HPV E6/E7在自噬調(diào)控中的作用機制研究進(jìn)展

楊二琴,黨曉慶,王志蓮

自噬在病毒感染的反應(yīng)中調(diào)節(jié)細(xì)胞命運[1],在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。大量證據(jù)表明,自噬不僅對氧化應(yīng)激、DNA損傷、缺氧、營養(yǎng)缺乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及外源生物或藥物的暴露做出一系列適應(yīng)性反應(yīng),以維持體內(nèi)平衡,而且還參與了人類疾病的發(fā)展,包括癌癥、腦卒中、神經(jīng)退行性疾病等[3-5]。在鱗狀細(xì)胞癌癌變發(fā)生早期,人乳頭瘤病毒E6/E7蛋白(human papillomavirus E6/E7 protein,HPV E6/E7)可抑制自噬,而在后期E6/E7可重新激活自噬[3],E6/E7可通過多條途徑使自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II減少和P62積累,來阻止自噬溶酶體的降解,從而抑制自噬[6]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與HPV密切相關(guān),為探討HPV E6/E7在自噬調(diào)控中的作用,為宮頸癌等HPV相關(guān)疾病的診斷及靶向治療提供一定的思路,本文將對HPV E6/E7在自噬調(diào)控中的機制展開綜述。

1 E6/E7通過視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白p53、pRb調(diào)控自噬

研究表明,p53可通過激活參與啟動和形成自噬小體的關(guān)鍵基因蛋白ULK 1、ATG7以及DRAM觸發(fā)自噬,還可通過激活A(yù)MPK激活子1和激活子2等基因來觸發(fā)自噬[7-8]。HPV E6/E7可以降解p53和pRb,從而調(diào)控自噬。HPV E6可引起p53降解,使p53功能喪失,從而導(dǎo)致自噬下調(diào)。高危型HPV(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)E7可降解pRb,同時釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F,轉(zhuǎn)錄因子E2F可以誘導(dǎo)LC3、ULK1、ATG5和DRAM的轉(zhuǎn)錄[9],導(dǎo)致自噬的上調(diào)?？傊?HR-HPV E6可以降解p53,下調(diào)自噬,E7可降解pRb,上調(diào)自噬。

2 E6/E7通過PI3K-AKT-mTOR通路調(diào)控自噬

E6/E7可激活并維持PI3K-AKT-TOR通路來抑制自噬。HPV16 E6/E7與表皮生長因子受體(EGFR)作用可激活PIK3CA/PI3K-AKT-mTOR軸,從而抑制自噬,HPV E6的異位表達(dá)通過抑制AKT-mTOR和MAPK/ERK-mTOR通路誘導(dǎo)自噬[10]。HPV16 E7蛋白可與蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的亞基結(jié)合,阻止PP2A與磷酸化Akt(p-Akt)的相互作用并保持其活性,E6也可以激活A(yù)kt,從而維持PI3K-AKT-mTOR通路來抑制自噬,E6還可與TSC2結(jié)合,導(dǎo)致其降解并刺激mTORC1[11-12],而磷酸化的mTORC1可以抑制自噬[13]。

3 E7通過調(diào)節(jié)beclin-1調(diào)節(jié)因子1(AMBRA1)調(diào)控自噬

E7通過競爭性結(jié)合AMBRA1及促進(jìn)AMBRA1降解抑制自噬。與HPV陰性腫瘤相比,AMBRA1的表達(dá)和細(xì)胞自噬水平在HPV陽性腫瘤中均降低,這說明AMBRA1可能對細(xì)胞自噬有調(diào)控作用[14]。beclin-1是促自噬PIK3C3/VPS34復(fù)合物的一種成分,AMBRA1的中心區(qū)域與beclin-1結(jié)合,從而促進(jìn)自噬,HPV16 E7以不同于AMBRA1結(jié)合beclin-1的方式直接結(jié)合于AMBRA1[15],HPV16 E7通過表達(dá)降低了AMBRA1與beclin-1的相互作用,這表明HPV16 E7和beclin-1在競爭AMBRA1蛋白上的相同結(jié)合區(qū)域。此外,HPV16 E7可以由鈣蛋白酶依賴性方式介導(dǎo)AMBRA1的降解,從而抑制自噬。有研究證明鈣蛋白酶2(CAPN2)通過降解兩種自噬關(guān)鍵蛋白ATG3和ATG7來抑制自噬[16],該研究發(fā)現(xiàn)CAPN2與AMBRA1相互作用,而HPV16 E7表達(dá)增加了AMBRA1-CAPN2相互作用,這表明AMBRA1降解是通過CAPN2觸發(fā)的[16]?？傊?HPV E7與AMBRA1相互作用、競爭其與beclin-1結(jié)合并觸發(fā)其鈣蛋白酶依賴性降解的能力來抑制自噬。

