外周血miR-146a與miR-146b表達在兒童抗NMDAR腦炎診斷中的臨床意義

羅蘭,陳能輝,吉明明,黃木蘭,潘章穎

(贛州市婦幼保健院,江西 贛州 341000)

自身免疫性腦炎(autoimmune encephalitis,AE)是一種由免疫系統(tǒng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原的異常免疫反應(yīng)引起的炎癥性疾病;該病特點為急性或亞急性起病,臨床主要表現(xiàn)為異常的精神行為、認知功能障礙等。它的病程很長,很容易復發(fā),無特異性好發(fā)人群有些兒童可能有嚴重殘疾甚至死亡,而且死亡率高達80%,早期診斷和早期干預(yù)能有效改善預(yù)后[1],常用腦脊液、影像學MRI、腦電圖檢查。有文章指出,AE再鬧嚴重的比例為21%,其中抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)腦炎在AE中的占比約為80%,[2]現(xiàn)居腦炎第3位。其在腦血管內(nèi)廣泛分布,作為興奮性谷氨酸鹽神經(jīng)遞質(zhì)的受體,與突觸可塑性、神經(jīng)元突觸傳遞、記憶力、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等方面密切相關(guān)。也就是說,抗NMDA受體腦炎就是機體產(chǎn)生了針對NMDA受體的抗體,擾亂了其正常的生理功能,從而在臨床上表現(xiàn)出腦炎的癥狀。該病會對大腦以及大腦邊緣系統(tǒng)都會造成不同程度的損傷,其中該病最常見的類型是抗NMDAR腦炎,會存在精神行為異常、記憶力下降及語言障礙等臨床癥狀,部分患者還會存在反復抽搐[3]。目前該病的治療主要分為一線和二線免疫治療,治療安全性較好,但是該病早期癥狀復雜多樣,所以臨床漏診率較高[4]。臨床上根據(jù)該病病情的不同程度分為了前驅(qū)期、精神癥狀及癲癇發(fā)作期、無反應(yīng)期、不自主運動期、恢復期,但是某些患兒也難以明確界定分期。miR-146a、miR-146b可參與免疫反應(yīng)等,可能與病毒性腦炎的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5]。如果病毒性腦炎發(fā)病,就會直接導致存在于腦血管中的外皮細胞的T細胞和初級T細胞迅速減少,而miR-146a、miR-146b水平升高,將會致使機體免疫調(diào)節(jié)能力失去平衡進而影響到血-腦屏障的保護功能和血液中T淋巴細胞的免疫功能。miR-146a和miR-146b表達水平與機體的免疫功能呈現(xiàn)負相關(guān),可用于反映機體的免疫功能。病毒感染后,機體內(nèi)miR-146a、miR-146b水平過高可促進淋巴細胞增殖和生長,導致病情加重,并且二者還可引發(fā)代償性炎性反應(yīng),進而影響免疫應(yīng)答反應(yīng),并使得患者預(yù)后受到影響,進而病情更加嚴重。因此。多項研究認為人類的大多數(shù)疾病與外周血中miR-146a、miR-146b有著緊密關(guān)聯(lián),所以miR-146a、miR-146b可以作為反映機體的炎性反應(yīng)和免疫功能的依據(jù),可能與病毒性腦炎的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),但是相關(guān)研究較少[6-7]。但是該病對家庭及社會的影響較大,所以早發(fā)現(xiàn)早治療顯得尤為重要。因此本研究重點分析miR-146a和miR-146b在兒童抗NMDAR腦炎診斷中臨床意義,探討其潛在診斷與預(yù)后新型標志物的可能性和必要性,為兒童NMDAR腦炎診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取30例確診為NMDAR腦炎兒童作為研究對象。其中男19例,女11例;年齡平均(6.47±1.43)歲。納入標準:①臨床表現(xiàn)與體征符合《兒童自身免疫性腦炎診斷指南》的診斷標準[8];②初診患兒;③年齡在2-10歲間的兒童;④予以對癥治療,且有完整的資料信息。⑤血清或者腦脊液抗NMDAR抗體呈陽性。排除標準:①伴有其他自身免疫抗體陽性腦炎;②合并有代謝性或中毒性的腦部疾病者;③合并有其他的神經(jīng)系統(tǒng)退化和遺傳疾病;④家屬或監(jiān)護人不同意參與本研究觀察者。

1.2 方法

1.2.1 主要治療方案

①一線免疫治療:以大劑量激素沖擊聯(lián)合靜脈免疫球蛋白(IVIg)為主;②二線免疫治療:采用利妥昔單抗治療;③三是長程的免疫維持治療:對于反復發(fā)作以及經(jīng)一線治療療效欠佳的患兒。

1.2.2 標本獲取與預(yù)處理方法

分別于患兒入院診斷時和穩(wěn)定康復出院前采集空腹靜脈血和腦脊液標本,靜脈血經(jīng)2000—2500 rpm離心1—2 min,提取上層透明部分,采用無菌無酶500l塑料EP管分裝,將上述標本保存在-20℃冰箱中,備檢測。

