廈門地區(qū)女性人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)分析

羅瑞晨,孫琦,劉坤,許惠娟,魯華東,侯君,許建芳

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院 病理科 廈門市惡性腫瘤綜合治療臨床醫(yī)學(xué)研究中心,福建 廈門 361015)

目前宮頸癌在全球女性中的發(fā)病率和死亡率居第四位,在我國(guó),宮頸癌位居女性癌癥發(fā)病譜第6位[1]。國(guó)家衛(wèi)健委在《加速消除宮頸癌行動(dòng)計(jì)劃(2023—2030年)》中指出[2],到2025年,試點(diǎn)推廣適齡女孩HPV疫苗接種服務(wù);適齡婦女宮頸癌篩查率達(dá)到50%;宮頸癌及癌前病變患者治療率達(dá)到90%。宮頸癌是可以通過疫苗接種、早期篩查等措施有效預(yù)防的惡性腫瘤。目前疫苗已作為預(yù)防宮頸癌及癌前病變的首選[3],然而疫苗的接種效果與人乳頭瘤病毒(HPV)感染的流行程度及型別分布有著重要的關(guān)系。人乳頭瘤病毒是一種嗜粘膜和皮膚上皮性病毒,是導(dǎo)致宮頸上皮增生和宮頸癌的主要因素。本文通過對(duì)廈門地區(qū)18573名門診及體檢人群的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV分型檢測(cè),以期了解廈門地區(qū)HPV型別分布情況和特征,為宮頸癌防治和疫苗的研發(fā)提供流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2021年7月至2023年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院門診和體檢進(jìn)行HPV分型檢測(cè)的女性患者作為研究對(duì)象,共納入18573例受檢者,年齡17—87(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)歲。按年齡分7組:≤20、>20～30、>30～40、>40～50、>50～60、>60～70、>70～87歲組。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

避開生理期,采樣前3天內(nèi)未進(jìn)行陰道內(nèi)用藥、未進(jìn)行陰道沖洗、24h內(nèi)未發(fā)生性行為等。擴(kuò)陰器充分暴露宮頸,無菌棉試紙擦去宮口過多的分泌物,將一次性宮頸刷置于宮頸口,單方向旋轉(zhuǎn)4—6圈,確保刷頭已取得足夠的上皮樣本后將刷頭部分折斷浸入宮頸樣本保存液中,及時(shí)送檢并在1周內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)試劑

采用上海透景生物技術(shù)公司的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒(流式熒光雜交法)按照說明書進(jìn)行核酸的提取、宮頸脫落細(xì)胞人乳頭瘤病毒的定性檢測(cè)?？煞中蜋z測(cè)27種型別,具體包括17種高危型(16、26、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82型)和10種低危型(6、11、40、42、43、44、55、61、81、83型)[4]。

1.2.3 PCR 樣本處理

裝有宮頸刷樣品的液基瓶充分振蕩混勻,取樣200ul于潔凈EP內(nèi),13000rpm離心5min,去上清后于EP管內(nèi)加入200μL已經(jīng)充分搖勻的核酸提取試劑,振蕩混勻后于100℃金屬浴中孵育15min后13000rpm轉(zhuǎn)離心5min,取5ul上清液用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系

每個(gè)PCR反應(yīng)的體系總體積為20.8μl,組成為:預(yù)混液 10.0μl、引物混合液 5.0μl、聚合酶 0.8μl及HPV核酸模板(樣品)5.0μl。

1.2.5 PCR擴(kuò)增體系

95℃ 5分鐘 1個(gè)循環(huán);95℃ 30秒,58℃ 30秒,72℃ 30秒 5個(gè)循環(huán);95℃ 30秒,55℃ 30秒,72℃ 30秒 35個(gè)循環(huán); 72℃ 3分鐘 1個(gè)循環(huán)。

1.2.6 雜交檢測(cè)

將微球雜交液試劑瓶倒置于渦旋儀上振蕩30s,使微球充分混懸在溶液中。每個(gè)雜交孔中加入混勻的微球雜交液試劑22μl,吸取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3μl,透明封口膜覆蓋封口雜交板后在PCR儀器內(nèi)進(jìn)行雜交程序。雜交程序在48℃孵育15分鐘步驟結(jié)束后小心將透明封口膜撕下,每孔快速加入鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μl。加完后將透明封口膜重新粘好,繼續(xù)在48℃下孵育15分鐘,再將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的多功能流式點(diǎn)陣儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 雜交程序

