慢性子宮內(nèi)膜炎宮腔菌群與不同妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究

謝毅,陳晴,胡啟彩,魏蔚霞

慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis,CE) 是子宮內(nèi)膜持續(xù)存在的隱匿性感染性炎癥,多數(shù)無特異臨床癥狀,主要與不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗相關(guān)[1]?？股刂委熆商岣哌@類患者的臨床妊娠率及活產(chǎn)率[2-4],但由于宮腔是一個低微生物含量的器官,常規(guī)細菌培養(yǎng)很難鑒定CE的病原體。因此,既往觀念認(rèn)為子宮是無菌的器官,現(xiàn)階段CE的臨床診斷為有創(chuàng)性子宮內(nèi)膜病理檢查。但隨著二代測序(next-generation sequencing,NGS)的廣泛應(yīng)用,人們在子宮中檢測出了含量極低的細菌遺傳物質(zhì)。研究者也發(fā)現(xiàn)正常女性宮腔存在一定種類的細菌定植,且在不同生殖系統(tǒng)疾病中細菌的分布特點不同[5-7]。本研究旨在通過16S rRNA測序,篩選CE患者不同妊娠結(jié)局宮腔中差異性定植菌,以期為改善CE患者生殖預(yù)后提供診斷和治療的新思路。

1 資料來源與研究方法

1.1 資料來源

標(biāo)本來源于 2019年1月至2020年12月因“IVF-ET失敗、不孕癥及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)”于北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖外科行宮腔鏡手術(shù),術(shù)后病理診斷為CE的29例患者。納入標(biāo)準(zhǔn):① 不孕癥IVF-ET失敗(≥1次);② 自然流產(chǎn)(≥2次)。排除標(biāo)準(zhǔn):① 急性感染性疾病、糖尿病、心血管疾病、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病及精神類疾病;② 半年內(nèi)接受過避孕藥或者類固醇激素類藥物治療;③ 近3個月內(nèi)全身及陰道抗生素用藥史;④ 男方因素導(dǎo)致的不孕。本研究經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過(NO:2019-064),所有入組患者充分知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 宮腔灌洗液取樣 手術(shù)室靜脈全麻生效后,常規(guī)外陰陰道消毒,用一次性無菌窺陰器擴開陰道,為避免陰道及宮頸分泌物對宮腔樣本的污染,采用自主研發(fā)的經(jīng)宮頸套管宮腔取樣器(專利號:ZL 2018 2 1945014.0,見圖1),于宮頸管置入一次性無菌外套管,宮腔取樣導(dǎo)管一端連接10 mL注射器(預(yù)注入3 mL無菌生理鹽水),取樣導(dǎo)管自外套管伸入宮腔,注入鹽水,停留1 min,順時針負壓吸引宮腔1周后,取樣導(dǎo)管退回套管內(nèi)一起取出,向無菌EP管內(nèi)注入宮腔灌洗液標(biāo)本。標(biāo)本置于-80 ℃儲存待測序。

注:1.外套管;2.取樣導(dǎo)管;21.取樣凹槽;22.卡子;3.注射器接口;4.注射器

1.2.2 宮腔沖洗液送至深圳市樂土基因公司進行16S rRNA V4-V5區(qū) PCR擴增及Ion torrent PGM平臺測序。

1.2.3 子宮內(nèi)膜組織病理檢查 病理組織切片行蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色標(biāo)記具有漿細胞形態(tài)學(xué)外觀的染色細胞后行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色,檢測漿細胞表面抗原Syndecan-1(CD138),并計數(shù)CD138染色的漿細胞數(shù)。

1.2.4 CE診斷標(biāo)準(zhǔn) ≥5個CD138陽性/高倍鏡視野(high-power fields,HPF)[8-9]

1.2.5 CE治療 CE患者于術(shù)后月經(jīng)第1天開始連續(xù)口服左氧氟沙星0.5 g qd+甲硝唑0.4 g qd共14 d。

1.2.6 治療后隨訪 隨訪CE患者抗炎治療后1年內(nèi)的妊娠結(jié)局,根據(jù)隨訪結(jié)果分為妊娠組(gestation,G)和未妊娠組(non gestation,NG)。再回顧性分析G組和NG組16S rRNA數(shù)據(jù)庫測序結(jié)果,比較兩組未經(jīng)治療前的宮腔菌群定植差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

直至2021年8月14日所有患者抗炎治療后隨訪完畢,無隨訪丟失及資料不全患者。29例CE患者抗炎治療后,25例接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET),其中16例成功妊娠,9例未妊娠;4例自然備孕,均為妊娠病例;妊娠組中18例均足月活產(chǎn),2例發(fā)生胚胎停育(分別是孕8+2周、孕9+1周,予以清宮術(shù)),臨床妊娠率為68.97%(20/29),活產(chǎn)率為62.07%(18/29)。其中兩組年齡、BMI比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05),詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 CE患者宮腔細菌分布