1.2.3 RT-qPCR檢測方法

采用血清/腦脊液microRNA提取試劑盒提取miRNA,按照說明書嚴格操作,首先進行miRNA反轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄為cDNA;采用實時RT-qPCR檢測miR-146a和miR-146b相對表達量。

1.2.4 臨床療效觀察

預(yù)后評估采用改良Rankin量表(mRS)評價患者神經(jīng)功能,0～2分為預(yù)后良好,3～6分為預(yù)后不良或死亡。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 觀察兩組患兒臨床資料:兩組患兒臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義,P>0.05,見表1。

表1 兩組患兒臨床資料比較

2.2 觀察兩組患兒miR-146a水平:入院時兩組患兒外周血和腦脊液miR-146a表達差異無統(tǒng)計學意義,P>0.05;出院前觀察組患兒外周血和腦脊液miR-146a表達較低,P<0.05,見表2。

表2 兩組患兒miR-146a表達比較

2.3 觀察兩組患兒miR-146b水平:入院時兩組患兒外周血和腦脊液miR-146b表達差異無統(tǒng)計學意義,P>0.05;出院前觀察組患兒外周血和腦脊液miR-146b表達較低,P<0.05,見表3。

表3 兩組患兒miR-146b表達比較

2.4 觀察兩組患兒臨床療效:觀察組療效較對照組較好,P<0.05,見表4。

表4 兩組臨床療效比較

3 討論

自身免疫性腦炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病,主要與自身免疫反應(yīng)有關(guān),中樞系統(tǒng)自身抗原被誤認為外來抗原受到攻擊,產(chǎn)生自身特異性抗體,引起的腦炎,有學者認為細胞表面抗原抗體主要由體液免疫介導,細胞內(nèi)抗原抗體主要由細胞免疫介導,但也有學者認為補體亦參與致病過程,副腫瘤性自身免疫性腦炎發(fā)病原因可能是腫瘤組織表達的抗原與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元表達的抗原相似,而腫瘤抗原激發(fā)了機體的免疫應(yīng)答保護機制,導致攻擊腫瘤抗原的抗體與神經(jīng)系統(tǒng)表達抗原的神經(jīng)元發(fā)生反應(yīng),損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng),產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。前驅(qū)期癥狀臨床表現(xiàn)類似于病毒感染,出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、乏力、嘔吐、腹瀉等癥狀。并發(fā)癥:嗜睡:主要表現(xiàn)為嗜睡、睡眠覺醒周期紊亂和白天過度睡眠等。意識障礙:癥狀嚴重者一般會出現(xiàn)意識障礙、休克,甚至會出現(xiàn)休克等癥狀。通氣不足:較常見,患者會表現(xiàn)為通氣不足,呼吸不上來,呼吸不暢等癥狀,有些患者甚至需要呼吸機輔助呼吸。

自身免疫性腦炎是臨床上十分常見的一類腦膜炎癥,發(fā)病原因是當機體的免疫力低下時,病毒會侵犯人的神經(jīng),對其組織及細胞造成傷害,致使機體釋放炎性因子,而兒童是這類疾病發(fā)病最高的人群[9]。該病發(fā)病后會出現(xiàn)腦膜受激惹后存在的部分臨床癥狀,其最常見的首發(fā)癥狀是精神行為異常,甚至會出現(xiàn)癲癇、驚厥。病情發(fā)展迅速,如果不及時治療,很容易導致殘疾和死亡[10]。臨床上指出腦脊液病毒分離是病毒性腦炎診斷金標準,但耗時較長、對實驗室條件要求高,臨床的應(yīng)用受到了一定的限制,會延誤病情,所以尋找一類快速便捷準確的實驗室檢查指標對該病的診斷和評估十分重要。

