴加聚過氧化物酶標記IgG抗體37 ℃孵育30 min,DAB顯色、蘇木素染細胞核,于顯微鏡下觀察。陽性細胞呈棕黃色或褐黃色,Image ProPlus 6.0半定量軟件測定陽性細胞平均光密度(MOD)。

1.9Western blotting檢測肝組織中自噬及SIRT1/AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達 RIPA裂解液充分裂解肝臟組織提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白濃度后將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致,取20 μg變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),切膠后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%牛血清白蛋白(BSA)封閉膜2 h,膜與一抗稀釋液(Beclin-1、p62、LC3、SIRT1、AMPK、p-AMPK、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜,洗滌后,放入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗稀釋液中,室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光試劑顯色、曝光。Image J軟件分析蛋白條帶灰度,以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝臟指數(shù)比較 對照組[(2.43±0.18)%]、NAFLD組[(3.75±0.25)%]、DAI-L組[(3.12±0.24)%]、DAI-H組[(2.71±0.20)%]、DAI-H+EX-527組[(3.42±0.26)%]大鼠肝臟指數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,NAFLD組大鼠肝臟指數(shù)升高(P<0.05);與NAFLD組比較,DAI-L組和DAI-H組大鼠肝臟指數(shù)降低(P<0.05),且DAI-H組低于DAI-L組(P<0.05);與DAI-H組比較,DAI-H+EX-527組大鼠肝臟指數(shù)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示,DAI可減輕NAFLD大鼠肝臟損傷,而EX-527減弱了DAI的作用。

2.2各組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平比較 與對照組比較,NAFLD組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平升高(P<0.05);與NAFLD組比較,DAI-L組和DAI-H組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平降低(P<0.05),且DAI-H組低于DAI-L組(P<0.05);與DAI-H組比較,DAI-H+EX-527組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平升高(P<0.05)。見表1。各組大鼠血清指標比較結(jié)果提示,DAI可改善NAFLD大鼠血脂異常,而EX-527減弱了DAI的作用。

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平比較

2.3各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變及NAS評分比較 對照組大鼠肝細胞排列整齊,大小均勻;NAFLD組大鼠肝組織中出現(xiàn)大量脂肪空泡、明顯氣球樣變及炎性細胞浸潤和細胞壞死;DAI-L組和DAI-H組大鼠上述肝組織病理學(xué)損傷均有不同程度改善,其中DAI-H組改善更為明顯;相比于DAI-H組,DAI-H+EX-527組大鼠肝組織病理學(xué)損傷加重。對照組、NAFLD組、DAI-L組DAI-H組、DAI-H+EX-527組NAS評分分別為(0.00±0.00)、(6.54±0.78)、(4.72±0.62)、(2.65±0.54)、(5.48±0.70)分;NAFLD組NAS評分高于對照組,DAI-L組和DAI-H組NAS評分均低于NAFLD組,DAI-H+EX-527組高于DAI-H組(P<0.05)。見圖1。結(jié)果提示,DAI可改善NAFLD大鼠肝組織病理學(xué)損傷,而EX-527減弱了DAI的作用。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果

2.4各組大鼠肝細胞凋亡率比較 與對照組[(6.51±1.12)%]比較,NAFLD組大鼠肝細胞凋亡率[(35.62±3.98)%]升高(P<0.05);與NAFLD組比較,DAI-L組和DAI-H組大鼠肝細胞凋亡率[(24.24±3.27)%、(10.35±2.59)%]降低(P<0.05),且DAI-H組低于DAI-L組(P<0.05);與DAI-H組比較,DAI-H+EX-527組大鼠肝細胞凋亡率[(26.36±3.18)%]升高(P<0.05)。見圖2。結(jié)果提示,DAI可緩解NAFLD大鼠肝細胞凋亡,而EX-527減弱了DAI的作用。