在門水平上,29例CE患者宮腔內(nèi)檢測到的菌群由厚壁菌門、變形菌門以及豐度較低的放線菌門、藍藻菌門、擬桿菌門及其他細菌組成。屬水平上,CE患者宮腔內(nèi)檢測到乳桿菌、丙酸桿菌、葡萄球菌、不動桿菌等細菌定植,見圖2,彩插4。

2.3 兩組宮腔內(nèi)細菌分布

在門水平上,兩組細菌定植模式不同,G組宮腔內(nèi)細菌以變形菌門定植為主,而NG組以厚壁菌門為主要定植菌。見圖3,彩插4。

屬水平上,乳桿菌為兩組主要定植菌,但G組乳桿菌定植比例高于NG組(40.13% vs 39.91%),其余各細菌定植比例不同。見圖4,彩插4。

2.4 兩組宮腔內(nèi)菌群差異比較

屬水平上,NG組不動桿菌中位定植豐度高于G組(142.00 vs 16.50),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其余細菌分布比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

表2 G組與NG宮腔菌群屬水平中位定植豐度比較[M(Q1-Q3)]

3 討論

CE是一種癥狀不典型的宮腔感染性疾病,在NGS開展以前,微生物培養(yǎng)鑒定技術(shù)存在培養(yǎng)周期長、病原體檢出率低、污染等局限[4,10]。且子宮是一個低微生物含量的內(nèi)生殖器官,微生物培養(yǎng)在分析子宮微生物圖譜中面臨巨大挑戰(zhàn)?；诜肿拥奈⑸镨b定技術(shù)打破了微生物培養(yǎng)的局限性,為女性生殖道微生物鑒定提供了可能[5,10]。

目前越來越多研究開始關(guān)注CE患者宮腔菌群的分布,但是尚無研究重點關(guān)注宮腔菌群的分布特點是否會影響其妊娠結(jié)局。本研究通過16S rRNA測序分析了29例CE患者的宮腔液標(biāo)本,回顧性分析CE患者抗炎治療前宮腔菌群的分布特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌、甲基桿菌-原單胞菌、丙酸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌、不動桿菌、普雷沃菌、鏈球菌等細菌定植于這類患者宮腔。結(jié)果與本研究團隊既往研究[5]及Wang等[11]研究結(jié)果相符,這表明CE患者宮腔內(nèi)存在多樣性的細菌群落,并非無菌器官或存在單一的細菌定植。

本研究根據(jù)不同的妊娠結(jié)局,初步探討宮腔細菌群落分布差異對CE患者妊娠結(jié)局的影響。結(jié)果表明乳桿菌是CE患者宮腔主要定植菌,G組乳桿菌定植比高于NG組患者。Kyono等[12]在一項采用單鞘管取樣器分析不孕癥患者宮腔定植菌對妊娠結(jié)局影響的研究中發(fā)現(xiàn)乳桿菌優(yōu)勢定植的患者妊娠結(jié)局優(yōu)于定植比例低的女性,與本研究結(jié)果一致。這可能與乳桿菌代謝產(chǎn)生乳酸及過氧化氫抑制、調(diào)節(jié)宮腔內(nèi)環(huán)境、調(diào)控其他非乳桿菌的定植、代謝維持宮腔微生物平衡有關(guān)[13-14]。但乳桿菌種水平的分布差異對女性生殖健康的影響有待進一步研究。

此外本研究還發(fā)現(xiàn),NG組宮腔不動桿菌中位定植豐度高于G組患者,表明不動桿菌高豐度定植可能是妊娠的不利因素。盡管其它細菌的定植差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但G組宮腔細菌定植模式與NG組不同,宮腔細菌的定植紊亂可能改變子宮內(nèi)膜容受性而影響胚胎著床。但鑒于取樣的有創(chuàng)性,本研究未對患者治療后的宮腔再次取樣分析其菌群分布特點,比較治療前后宮腔菌群的變化。研究更為微創(chuàng)甚至無創(chuàng)的取樣器,比較CE患者治療前后宮腔細菌分布差異及前瞻性隨訪其妊娠結(jié)局仍需進一步的臨床研究。

總之,CE患者宮腔存在復(fù)雜的微生物細菌群落定植,乳桿菌是其宮腔主要菌群,不動桿菌豐度的升高可能與這類患者的不良妊娠結(jié)局相關(guān)。針對不動桿菌的規(guī)范抗感染治療可能在一定程度上改善CE患者生殖預(yù)后。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。