miRNA是一類可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的小分子非編碼RNA,具有廣泛的生物學效應(yīng)。miR-146a、miR-146b與人類多種疾病密切相關(guān),但是相關(guān)研究不多,因此本研究為探討其潛在診斷做出以下探討。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的,隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體,通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA,并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。具有增強細胞增值和分化,新陳代謝,癌癥以及自身免疫等,因此在大多數(shù)生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。截至目前為止miRNA的生物學功能只有一小部分得到了闡明。生命過程中發(fā)育、疾病與這些miRNA調(diào)節(jié)細胞生長,組織分化有關(guān)。通過對基因組上miRNA的位點分析,顯示其在發(fā)育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明:在血細胞分化,細胞發(fā)育和凋亡,大腦組織形成,神經(jīng)元極性,同源異形盒基因調(diào)節(jié),胰島素分泌,心臟功能發(fā)生,胚胎后期發(fā)育等過程中miRNA發(fā)揮著關(guān)鍵作用。另外許多神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA被研究人員發(fā)現(xiàn)其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯,表明其在大腦皮層的培養(yǎng)中受到時序調(diào)節(jié)。對于新的基因的分析,miRNA新的發(fā)現(xiàn)可能會促進人類對癌癥等疾病發(fā)病機制的理解并參與器官形成、胚胎發(fā)育和生長的調(diào)節(jié)因子。miR-146a在固有免疫TLR信號通路中起到負調(diào)的作用,是因為在淋巴細胞中,miR-146a可以抑制脂多糖誘導NO生成。miRNA沉默或降解目標mRNA還可以通過互補結(jié)合對免疫信號傳導起到反饋調(diào)節(jié)作用。miRNA調(diào)控多種機體生物學功能,與其對應(yīng)的靶基因結(jié)合,轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)節(jié)基因表達,但是,與靶基因結(jié)合位點及其作用方式、Dicer酶剪切位點等[13]因素都會影響miRNA對靶基因的調(diào)控。研究人員發(fā)現(xiàn)幾個甚至幾百個靶基因會被一種或幾種miRNA控制,但是一些miRNA也會同時調(diào)控[14]部分靶基因。近幾年來曾經(jīng)有多項研究[15]表明,包含淋巴細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞在內(nèi)等多種免疫細胞主要在機體抵抗病原體時受到侵襲,病毒感染、及時清理突變細胞以及維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。當炎癥刺激機體時,病毒性腦炎機體中的單核細胞、中性粒細胞以及眾多免疫細胞中的miR-146a、miR-146b被激活,會加快促進和誘導炎性反應(yīng),還可影響機體免疫[16]抑制核因子(NF)-κB的活化。由于宿主細胞可受到感染刺激產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),加重病情[17],因此其水平與病情相關(guān)而且miR-146a、miR-146b可引起機體代償性炎性反應(yīng)[18]。研究結(jié)論表明,觀察組出院前患兒外周血和腦脊液miR-146a、miR-146b水平表達均優(yōu)于入院時,提示病毒性腦炎患兒外周血miR-146a、miR-146b表達水平升高。

在本文研究中,首先對兩組患兒的臨床資料進行了比較,無統(tǒng)計學意義的結(jié)果說明了兩組患兒具有可比性,且結(jié)果準確性較高。研究認為腦脊液是一種重要的新型機制,它不僅僅可以包裹氨基酸,還可以包裹miRNA,在各種生物條件下形成并釋放它們,然后進行細胞調(diào)控[19-20]。因此本研究對腦脊液和外周血中miR-146a與miR-146b的表達進行檢測分析其診斷意義。結(jié)果顯示入院時兩組患兒外周血和腦脊液兩種miRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義,出院前觀察組患兒外周血和腦脊液miR-146a、miR-146b表達較低。這說明當機體受到病毒侵害,釋放炎性因子時,miR-146a、miR-146b會被激活,誘發(fā)免疫應(yīng)激,從而參與抗NMDAR腦炎的發(fā)生,說明其會誘導和促進炎性反應(yīng)?？筃MDAR抗體腦炎患兒在幾天到幾周內(nèi)分階段發(fā)展,通常從病毒前驅(qū)感染癥狀開始,大約50%的抗NMDAR抗體腦炎患兒有病毒感染前驅(qū)癥狀,包括發(fā)熱、頭痛、胃腸道癥狀或上呼吸道感染癥狀此后可表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀,如癲癇發(fā)作或運動障礙,而并不是成年人常見的精神癥狀。此外,本研究還針對患兒兩種治療方式的療效進行分析,結(jié)果顯示觀察組療效較對照組較好,說明聯(lián)合利妥昔單抗治療效果優(yōu)于糖皮質(zhì)激素和免疫球蛋白治療。而出院前觀察組miR-146a、miR-146b表達比對照組更低,因此更進一步說明miR-146a與miR-146b可以反映機體的炎性反應(yīng)情況和免疫功能,說明miR-146a與miR-146b是該病潛在標志物。還有研究指出該病機體內(nèi)的白細淋巴細胞、巨噬等各種細胞在干預(yù)下產(chǎn)生炎性介質(zhì),進而會進一步使疾病更加嚴重,認為miR-146a和miR-146b會引起代償性炎癥反應(yīng),可以監(jiān)測該病病情[21-22]。但本研究并未針對病情進行分析。雖然抗NMDA受體腦炎治療的效果較好,但是通常會復發(fā),需要長期隨訪。另外,自身免疫性腦炎容易并發(fā)其他自身免疫性疾病,需要在患者成年后注意。此外,臨床中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自身免疫性腦炎臨床癥狀控制后才發(fā)現(xiàn)患者合并腫瘤的情況,因此自身免疫性腦炎患者需要遵從醫(yī)囑,定期隨訪。

綜上所述,兒童抗NMDAR腦炎miR-146a與miR-146b表達較高,說明兩者是該病的潛在生物標志物,臨床上可以通過監(jiān)測其表達為臨床防治提高一定的措施,但是其作為參考指標,對該病的臨床價值還需進一步分析。外周血miR-146a、miR-146b參與NMDAR腦炎的發(fā)病及發(fā)展過程,可以作為反映NMDAR腦炎患兒病情和機體免疫功能的重要指標,且二者水平越高患兒預(yù)后不良的風險很可能也越高。本研究的不足在于病例少等限制所選樣本量稍少、受病毒類型檢驗難度大,或許對結(jié)果的準確性造成一定的偏移,也并未分析其與疾病病情的相關(guān)性,后續(xù)還需進一步研究并加大樣本量。