圖2 各組大鼠肝細胞凋亡TUNEL染色結(jié)果

2.5各組大鼠肝組織中LC3陽性表達水平比較 LC3主要表達于細胞核中,LC3陽性細胞核內(nèi)可見棕黃色或褐黃色顆粒。各組陽性表達水平比較:與對照組(0.93±0.10)比較,NAFLD組大鼠肝組織中LC3陽性細胞數(shù)量較少,顏色較淺,LC3陽性表達水平(0.48±0.14)降低(P<0.05);與NAFLD組比較,DAI-L組和DAI-H組大鼠肝組織中LC3陽性細胞數(shù)量較多,顏色較深,LC3陽性表達水平[(0.66±0.13)、(0.85±0.15)]升高(P<0.05),且DAI-H組變化更為明顯(P<0.05);與DAI-H組比較,DAI-H+EX-527組大鼠肝組織中LC3陽性細胞數(shù)量減少,顏色變淺,LC3陽性表達水平(0.57±0.12)降低(P<0.05)。見圖3。結(jié)果提示,DAI可能通過促進LC3表達增強NAFLD大鼠肝組織自噬反應(yīng),而EX-527減弱了DAI的作用。

圖3 各組大鼠肝組織中LC3免疫組化結(jié)果

2.6各組大鼠肝組織中Beclin-1、p62、LC3蛋白表達水平比較 與對照組比較,NAFLD組大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平降低(P<0.05),p62蛋白表達水平升高(P<0.05);與NAFLD組比較,DAI-L組和DAI-H組大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平升高(P<0.05),p62蛋白表達水平降低(P<0.05),且DAI-H組變化更為明顯(P<0.05);與DAI-H組比較,DAI-H+EX-527組大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平降低(P<0.05),p62蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖4、表2。結(jié)果提示,DAI可能通過促進自噬體形成提高NAFLD大鼠肝組織自噬水平,而EX-527減弱了DAI的作用。

表2 各組大鼠肝組織中Beclin-1、p62、LC3蛋白表達水平比較

圖4 各組大鼠肝組織中Beclin-1、p62、LC3 Western blotting檢測結(jié)果

2.7各組大鼠肝組織中SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白表達水平比較 與對照組比較,NAFLD組大鼠肝組織中SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平降低(P<0.05);與NAFLD組比較,DAI-L組和DAI-H組大鼠肝組織中SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平升高(P<0.05),且DAI-H組高于DAI-L組(P<0.05);與DAI-H組比較,DAI-H+EX-527組大鼠肝組織中SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖5、表3。結(jié)果提示,DAI可激活NAFLD大鼠肝組織中SIRT1/AMPK通路,而EX-527減弱了DAI的作用。

圖5 各組大鼠肝組織中SIRT1、AMPK、p-AMPK Western blotting檢測結(jié)果

表3 各組大鼠肝組織中SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平比較

3 討 論

目前,飲食調(diào)節(jié)、加強體育鍛煉等仍是NAFLD的主要干預(yù)措施,治療藥物也僅限于吡格列酮和維生素E,但均存在一定不良反應(yīng)[13]。據(jù)報道,自噬參與調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、炎癥和纖維化等病理變化,是代謝相關(guān)脂肪肝病的一個新治療靶點[14]。恩格列凈通過激活自噬和減少肝細胞凋亡減輕高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠NAFLD進展[15]?？ǜ窳袃敉ㄟ^調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抑制炎癥來改善NAFLD的機制與促進自噬有關(guān)[16]。故調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)在NAFLD的藥物治療中可能具有重要意義。