95℃ 變性5分鐘,48℃ 雜交30分鐘,48℃ 保溫。

1.2.8 結(jié)果判讀

標(biāo)本處理后配制PCR反應(yīng)體系后加入處理的樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后雜交檢測(cè)。陽性內(nèi)對(duì)照Globin的信號(hào)大于150,即代表整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功。當(dāng)陽性內(nèi)對(duì)照Globin信號(hào)大于150且HPV型別特異性探針信號(hào)大于150時(shí),則判斷該探針對(duì)應(yīng)的HPV型別為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV單一與多重感染的情況

4926份HPV陽性標(biāo)本中,總檢出率為26.52%(4926/18573),其中單一感染率占55.87%(2752/4926);多重感染率占44.13%(2174/4926)。高危型HPV感染率排在前5位的分別為HPV52(3.89%)、HPV53(2.19%)、HPV58(1.94%)、HPV39(1.54%)、HPV16(1.53%),其他高危型感染率從高到低型別依次為HPV59、51、56、18、66、68、33、31、82、45、35、26型;低危型HPV感染率排在前五位的分別為HPV61(1.79%)、HPV44(1.24%)、HPV81(1.23%)、HPV43(1.08%)、HPV55(0.96%),其他低危型感染率從高到低型別依次為HPV42、06、11、83、40。感染率最低的型別是HPV26型。其中HPV45、26、83、06、56、33型以多重感染為主,且以二重感染為主,其他型別以HPV52、16、42、59型為代表,以單一感染為主(圖1)。

圖1 18573例女性HPV型別分布情況

2.2 HPV不同亞型分布與多重感染分布情況

單一感染中以HPV52型為主,陽性感染率占65.70%,其次為HPV16型,陽性感染率占61.05%。在多重感染中以二重感染為主,占25.74%(1268/4926),最多合并6重感染。(表1)

表1 18573例女性HPV型別分布與多重感染分布情況

表2 18573例女性HPV陽性率與年齡分布的關(guān)系

2.3 各年齡段女性HPV陽性率情況

18573例女性受檢者,年齡最小為17歲,最大為87歲,按照年齡將受檢者分為7個(gè)不同年齡段,不同年齡段女性HPV感染率比較:≤20歲組感染率最高(56.10%),>40～50歲組感染率最低(20.52%),HPV陽性率從≤20歲組至>40～50歲組逐步降低,在>50～60歲組HPV感染陽性率又開始上升,至>60～70歲組感染率達(dá)到34.03%后又開始下降。各年齡組中HPV的陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.33,P<0.05)。合并感染兩種及以上亞型為多重感染,不同年齡段HPV陽性例數(shù)中,多重感染以≤20歲及>20～30歲年齡組為主(表3)。

表3 不同年齡段HPV陽性例數(shù)中單一感染和多重感染分布情況

2.4 不同年齡組HPV亞型分布情況

不同年齡組HPV感染亞型分布中,從≤20歲組到>60—70歲組都以HPV52型陽性率最高(表3)。其中>20—30組、>30—40組除HPV52型外,HPV52、53型的感染率也較高,而>60—70歲組HPV感染陽性率從高到低依次為HPV52、53、58型。>40—50歲組以HPV52、53型為主。在>70—87歲年齡組,陽性感染率以HPV58型為主,其次是HPV16、52型(表4)。

表4 廈門地區(qū)不同年齡組HPV感染亞型分布

3 討論

2020年,全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬,死亡人數(shù)約34.2萬,是影響全球女性健康的第四位高發(fā)癌癥[5]。我國(guó)宮頸癌新發(fā)病例約11萬人,死亡人數(shù)約5.9萬人,是我國(guó)女性的常見惡性腫瘤第六位高發(fā)癌癥[6-7]。

