miR-451a對慢性心衰細(xì)胞模型心肌細(xì)胞H9c2凋亡與自噬的影響

朱繼榮, 楊波, 張博媛

深圳市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科,廣東深圳 518000

慢性心力衰竭簡稱慢性心衰,主要因為心肌梗死、心肌病、血流動力學(xué)負(fù)荷過重等引起的心肌損傷[1]。心肌損傷機制復(fù)雜多樣,心肌細(xì)胞凋亡、自噬在慢性心衰發(fā)展過程中具有重要作用[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)在人體不同組織、不同病理或生理過程中表達(dá)不同。miRNA異常表達(dá)與心肌細(xì)胞損傷有關(guān),通過調(diào)控相關(guān)信號通路參與疾病的發(fā)展[3]。研究發(fā)現(xiàn),慢性心衰患者血清miR-451a低表達(dá)與患者分級有關(guān)[4],但是對慢性心衰細(xì)胞模型的研究尚不清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路在心肌細(xì)胞損傷中激活能力降低,因此,抑制mTOR信號通路可促進心肌細(xì)胞凋亡和自噬[5-6]。本研究通過構(gòu)建慢性心衰細(xì)胞模型,探究miR-451a對心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響,以及可能相關(guān)的信號通路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;阿霉素(doxorubicin,DOX)、CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;Lipofectamine 2000試劑盒購自賽默飛世爾公司;miR-NC、miR-451a、引物由廣州銳博公司設(shè)計合成;TRIzol試劑盒、miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司;mTOR通路抑制劑CCI-779購自美國Houston公司;凋亡試劑盒購自碧云天生物公司;剪切的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、Beclin-1抗體、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅰ(LC3I)抗體、LC3II抗體、磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體、mTOR抗體、p-p70s6k抗體、p70s6k抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和模型建立

心肌細(xì)胞H9c2用DMEM培養(yǎng)基進行孵育,將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合超過80%,使用胰蛋白酶消化培養(yǎng)。

取對數(shù)期心肌細(xì)胞H9c2,胰酶消化處理后,接種至96孔板,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基,將細(xì)胞分為Control組、DOX組、DOX+miR-NC組、DOX+miR-451a組、DOX+miR-451a+CCI-779組。Control組為正常心肌細(xì)胞H9c2;DOX組采用1 μmol/L DOX處理細(xì)胞24 h,參照文獻[7]建立慢性心衰細(xì)胞模型;DOX+miR-NC組、DOX+miR-451a組為成功轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-451a 6 h后,更換新鮮培養(yǎng)基用1 μmol/L DOX處理細(xì)胞24 h;DOX+miR-451a+CCI-779組成功轉(zhuǎn)染miR-451a 6 h后,更換新鮮培養(yǎng)基用1 μmol/L DOX和mTOR通路抑制劑CCI-779處理細(xì)胞24 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書。

1.3 qRT-PCR檢測miR-451a相對表達(dá)水平

取Control組、DOX組、DOX+miR-NC組、DOX+miR-451a組心肌細(xì)胞H9c2按照TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,分光光度計檢測RNA水平,以miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,配置熒光定量反應(yīng)體系進行PCR反應(yīng)。2-ΔΔCt方法檢測miR-451a相對表達(dá)水平,U6作為內(nèi)參基因。miR-451a上游引物;5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACT-3′,下游引物:5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′;U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物:5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性

收集心肌細(xì)胞H9c2,按照1.2進行處理接種96孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔中加入100 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度(optical density,OD)值,細(xì)胞活性(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集培養(yǎng)24 h的各組心肌細(xì)胞H9c2,PBS沖洗細(xì)胞,然后制細(xì)胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC和PI溶液,避光反應(yīng)15 min,置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.6 Western blotting檢測

使用蛋白裂解液提取心肌H9c2細(xì)胞蛋白,BCA法檢測蛋白水平,將30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離,90 V電壓轉(zhuǎn)膜,封閉培養(yǎng)60 min,將cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3I、LC3II、p-mTOR、mTOR、p-p70s6k、p70s6k抗體稀釋為1∶600,4 ℃過夜孵育,室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液,孵育60 min,ECL顯色,曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功建立慢性心衰細(xì)胞模型

光鏡下觀察到正常H9c2細(xì)胞為梭形,結(jié)構(gòu)完整,DOX處理后H9c2細(xì)胞呈圓梭形,細(xì)胞間連接減少,偽足消失,并伴有不同程度的細(xì)胞腫脹和壞死,提示慢性心衰細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 DOX處理后H9c2細(xì)胞形態(tài)變化A為正常H9c2細(xì)胞;B為1 μmol/L DOX處理24 h的H9c2細(xì)胞。