4 E6/E7直接調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白調(diào)控自噬

E6可以直接上調(diào)自噬相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)促進(jìn)自噬,E7可以直接上調(diào)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)自噬。Tingting等[17]發(fā)現(xiàn),HR-HPV E6/E7通過調(diào)節(jié)SiHa和Caski細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白水平可以直接激活自噬,HPV16 E6可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)參與自噬小體形成和運輸?shù)腁TG9蛋白和參與自噬小體-溶酶體融合的LAMP-1,HPV16 E6對HEK293細(xì)胞中的Atg9B和LAMP1的轉(zhuǎn)錄具有正調(diào)控作用,當(dāng)HPV16 E6過度表達(dá)時,Atg9B和LAMP1-mRNA均增加。另有研究表明,與對照細(xì)胞相比,在表達(dá)E6的細(xì)胞中,催化ATG12-AT5組裝的ATG10酶表達(dá)上調(diào),自噬標(biāo)記物Beclin-1和LC3-II增加,而P62保持較低水平,這表明E6對自噬有誘導(dǎo)作用[10]。HPV16 E7可以直接與ATG9和LAMP-1結(jié)合,并可促進(jìn)ATG9B和LAMP1的表達(dá),通過免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)HPV16 E7與Atg9B相互作用,而不與LAMP1相互作用,HPV16 E7和Atg9B之間的相互作用促進(jìn)了自噬溶酶體的形成和降解,從而促進(jìn)自噬[17]。據(jù)報道,在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織中,HPV16 E6/E7隨著病變級別的升高表達(dá)增加,而ATG12表達(dá)水平隨著病變級別的升高反而呈下降趨勢[18-19]。ATG12在HPV陰性的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)缺失,可以減少頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的缺氧狀態(tài),通過碳源及谷氨酰胺依賴途徑維持缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的生存,并改善腫瘤預(yù)后[20]。因此,HPV E6/E7可能通過上調(diào)ATG12的表達(dá)來調(diào)節(jié)自噬。

5 E6/E7通過調(diào)節(jié)衰老基因表達(dá)調(diào)控自噬

E6/E7可抑制衰老相關(guān)基因表達(dá)從而抑制自噬。E6/E7的耗竭會誘導(dǎo)W12宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞自噬,同時觀察到W12宮頸角質(zhì)在轉(zhuǎn)染E7敲低模型后,衰老標(biāo)記物β-半乳糖苷酶在所有W12宮頸角質(zhì)系列受試細(xì)胞中的平均表達(dá)率較對照組顯著增高[21],這說明自噬的誘導(dǎo)與細(xì)胞衰老有關(guān)。實驗表明,E6/E7的缺失可以誘導(dǎo)衰老表型、衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)以及固有免疫應(yīng)答上調(diào),從而引起自噬基因上調(diào),促進(jìn)自噬[21]。這與衰老和先天免疫反應(yīng)途徑的富集有關(guān),HPV E6/E7缺失后,SASP上調(diào)[22],該基因可以招募能夠清除衰老細(xì)胞的先天免疫細(xì)胞,上調(diào)SASP相關(guān)mRNA(如IGFBP3和SERPINE1)以及與先天免疫反應(yīng)相關(guān)的因素,包括細(xì)胞因子(如IL1β)和干擾素刺激基因[23],從而促進(jìn)自噬。

6 E6/E7通過泛素蛋白酶體系調(diào)節(jié)自噬

E6/E7通過抑制泛素蛋白酶體系來上調(diào)自噬。E6和E7都是蛋白酶體介導(dǎo)的降解目標(biāo),E6募集泛素連接酶(E6-associated protein,E6AP)靶向介導(dǎo)p53進(jìn)行蛋白酶體介導(dǎo)的降解,E6可以類似地由E6AP靶向介導(dǎo)進(jìn)行自身降解[24]。E7募集ZER1/CUL2-RING泛素連接酶復(fù)合物以促進(jìn)pRb的降解,E7也通過SOCS1接頭復(fù)合物和/或SCF(Skp-Cullin-F box)泛素連接酶復(fù)合物(包含Cullin1和Skp2)來介導(dǎo)靶向自身降解[25-26]。E6和E7分別是去泛素酶(DUB) USP11和USP15的靶標(biāo),并且E6和E7與涉及泛素化和去泛素化的因子相關(guān)[27-28]。蛋白酶抑制劑降低靶向這些病毒癌蛋白DUB的水平或活性,從而導(dǎo)致E6和E7泛素化增加,增加其降解。通過觸發(fā)蛋白酶抑制劑,可以逆轉(zhuǎn)HPV16驅(qū)動的細(xì)胞自噬標(biāo)志物的積累,從而誘導(dǎo)自噬[29]。因此,E6/E7可觸發(fā)蛋白酶抑制劑來抑制泛素蛋白酶體系從而誘導(dǎo)自噬。

同時,蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)的自噬對控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激很重要,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激又可以激活自噬。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不能正確折疊時,錯誤折疊的蛋白和未折疊蛋白可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解通路(ERAD)降解,如果未折疊蛋白持續(xù)積累,細(xì)胞會激活自噬。一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)開始并進(jìn)展,細(xì)胞可以嘗試通過激活自噬途徑來降解累積的蛋白質(zhì)從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[30]。因此,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可激活自噬。