HPV是一種具有嗜皮膚性和黏膜性的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,目前已經(jīng)證實(shí)的HPV的型別有200多種,其中與女性的生殖道感染相關(guān)的有40余種[8-9]。HPV可以通過感染人體生殖器、皮膚粘膜等引起多種感染性疾病[10],導(dǎo)致多種良惡性腫瘤的發(fā)生。研究表明高危型與宮頸癌、肛門癌、陰莖癌等惡性腫瘤密切相關(guān),以宮頸癌最常見,低危型與外生殖器、肛周皮膚尖銳濕疣和低度宮頸上皮內(nèi)瘤等良性病變有關(guān)[11-12]。

本研究共納入18573例女性患者,檢出4926份HPV陽性標(biāo)本,總檢出率為26.52%,高于張玉鳳等人在2020年發(fā)表的對(duì)廈門地區(qū)女性高危型HPV分型檢測(cè)分析的研究數(shù)據(jù)[13]。其中單一感染率占陽性率的55.87%;多重感染率占陽性率44.13%,說明廈門地區(qū)女性HPV感染主要以單一型感染為主,與陳海明等人對(duì)廈門地區(qū)女性HPV感染的流行病學(xué)特征的結(jié)果相似[14],與zeng等人對(duì)中國(guó)HPV患病率的報(bào)道相一致[15];高危型HPV感染以HPV52、HPV53、HPV58、HPV39、HPV16型為主,低危型HPV以HPV61、HPV44、HPV81、HPV43、HPV55型為主,感染率最低的型別是HPV26型,與省內(nèi)其他地區(qū)HPV感染型別的報(bào)道感染型別大致相同[16-20]。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展和工業(yè)化、城鎮(zhèn)化進(jìn)程持續(xù)加快,居民生活環(huán)境與生活方式的改變,宮頸癌發(fā)病率持續(xù)增高并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì),平均年齡不斷下降。資料顯示,年齡特異性發(fā)病率隨年齡增加而顯著增加,特別是在25歲之后,在50—54歲達(dá)到峰值[21],此外也有研究顯示高危型HPV感染呈現(xiàn)雙峰分布,年齡感染峰值分布在17—24歲及40—44歲兩個(gè)年齡階段[22]。本研究結(jié)果顯示,廈門地區(qū)女性HPV檢出率最高的年齡段為≤20歲,其次為>20—30歲年齡段,且都以多重感染為主,亞型以HPV52型為主,HPV檢出率的年齡顯示出年輕化,可能與性生活年齡提前、正確衛(wèi)生保健知識(shí)普及缺乏有關(guān)[23];>40—50歲年齡組的感染率最低,且參與HPV檢測(cè)人員以30—50歲年齡段為主,可能與該年齡段女性衛(wèi)生保健意識(shí)及經(jīng)濟(jì)獨(dú)立有關(guān);在>60～70歲組HPV感染陽性率開始升高,該年齡段正處于女性絕經(jīng)期,甄彩紅的研究通過對(duì)圍絕經(jīng)期女性HPV的分型與感染研究結(jié)果也表明,絕經(jīng)后女性比絕經(jīng)前的女性高危型HPV的感染率高[24],原因可能與絕經(jīng)后女性的雌激素和免疫力水平降低,陰道微生物菌群失調(diào)從而缺乏消除HPV感染的潛在能力有關(guān)[25]。

綜上所述,廈門地區(qū)女性HPV感染以單一高危型為主,HPV52、16型多見,不同年齡段的HPV亞型分布不同,主要以HPV52型陽性感染為主。值得注意的是,雖然疫苗接種率在不斷提高,但30歲以下的HPV感染的女性占比仍然很大,陽性率較高,這表明目前廈門地區(qū)疫苗普及率還不高,同時(shí),可能存在著多種因素包括年輕人性生活年齡開始過早、多個(gè)性伴侶、性健康意識(shí)淡薄、免疫力及抵抗力水平低下以及不良的生活方式包括吸煙飲酒、作息不規(guī)律、缺乏鍛煉等[26]。應(yīng)加強(qiáng)本地區(qū)對(duì)宮頸癌、HPV及其疫苗的相關(guān)知識(shí),特別是≤20歲群體的生殖健康教育,并積極科普HPV疫苗,提高接種率,完善宮頸癌的基層預(yù)防。