2.2 各組miR-451a表達(dá)水平比較

與Control組比較,DOX組miR-451a相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組miR-451a相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05;圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-451a在細(xì)胞中的表達(dá)a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.3 上調(diào)miR-451a對DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

與Control組比較,DOX組細(xì)胞活性顯著降低,凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組細(xì)胞活性顯著升高,凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05;圖3)。

圖3 上調(diào)miR-451a對阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響1為Control組;2為DOX組;3為DOX+miR-NC組;4為DOX+miR-451a組。A為細(xì)胞凋亡;B為細(xì)胞活性;C為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.4 上調(diào)miR-451a對DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞自噬的影響

與Control組比較,DOX組Beclin-1、LC3II/I蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組Beclin-1、LC3II/I蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05;圖4)。

圖4 上調(diào)miR-451a對阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞自噬的影響1為Control組;2為DOX組;3為DOX+miR-NC組;4為DOX+miR-451a組。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.5 上調(diào)miR-451a對DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較,DOX組p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05;圖5)。

圖5 上調(diào)miR-451a對DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響1為Control組;2為DOX組;3為DOX+miR-NC組;4為DOX+miR-451a組。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.6 miR-451a通過調(diào)控mTOR信號通路對DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡、自噬的影響

與DOX+miR-451a組比較,DOX+miR-451a+CCI-779組細(xì)胞活性降低,而凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表達(dá)升高(P<0.05;圖6、表1)。

圖6 miR-451a通過調(diào)控mTOR信號通路對DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白的影響1為DOX+miR-451a組;2為DOX+miR-451a+CCI-779組。

3 討 論

阿霉素是常見的抗腫瘤藥物,常用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌等惡行腫瘤的治療,但阿霉素也具有明顯的心臟毒性,可誘發(fā)慢性心衰[8-9]。多數(shù)動物體內(nèi)實驗、體外細(xì)胞實驗常用阿霉素誘導(dǎo)建立慢性心衰模型[10-11]。阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞,導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),促進細(xì)胞凋亡和自噬,導(dǎo)致心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷從而誘發(fā)慢性心衰[12]。cleaved在正常條件下以無活性的酶原形式存在,外界刺激后以活化酶切的形式存在,常見成員有cleaved-Caspase-3等,Bax促進線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變,使細(xì)胞色素C釋放進入細(xì)胞質(zhì),可激活cleaved-Caspase-3,并促進細(xì)胞凋亡[13]。Beclin-1是自噬相關(guān)蛋白,與自噬體的形成和成熟形成有關(guān),自噬發(fā)生時,LC3I經(jīng)過剪切與磷脂酰乙醇胺結(jié)合后生成LC3II,LC3II/I比值常用來反饋自噬水平[14]。本研究使用阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立慢性心衰模型,結(jié)果顯示,細(xì)胞活性降低,凋亡率增加,cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表達(dá)上調(diào),提示慢性心衰細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

miRNA與人類疾病發(fā)展有關(guān),還可成為一些疾病分子靶向的靶點[15]。miR-451a通過基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)-2/MMP-9調(diào)節(jié)心臟重塑的發(fā)展[16]。在阿霉素誘導(dǎo)小鼠建立心臟毒性模型的結(jié)果顯示,在小鼠模型血漿和組織內(nèi)miR-34a-5p和miR-451a低表達(dá),表明miR-34a-5p和miR-451a與阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示,阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中miR-451a表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-451a可增加細(xì)胞活性,降低凋亡率,下調(diào)cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I,提示上調(diào)miR-451a可減輕阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和自噬。

miRNA可通過調(diào)控信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與疾病的發(fā)展[18]。本研究中,上調(diào)miR-451a可增加阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達(dá)。mTOR信號通路有上游信號分子、下游信號蛋白以及mTOR復(fù)合體構(gòu)成,p70s6k是mTOR信號通路底物,mTOR信號通路與心臟疾病發(fā)生密切相關(guān)[19]。研究表明,mTOR信號通路在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)降低,通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與心肌損傷[20]。本研究結(jié)果顯示,加入mTOR信號通路抑制劑逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-451a對阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響,提示miR-451a通過調(diào)控mTOR信號通路影響阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述,上調(diào)miR-451a可抑制阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和自噬,其作用機制可能與mTOR信號通路有關(guān)。