7 E6/E7通過調(diào)節(jié)線粒體損傷調(diào)控自噬

CararoLopes等[31]研究提示,在HRasG12V活性下的HPV E6/E7角質(zhì)形成細(xì)胞中,HPV E6/E7蛋白降解p53和pRb的活性被抑制,但高HRasG12V活性下啟動了一系列應(yīng)激,導(dǎo)致有絲分裂信號的不協(xié)調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)制損傷和氧化應(yīng)激,兩者都導(dǎo)致了DNA損傷,進(jìn)而引起線粒體損傷。此時,為清除受損線粒體、減少氧化應(yīng)激,E6/E7會激活自噬。因此,E6/E7可能通過調(diào)節(jié)線粒體損傷來調(diào)控自噬,自噬可能通過調(diào)節(jié)線粒體損傷來發(fā)揮作用。

HPV E7通過CerS1/神經(jīng)酰胺依賴的線粒體自噬誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。通過HPV E7信號通路,以線粒體為靶點的c18神經(jīng)酰胺介導(dǎo)線粒體自噬,HPV E7抑制Rb信號是調(diào)控神經(jīng)酰胺依賴性致死線粒體自噬的關(guān)鍵,HPV E7神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的線粒體自噬是由E2F5-Drp1復(fù)合物誘導(dǎo)的,HPV E7通過抑制Rb激活E2F5,增強了神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的線粒體自噬,HPV16 E7通過激活細(xì)胞質(zhì)E2F5功能,選擇性介導(dǎo)HNSCC細(xì)胞死亡,瞄準(zhǔn)Rb激活的E2F5,使其結(jié)合并穩(wěn)定Drp1寡聚體作為支架分子,誘導(dǎo)Drp1線粒體轉(zhuǎn)位和線粒體分裂,導(dǎo)致含有LC3的自噬體的神經(jīng)酰胺募集和隨后的線粒體自噬[32]。

8 總結(jié)與展望

E6/E7調(diào)控自噬存在兩面性。一方面,自噬使得腫瘤細(xì)胞能夠耐受生存腫瘤微環(huán)境的應(yīng)激(缺氧、高能量需求等)和毒性治療。另一方面,自噬對于減少可促進(jìn)腫瘤發(fā)生的基因組損傷非常重要。HPV E6/E7對自噬的調(diào)節(jié)表現(xiàn)為既能上調(diào)又能抑制自噬,可能是HR-HPV和LR-HPV E6/E7對自噬的影響存在差別以及時間順序依賴性的表現(xiàn)不同。有研究表明HR-HPV和LR-HPV都可以調(diào)節(jié)自噬,在病毒感染過程中,早期階段HR-HPV E6/E7抑制自噬,以阻止病毒的清除,在后期階段,HR-HPV E6/E7蛋白為滿足與癌細(xì)胞代謝相關(guān)的需求,在癌癥發(fā)展和維持過程中可能會重新激活自噬[33-34]。關(guān)于LR-HPV,有研究者認(rèn)為在病毒感染過程可以激活自噬,以增加細(xì)胞能量需求或消除未折疊和錯誤折疊的宿主蛋白。與來自HR-HPV的E6相反,來自LR-HPV11的E6通過誘導(dǎo)Akt和mTORC1蛋白去磷酸化而失活,此外,來自HPV11的E6促進(jìn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的去磷酸化和失活,從而下調(diào)mTORC1水平,促進(jìn)自噬誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明,LR-HPV中的E6通過AKT-mTOR和ERK-mTOR的下調(diào)促進(jìn)自噬[10]。

HPV E6/E7對自噬的調(diào)節(jié)表現(xiàn)出兩面性,這也可能是HPV E6/E7功能拮抗的表現(xiàn)。研究表明,HR-HPV的E6和E7可以不同地調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激(OS),其中E6可誘導(dǎo)OS和DNA損傷,而E7可以保護(hù)OS,減少氧化環(huán)境[35-36]。在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中,E6促進(jìn)EMT,而E7降低EMT[37],當(dāng)兩種蛋白質(zhì)都過表達(dá)時,它們的作用被中和[35-36],因此HPV E6/E7對自噬調(diào)節(jié)的表現(xiàn)受E6/E7功能相對強弱的影響而表現(xiàn)為既能上調(diào)自噬又能抑制自噬。

目前對HPV E6/E7在自噬過程中的作用相關(guān)研究還待深入,不同調(diào)節(jié)通路之間是否存在共同部分及如何相互影響需進(jìn)一步明確。HR-HPV與LR-HPV E6/E7表達(dá)差異及生物學(xué)行為差異可能導(dǎo)致了對自噬調(diào)節(jié)的差異。E6/E7對自噬過程中的不同環(huán)節(jié)均有影響,E6/E7對自噬具體的調(diào)節(jié)方式、調(diào)節(jié)通路還需更多的研究來明確,HPV E6/E7在自噬中的作用到底如何,以及這兩種蛋白發(fā)揮激活與抑制作用的具體環(huán)境及條件,需要進(jìn)一步研究探討。