DAI作為大豆異黃酮的主要成分之一,具抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗癌等多種生物學(xué)活性[17-18]。DAI預(yù)處理不僅通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激改善脂多糖誘導(dǎo)的肝細胞損傷[19],而且可減輕刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝損傷小鼠氧化應(yīng)激和肝細胞凋亡[4],但DAI對NAFLD是否發(fā)揮治療作用尚有待挖掘。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)成功復(fù)制了NAFLD大鼠模型,具體表現(xiàn)在肝臟指數(shù),血清AST、ALT、TC、TG水平,NAS評分,肝細胞凋亡率升高,且肝組織中出現(xiàn)大量脂肪空泡、明顯氣球樣變,以及炎性細胞浸潤和細胞壞死。而DAI干預(yù)NAFLD大鼠后,肝臟指數(shù),血清AST、ALT、TC、TG水平,NAS評分,肝細胞凋亡率降低,表明DAI治療NAFLD大鼠同樣具有調(diào)節(jié)血脂水平,減少肝細胞凋亡,改善肝功能,減輕肝臟損傷的功效。

據(jù)報道,DAI衍生物X-11-5-27通過促進自噬抑制NLRP3炎性體活性[20]。大豆異黃酮通過刺激BEX2/BNIP3/NIX通路激活線粒體自噬來保護SH-SY5Y神經(jīng)元[21]。但DAI是否可通過激活自噬減輕NAFLD中肝臟損傷尚不明確。本研究中,NAFLD模型大鼠肝組織中自噬標志物(LC3)陽性表達水平,自噬啟動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(Beclin-1)、自噬體成熟標記物(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)蛋白表達水平均降低,而自噬的選擇性底物(p62)蛋白表達水平均升高。本研究結(jié)果表明,高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD大鼠中自噬水平降低。進一步分析發(fā)現(xiàn),DAI干預(yù)NAFLD大鼠后肝組織中LC3陽性表達水平,Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平均升高,而p62蛋白表達水平降低,表明DAI可增強NAFLD大鼠肝組織中自噬反應(yīng)。

有研究顯示,多條信號通路如AMPK/mTOR、SIRT1/AMPK等均參與自噬調(diào)節(jié),并減輕肝損傷[22-23]。但DAI通過調(diào)節(jié)哪條信號通路增強NAFLD大鼠自噬反應(yīng)進而減輕肝臟損傷有待進一步探索。SIRT1可以直接與AMPK啟動子結(jié)合,二者結(jié)合后AMPK可以激活SIRT1的表達,SIRT1的表達也可以激活A(yù)MPK,進而形成正反饋回路[24]。本研究中,NAFLD模型大鼠肝組織中SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平降低,而DAI干預(yù)NAFLD大鼠后SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平升高,提示DAI可促進NAFLD大鼠肝組織中SIRT1/AMPK信號通路激活。為了更充分地驗證SIRT1/AMPK信號通路的作用,本研究在DAI干預(yù)基礎(chǔ)上給予SIRT1抑制劑(EX-527),結(jié)果顯示,EX-527不僅可抑制SIRT1/AMPK信號通路激活,而且能夠減弱DAI對NAFLD大鼠肝臟損傷的改善作用。以上研究結(jié)果說明,DAI可能通過促進SIRT1/AMPK信號通路激活增強自噬反應(yīng),同時調(diào)節(jié)血脂水平、增強抗氧化能力、減少肝細胞凋亡、改善肝功能,進而減輕NAFLD大鼠肝臟損傷。PANT等[25]研究亦顯示,富硒益生菌通過上調(diào)AMPK、SIRT1表達激活自噬改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝功能、肝脂肪變性等癥狀。

綜上所述,DAI可能通過促進SIRT1/AMPK信號通路激活增強自噬反應(yīng),減輕NAFLD大鼠肝臟損傷。本研究為NAFLD的治療藥物選擇和治療靶點設(shè)計提供了一定理論基礎(chǔ)。但由于受實驗經(jīng)費、實驗條件等限制,本研究尚存在一定不足之處:(1)未通過電鏡觀察肝組織中自噬小體變化;(2)未采用特異性抑制劑直接干預(yù)AMPK;(3)DAI是否還可通過其他通路調(diào)控NAFLD中自噬反應(yīng)尚不明確;(4)DAI的最佳給藥劑量和給藥方式仍不清楚等。本課題組將在后續(xù)實驗中進一步完善相關(guān)研究,從而為DAI用于NAFLD治療提供更多證據(jù)。